대장암세포의 3차원 스페로이드 배양에서 프로바이오틱스의 세포없는 슈퍼네탄을 사용하여 세포 사멸 평가

요약

여기에서 방법은 유산균 세포 없는 상체 (LCFS)의 항암 효과를 이해하기 위하여 제시됩니다. 대장암 세포선은 3D 배양에서 LCFS로 치료할 때 세포 사망을 보여줍니다. 스퍼로이드를 생성하는 과정은 스캐폴드와 제시된 분석 방법에 따라 최적화될 수 있으며 관련 시그널링 경로를 평가하는 데 유용하다.

초록

이 원고는 프로바이오틱스배양으로 간주되는 유산균 발효 세포 배양에서 수퍼나티를 사용하여 암세포의 다세포 유형의 3차원(3D) 스페로이드에서 암세포 사망을 평가하는 프로토콜을 설명합니다. 유산균 세포 없는 상퍼나탄(LCFS)을 테스트하기 위해 3D 배양을 사용하는 것은 특히 L. 발효가 장 내항암 효과를 생성할 수 있기 때문에 2D 단층에서 테스트하는 것보다 더 나은 옵션입니다. L. 발효 상체는 3D 배양 조건에서 여러 대장암(CRC) 세포에 대한 증식 효과를 보유한 것으로 확인되었다. 흥미롭게도, 이러한 효과는 암세포 사망을 유도하는 L. 발효의 주목할 만한 능력을 입증하는 배양 모델과 강하게 관련이 있었다. 안정스페로이드는 아래에 제시된 프로토콜을 사용하여 다양한 CRC(대장암세포)로부터 생성되었다. 3D 스페로이드를 생성하는 이 프로토콜은 시간 절약및 비용 효율적입니다. 이 시스템은 여러 유형의 CRC 스페로이드에서 LCFS의 항암 효과를 쉽게 조사하기 위해 개발되었습니다. 예상대로, 실험 중 LCFS로 치료된 CRC 스페로이드는 qRT-PCR, 서부 블로팅 및 FACS 분석에 의해 분석된 특정 세포사멸 분자 마커를 발현하였다. 따라서, 이 방법은 세포 생존가능성을 탐구하고 항암제의 효능을 평가하는 데 유용하다.

서문

프로바이오틱스는 면역 항상성을 개선하고 에너지 대사를 주최하는 장내 가장 유리한 미생물입니다^1. 유산균과 비피도박테리움의 프로바이오틱스는^장2,3에서발견되는 가장 진보된 프로바이오틱스입니다. 이전 조사는 유산 균이 여러 암에 억제 및 항증식 효과가 있음을 보여 주었다, 대장암을 포함^4. 또한, 프로바이오틱스는 염증성 장질환, 크론병, 궤양성 대장염^5,6을예방한다. 그러나, probiotics와 대부분의 연구 2 차원에서 수행 되었다 (2D) 단층 고체 표면에 성장.

인공 배양 시스템은 암세포에 자연적이지 않은 환경 적 특징이 부족합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 3차원(3D) 배양 시스템이^7,8을개발하였다. 3D내암세포는 세포 생존가능성, 증식, 형태학, 세포통신, 약물 민감도, 생체내 관련성^9,10과 같은 기본적인 생물학적 메커니즘의 측면에서 개선을 보여준다. 더욱이, 스페로이드는 대장암의 다세포형으로 만들어지며 세포 세포 상호작용 및 세포외 매트릭스(ECM)^11에의존한다. 우리의 이전 연구는 유산 균 발효를 사용 하 여 생산 하는 probiotic 세포 무료 supernatant (CFS) 대장암의 3D 배양에 항 암 효과 보여 보고 (CRC) 세포^12. 우리는 CFS가 3D 스페로이드^12에프로바이오틱 효과를 테스트하기위한 적절한 대체 전략이라고 제안했다.

여기서, 우리는 몇몇 3D 대장암 모방 시스템에 probiotic 세포 없는 supernatant (CFS)의 치료 효과의 분석을 위해 3D 대장암의 다세포 모형을 수용할 수 있는 접근법을 제시합니다. 이 방법은 체외에서 관련 프로바이오틱 및 항암 효과의 분석을 위한 수단을 제공한다.

프로토콜

1. 세균 세포 배양 및 유산 균 세포 없는 상체체의 준비 (LCFS)

참고: 단계 1.2 – 1.9 혐기성 챔버에서 실시됩니다.

1. L-시스테인이 들어 있는 MRS 한천 접시와 국물을 준비하고 오토클레이브를 통해 살균합니다.
2. _H2 혐기성 챔버에서 MRS 한천 플레이트를 20 ppm 산소로 37°C로 유지한 사전 배양한다.
3. 해동 유산균 세균육및 항마판을 세균배양으로 접종한다(도1A(i).
4. 단일 세균 식민지가 얻을 때까지 37 °C 및 20 ppm 산소에서 H₂ 혐기성 챔버에서 2 - 3 일 동안 박테리아를 배양한다.
5. 훈게이트 형 무성 배양 튜브를 세척하고 건조시십시오. 배양 튜브를 121°C에서 15분 동안 자동 클락.
6. 그런 다음 37°C 및 20 ppm 산소에서 H₂ 혐기성 챔버에서 튜브를 배양하여 산소를 제거합니다.
7. 튜브에 MRS 국물의 2 - 3 mL을 배치합니다. 부틸 고무 스토퍼로 튜브를 밀봉하고 캡을 나사.
8. 루프가 있는 단일 콜로니를 획득하여 1x PBS의 500 μL로 1.5mL 배양 튜브에 배치하십시오. (그림1A (ii)).
9. 1 mL 주사기를 사용하여 콜로니를 일시 중단(도 1A (iii) 이렇게 하면 튜브 뚜껑 중앙에 1mL 주사기의 바늘을 삽입하고 중단된 식민지를 흡입한 다음 MRS 국물 매체로 다시 다시 분리합니다. (그림1A (iv)).
10. 2 일 동안 셰이커 인큐베이터에서 MRS 국물 미디어를 배양 (37 °C, 5 % CO_2,200 rpm).
11. 분광계를 사용하여 광학 밀도(OD)를 측정하여 OD_620의 흡광도가 2.0에 도달할 때까지 세균 성장 곡선을 모니터링합니다.
12. 세균성 펠릿과 조건부 매체를 1,000 x g에서 15분 동안 원심분리하여 분리합니다. 수집된 세균성 펠릿을 1x PBS로 세척하고 10% 태아 소 혈청으로 보충된 RPMI 1640의 4mL에서 재연합니다. 배지에 항생제를 포함하지 마십시오.
13. 세균성 펠릿을 RPMI에서 유지하고 셰이커 인큐베이터에서 37°C에서 4시간 동안 5%_CO2를 100rpm의 속도로 배양한다.
14. 프로바이오틱 상류제의 제조를 위해 원심분리를 통해 세균펠릿을 1000 x g에서15분 동안 제거하십시오. 멸균 필터는 0.22 μm 필터를 사용하여 회수 된 상체를 사용하고 사용전까지 -80 °C에 저장합니다.

2. 스페로이드 생성

1. 대장암 세포주 준비
   1. DLD-1, HT-29 및 WiDr 세포주를 70-80%까지 단층층으로 성장시키고 5% CO₂ 인큐베이터에서 37°C에서 플레이트를 배양합니다(성장 배지: 10% 태아 소 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-streptomycin)을 함유한 RPMI.
   2. 100mm 페트리 접시로 자란 셀의 경우, 1x PBS의 4mL로 접시를 두 번 씻으시다. 0.25% 트립신-EDTA의 1mL을 추가하고 세포를 해리하기 위해 5% CO₂ 인큐베이터에서 37°C에서 2분 동안 페트리 접시를 배양한다.
   3. 인큐베이션 후 현미경으로 세포 해리를 확인하고 5mL의 성장 배지로 트립신-EDTA를 중화시한다.
   4. 해리된 세포를 15mL 원물 관및 원심분리기로 300 x g로 3분 간 이송한다.
   5. 상체를 버리고 성장 매체의 3mL로 부드럽게 다시 중단하십시오.
   6. 혈종계를 사용하여 실행 가능한 세포를 결정하기 위해 트라이팬 블루로 세포를 계산합니다. (그림1B (i))
2. 스페로이드 형성
   1. 15mL 원물 관에서 세포를 2.1.5로부터 희석하여 1- 2 x 10⁵ 세포/mL(도 1B(ii)를얻습니다.
   2. 세포 현탁액에 0.6%의 메틸셀룰로오스의 최종 농도를 추가하고 희석된 세포를 멸균 저장소로 옮길 수 있습니다.
      참고: 각 세포주에 대해 필요한 메틸셀룰로오스의 양은 적정화되고 그에 따라 결정되어야 합니다.
   3. 멀티채널 파이펫을 사용하여 200 μL의 셀을 초저 부착 96웰 라운드 하단 마이크로플레이트의 각 웰에 분배합니다. (그림1B (iii))
   4. 플레이트를 37°C에서 24-36h의 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양한다.
   5. 24 - 36 시간 후, 스페로이드 형성을 보장하기 위해 가벼운 현미경으로 플레이트를 관찰하십시오.

3. LCFS로 3D 대장 암세포 치료

1. 2단계와 3단계에서 설명된 바와 같이 스페로이드를 생성합니다.
2. LCFS 치료를 수행하기 전에 실온(RT)에서 10-20분 동안 냉동 LCFS를 해동하십시오.
3. LCFS 주식 솔루션을 성장 매체로 접종합니다. 연속적으로 25%, 12.5%, 성장 매체의 6%로 희석합니다(즉, 25% LCFS = 성장 매체의 150 μL + LCFS의 50 μL).
4. 인큐베이터에서 스페로이드를 함유한 세포 배양판을 꺼내 200μL 파이펫을 사용하여 각 우물에서 가능한 한 많은 성장 배지를 제거합니다.
5. 세포에 LCFS를 사용하여 성장 매체를 추가하고 24 - 48h에 대한 5 % CO₂ 인큐베이터에서 37 ° C에서 배양한다.
   참고: 사용되는 부피는 다음과 같이 플레이트 크기에 따라 달라집니다: 6웰 세포 배양 판에 대한 2mL; 96웰 세포 배양판을 위한 200 μL.

4. 스페로이드에 대한 세포 생존 가능성

1. 8 -10 LCFS 처리 된 대장암 스페로이드를 불투명 벽다중 음판에서 준비하십시오 (세포 생존 성 소는 LCFS 치료 후 48 h로 수행됩니다).
2. 하룻밤 동안 세포 생존 능력 시약 (재료의 표참조)을 4 °C에서 해동하십시오.
3. 사용 전에 세포 생존능력 시약을 실온에 상량화합니다.
4. 분석작업을 수행하기 전에 스페로이드에서 성장 미디어의 50%를 제거합니다.
5. 각 웰에 셀 생존 능력 시약 100 μL을 추가합니다.
   참고: 사용할 부피는 다음과 같이 플레이트 크기에 따라 달라집니다: 96웰 세포 배양 판에 대한 100 μL.
6. 시약을 5분 동안 격렬하게 섞어 세포 용해를 촉진합니다.
7. 37 °C에서 30 분 - 2 시간 동안 배양하십시오.
8. 발광을 기록합니다.

5. 스페로이드에 대한 정량적 실시간 폴리머라제 연쇄 반응 분석

1. 각 조건에 대해 2mL 튜브에 10 - 15 스페로이드를 준비하고 원심 분리기는 400 x g에서 3 분 동안 준비하십시오.
2. 상체를 버리고 얼음 차가운 1 x PBS의 1 mL에서 스페로이드를 두 번 씻으십시오.
   참고: 원심분리를 피하고 스페로이드가 정착하게 하십시오.
3. 가능한 한 1x PBS의 많은 흡인및 시판 가능한 키트를 사용하여 RNA를 분리합니다.
4. 제조업체의 프로토콜에 따라 시판 되는 키트를 사용하여 RNA 1 μg에서 cDNA를 합성합니다.
5. 마스터 믹스를 준비하여 트리플리케이트로 모든 샘플을 실행합니다(표 1 및 표 2참조).
6. 템플릿 마스터 믹스의 20 μL에서 각 qPCR 플레이트에 증폭을 잘 수행합니다.
7. 반응을 잘 혼합하고 필요한 경우 회전합니다.
8. 계측기제조업체(표 3)의권장 사항에 따라 샘플을 실행합니다.

6. 스페로이드에서 서양 블로팅

참고: 스페로이드를 수집할 때 200 μL 파이펫을 사용하고 팁 끝을 잘라 구조가 방해하지 않도록 하십시오.

1. 각 조건에 대해 2mL 튜브에서 30 -40 스페로이드를 준비하십시오.
2. 튜브를 얼음 위에 놓고 스페로이드가 2mL 튜브의 바닥으로 정착하게 하십시오.
3. 상체를 버리고 1 mL 얼음 차가운 1 x PBS에서 스페로이드를 두 번 씻으십시오.
   참고: 원심분리를 피하고 스페로이드가 정착하게 하십시오.
4. 가능한 한 1x PBS를 흡인하고 프로테아제 억제제 칵테일 (10 스페로이드 = RIPA 버퍼의 30 μL)와 RIPA 버퍼를 추가합니다.
5. 위아래로 파이펫팅하여 세포를 lyse하고 10 사이클 동안 얼음에 30 초 의 휴식과 함께 30 s에 대한 초음파 처리를 수행합니다.
6. 원심분리단백질은 4°C에서 15분 동안 15000 x g에서 15분 동안 리자트합니다.
7. 각 세포 용액에 대한 단백질 농도를 결정합니다.
8. 로드하기 전에 각 셀을 100°C에서 10분 동안 샘플 버퍼로 끓입니다.
9. SDS-PAGE 젤의 우물에 동일한 양의 단백질을 적재하고 100 V에서 1 - 2 시간 동안 젤을 실행합니다.
10. 젤에서 PVDF 막으로 단백질을 전달합니다.
11. 이송 후, 블로킹 버퍼(0.05% Tween-20)를 사용하여 실온에서 1h의 멤브레인을 차단하십시오.
12. 1차항체(표 4)의1:1,000 희석제로 멤브레인을 배양하여 1x TBST에서 5% BSA 버퍼를 하룻밤 사이에 4°C로 배양한다.
13. TBST로 멤브레인을 세 번, 세척할 때마다 15분 세척합니다.
14. 2 시간 동안 실온에서 차단 버퍼에서 이차 항체의 1:2,500 희석으로 멤브레인을 배양하십시오 (재료표참조).
15. TBST로 멤브레인을 세 번, 세척할 때마다 15분 세척합니다.
16. 화학 발광 기판으로 HRP 검출을 위한 막을 준비합니다.
17. 화학 발광 이미지를 획득합니다.

7. 스페로이드의 프로피듐 이오디드 (PI) 염색

1. 4.1 단계에서 설명된 바와 같이 5-10 스페로이드를 준비하고 37°C 및 5% CO_2의인큐베이터에 스페로이드를 배치한다.
2. 1x PBS에서 PI 1:100의 1 mg/mL 재고를 희석시하십시오.
3. 96웰 플레이트의 각 웰에서 배지의 50%를 제거합니다.
4. 각 우물에 PI 용액의 100 μL을 추가하고 37 °C에서 인큐베이터에 우물을 넣고 10 - 15 분 동안 5 % CO_2를 배치하십시오.
5. 1x PBS로 PI 용액을 씻어내라.
6. 성장 배지의 200 μL을 추가하고 형광 현미경을 사용하여 이미지를 가져 가라. 이미지 J를 사용하여 형광 강도를 분석하여 스페로이드의 생존 가능성을 가져옵니다.

8. 스페로이드의 FACS 분석

1. 이전에 설명한 대로 스페로이드를 생성합니다.
2. 각 조건에 대해 FACS 튜브에 30-40 스페로이드를 준비하고 원심분리기는 400 x g및 RT에서 3분 동안 준비합니다.
3. 슈퍼나탄을 흡기하고 1x PBS의 3mL로 스페로이드를 세척한 다음 4°C에서 3분 동안 400 x g에서 원심분리기를 세척합니다.
4. 수퍼네티드를 흡인하고 0.25% 트립신-EDTA의 200 μL을 추가한 다음 RT에서 2-3분 동안 배양합니다.
   참고: 잠복기 시간은 스페로이드 크기와 셀 유형에 따라 다릅니다.
5. FACS 버퍼 1mL을 추가하고 200 μL 파이펫을 사용하여 스페로이드를 부드럽게 분리합니다.
6. 3 분 동안 400 x g 및 4 °C에서 해리 된 세포를 원심 분리합니다.
   참고: FACS 버퍼 = 1x PBS + 2.5% FBS, 0.22 μm 상단 필터를 사용하여 필터링.
7. 상체를 폐기하고 7-AAD/부속서 V 시약(7AAD(5μL), 부속서 V(5 μL)/시료를 추가합니다.
8. 부드럽게 세포를 소용돌이와 어둠 속에서 RT에서 13 - 30 분 동안 배양.
9. FACS 버퍼 500 μL을 추가하고 원물 폴리스티렌 테스트 튜브를 사용하여 세포를 필터링하여 집계 셀을 제거합니다.
10. 원심분리기 400 x g및 4°C에서 3분 동안.
11. 각 튜브에 500 μL의 부속서 V 바인딩 버퍼를 추가하고 다시 일시 중지합니다.
12. 유동 세포계를 사용하여 분석합니다.

결과

우리는 다양한 대장암 세포주로부터 스페로이드를 얻는 프로토콜을 설명합니다. 메틸셀룰로오스를 보충하셔야 스페로이드를 생성해야 했습니다. 우리는 또한 LCFS 준비의 방법을 제시하고 프로바이오틱스와 대장암 사이의 상관 관계를 연구하는 모델을 제시한다. 스페로이드 형성 및 LCFS 준비 프로토콜은 도 1A,B에괄호로 도시된다. 도 2A에?...

토론

인접한 세포및 세포외 매트릭스(ECM)를 포함하는 조직 미세환경은 조직 생성에 근본적이며 세포 성장 및 조직^{개발(13)의}제어에 결정적인 역할을 한다. 그러나, 2D 배양은 세포 상호 작용의 중단과 같은 몇몇 단점이 있습니다, 세포 형태에 있는 변경, 세포 외 환경 및 분열 의 접근^14. 3D 세포 배양 시스템은 생체 내 효과를 더 잘 재현하기 위해 엄격하게 연구되었으?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 15-well, 15 µl	Biorad	4561036	Pkg of 10
Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4311971	100 covers
10x transfer buffer	Intron	IBS-BT031A	1 L
10X Tris-Glycine (W/SDS)	Intron	IBS-BT014	1 L
Axygen 2.0 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube, Polypropylene, Clear, Nonsterile, 500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case	Corning	SCT-200-C	500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case
BD Difco Bacto Agar	BD	214010	500 g
BD Difco Lactobacilli MRS Broth	BD	DF0881-17-5	500 g
CellTiter-Glo 3D Cell viability assay	Promega	G9681	100μl/assay in 96-well plates
Complete Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	11697498001	vial of 20 tablets
Corning Phosphate-Buffered Saline, 1X without calcium and magnesium, PH 7.4 ± 0.1	Corning	21-040-CV	500 mL
EMD Millipore Immobilon-P PVDF Transfer Membranes	fisher Scientific	IPVH00010	26.5cm x 3.75m roll; Pore Size: 0.45um
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap	Corning	352235	25/Pack, 500/Case
Fetal Bovine Serum, certified, US origin	Thermo Fisher Scientific	16000044	500 mL
iScript cDNA Synthesis Kit, 25 x 20 µl rxns #1708890	Biorad	1708890	25 x 20 µL rxns
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Biorad	1725121	5 x 1 mL
Lactobacillus fermentum	Korean Collection for Type Cultures	KCTC 3112
L-Cysteine hydrochloride monohydrate	Sigma-Aldrich	C6852-25G	25 g
Methyl Cellulose (3500-5600mPa·s, 2% in Water at 20°C)	TCI	M0185	500 g
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL	Applied Biosystems	4346906	20 plates
Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized	Millipore	SLGS033SB	250
PE Annexin V Apoptosis Detection Kit with 7-AAD	Biolegend	640934	100 tests
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122	100 mL
Propidium Iodide	Introgen	P1304MP	100 mg
RIPA Lysis and Extraction Buffer	Thermo Fisher Scientific	89901	250 mL
RNeasy Mini Kit (250)	Qiagen	74106	250
RPMI-1640	Gibco	11875-119	500 mL
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25200056	100 mL
Name of Materials/Equipment/Software	Company	Catalog Number	Comments/Description
anti - p-IκBα (B-9)	Santa cruze	sc-8404	200 µg/mL
anti-BclxL (H-5)	Santa cruze	sc-8392	200 µg/mL
anti-PARP 1 (C2-10)	Santa cruze	sc-53643	50 µl ascites
anti-β-actin (C4)	Santa cruze	sc-47778	200 µg/mL
BD FACSVerse	BD Biosciences		San Diego, CA, USA
Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader	BioT	S1LFA
CO2 incubator	Thermo fisher	HERAcell 150i
Conical tube 15 ml	SPL	50015
Conical tube 50 ml	SPL	50050
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate	Sigma-Aldrich	CLS7007
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate	Sigma-Aldrich	CLS3471
Costar 50 mL Reagent Reservoirs, 5/Bag, Sterile	Costar	4870
Countess Cell Counting Chamber Slides	Thermofisher	C10228
Countess II FL Automated Cell Counter	invitrogen	AMQAF1000
EnSpire Multimode Reader	Perkin Elmer		Enspire 2300
Eppendorf Research Plus Multi Channel Pipette, 8-channel	Eppendorf	3122000051
FlowJo software	TreeStar		Ashland, OR, USA
Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	115-035-062	1.5 mL
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	111-035-144	2.0 mL
GraphPad Prism 5	GraphPad Software		Inc., San Diego, CA, USA
ImageJ	NIH
ImageQuant LAS 4000 mini	Fujifilm		Tokyo, Japan
Incubated shaker	Lab companion	SIF-6000R
Multi Gauge Ver. 3.0,	Fujifilm		Tokyo, Japan
Optical density (OD)LAMBDA UV/Vis Spectrophotometers	Perkin Elmer		Waltham, MA, USA
Phase-contrast microscope	Olympus		Tokyo, Japan
SPL microcentrifuge tube 1.5mL	SPL	60015
SPL Multi Channel Reservoirs, 12-Chs, PS, Sterile	SPL	21012
StepOnePlus Real-Time PCR system	Thermo Fisher Scientific		Waltham, MA, USA
Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processors	SONICS-vibra cell	VC 505	500 Watt ultrasonic processor
Vinyl Anaerobic Chamber	COY LAB PRODUCTS