JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь представлены методы для понимания противораковых эффектов lactobacillus бесклеточного супернатанта (LCFS). Линии клеток колоректального рака показывают гибель клеток при лечении LCFS в 3D-культурах. Процесс генерации сфероидов может быть оптимизирован в зависимости от каркаса, а представленные методы анализа полезны для оценки задействованных сигнальных путей.

Аннотация

В этой рукописи описан протокол оценки гибели раковых клеток в трехмерных (3D) сфероидах многоклеточных типов раковых клеток с использованием супернатантов из клеточной культуры Lactobacillus fermentum, рассматриваемой как культуры пробиотиков. Использование 3D-культур для тестирования безклеточного супернатанта Lactobacillus (LCFS) является лучшим вариантом, чем тестирование в 2D-монослоях, тем более что L. fermentum может производить противораковые эффекты в кишечнике. Было выявлено, что супернатант L. fermentum обладает повышенными антипролиферативными эффектами против нескольких клеток колоректального рака (CRC) в условиях 3D-культуры. Интересно, что эти эффекты были тесно связаны с моделью культуры, демонстрируя заметную способность L. fermentum индуцировать гибель раковых клеток. Стабильные сфероиды были получены из различных КРЦ (колоректальных раковых клеток) с использованием протокола, представленного ниже. Этот протокол генерации 3D-сфероида экономит время и экономична. Эта система была разработана для легкого исследования противораковых эффектов LCFS в нескольких типах сфероидов CRC. Как и ожидалось, сфероиды CRC, обработанные LCFS, сильно индуцировали гибель клеток во время эксперимента и экспрессировали специфические молекулярные маркеры апоптоза, проанализированные qRT-PCR, западным блоттингом и анализом FACS. Поэтому этот метод ценен для изучения жизнеспособности клеток и оценки эффективности противораковых препаратов.

Введение

Пробиотики являются наиболее выгодными микроорганизмами в кишечнике, которые улучшают иммунный гомеостаз и энергетический обмен хозяина1. Пробиотики из Lactobacillus и Bifidobacterium являются самыми передовыми в своем роде, обнаруженными в кишечнике2,3. Предыдущие исследования показали, что Lactobacillus оказывает ингибирующее и антипролиферативное действие на несколько видов рака, включая колоректальный рак4. Кроме того, пробиотики предотвращают воспалительные заболевания кишечника, болезнь Крона и язвенный колит5,6. Однако большинство исследований с пробиотиками проводились в двухмерных (2D) монослоях, которые выращиваются на твердых поверхностях.

Системы искусственных культур не имеют особенностей окружающей среды, что не является естественным для раковых клеток. Для преодоления этого ограничения были разработаны трехмерные (3D) системы культур7,8. Раковые клетки в 3D показывают улучшения с точки зрения основных биологических механизмов, таких как жизнеспособность клеток, пролиферация, морфология, клеточно-клеточная связь, чувствительность к лекарственным средствам и актуальность in vivo9,10. Кроме того, сфероиды производятся из многоклеточных типов колоректального рака и зависят от клеточно-клеточных взаимодействий и внеклеточного матрикса (ECM)11. Наше предыдущее исследование показало, что пробиотический бесклеточный супернатант (CFS), полученный с использованием Lactobacillus fermentum, показал противораковые эффекты на 3D-культурах клеток колоректального рака (CRC)12. Мы предположили, что CFS является подходящей альтернативной стратегией для тестирования пробиотических эффектов на 3D-сфероидах12.

Здесь мы представляем подход, который может приспособить многоклеточные типы 3D-колоректального рака для анализа терапевтических эффектов пробиотического бесклеточного супернатанта (CFS) на нескольких системах 3D-мимикрии колоректального рака. Этот метод предоставляет средства для анализа связанных пробиотических и противораковых эффектов in vitro.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Бактериальные клеточные культуры и получение безклеточного супернатанта Lactobacillus (LCFS)

ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы 1.2 – 1.9 проводятся в анаэробной камере.

  1. Готовят агаровую пластину MRS и бульон, содержащий L-цистеин, и стерилизуют автоклавированием.
  2. Предварительно инкубируют агарную пластину MRS в анаэробной камереH2, поддерживаемой при 37 °C с кислородом 20 ppm.
  3. Оттаивайте бактериальный запас Lactobacillus и прививайте агаровую пластину бактериальной культурой(рисунок 1A (i)).
  4. Инкубировать бактерии в течение 2 - 3 дней в анаэробной камереH2 при 37 °C и 20 ppm кислорода до получения отдельных бактериальных колоний.
  5. Промыть и высушить анеробную культурную трубку типа Hungate. Автоклав культуральная трубка при 121 °C в течение 15 мин.
  6. Затем инкубируют трубку в анаэробной камереH2 при 37 °C и 20 ppm кислорода для удаления кислорода.
  7. Поместите 2 - 3 мл бульона MRS в пробирку. Запечатайте трубку пробкой из бутилкаучука и прикрутите колпачок.
  8. Получите одну колонию с петлей и поместите ее в культурную трубку 1,5 мл с 500 мкл 1x PBS. (Рисунок 1А ii)).
  9. Приостановить колонию с помощью шприца 1 мл(рисунок 1А (iii)). Сделайте это, вставив иглу шприца 1 мл в центр крышки трубки, аспирируя взвешенную колонию, а затем повторно идуцируя ее обратно в пластовую жиму для бульона MRS. (Рисунок 1А iv)).
  10. Инкубировать мрс-отвар в шейкерном инкубаторе в течение 2 дней (37 °C, 5% CO2,200 об/мин).
  11. Измерьте оптическую плотность (OD) с помощью спектрофотометра для мониторинга кривых роста бактерий до тех пор, пока поглощение ПРИ OD620 не достигнет 2,0.
  12. Отделите бактериальные гранулы и кондиционированную жиму путем центрифугирования при 1000 х г в течение 15 мин. Вымойте собранные бактериальные гранулы 1x PBS и повторно суспендируем в 4 мл RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной бычий сыворотки. Не включайте антибиотики в среду.
  13. Выдерживают бактериальные гранулы в RPMI и инкубируют в шейкерном инкубаторе в течение 4 ч при 37 °C с 5% CO2 со скоростью 100 об/мин.
  14. Для получения пробиотического супернатанта удаляют бактериальную гранулу путем центрифугирования при 1000 х г,в течение 15 мин при 4 °C. Стерильно-фильтруйте восстановленное супернатант с помощью фильтра 0,22 мкм и храните при −80 °C до использования.

2. Генерация сфероидов

  1. Подготовка линий клеток колоректального рака
    1. Выращивайте клеточные линии DLD-1, HT-29 и WiDr в качестве монослоев до 70-80% слияния и инкубирует пластину при 37 °C в инкубаторе с 5% CO2 (Питательнаясреда: RPMI, содержащая 10% фетальной бычий сыворотки (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицин).
    2. Для клеток, выращенных в 100 мм чашке Петри, дважды вымойте пластину 4 мл 1x PBS. Добавьте 1 мл 0,25% трипсина-ЭДТА и инкубируют чашку Петри в течение 2 мин при 37 °C в инкубаторе с 5% CO2 для диссоциации клеток.
    3. После инкубации проверьте диссоциацию клеток под микроскопом и нейтрализуйте трипсин-ЭДТА 5 мл питательной среды.
    4. Переложите диссоциированные клетки в коническую трубку 15 мл и центрифугу в течение 3 мин при 300 х г.
    5. Отбросьте супернатант и осторожно повторно суспендируйте с 3 мл питательных сред.
    6. Подсчитайте клетки с трипановым синим цветом, чтобы определить жизнеспособные клетки с помощью гемоцитометра. (Рисунок 1B (i))
  2. Сфероидная формация
    1. В конической пробирке 15 мл разбавляют ячейки от 2,1,5 до получения 1 - 2 х 105 клеток/мл(рисунок 1B (ii))
    2. Добавьте конечную концентрацию 0,6% метилцеллюлозы в клеточную суспензию и перенесите разбавленные клетки в стерильный резервуар.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждой клеточной линии необходимое количество метилцеллюлозы должно быть титровано и определено соответствующим образом.
    3. Используйте многоканальную пипетку для дозирования 200 мкл клеток в каждую скважину сверхнизкой прикрепленной 96-скважинной круглой нижней микропластины. (Рисунок 1В iii))
    4. Инкубируют пластину при 37 °C в 5% CO2 инкубаторе в течение 24 - 36 ч.
    5. Через 24 - 36 ч наблюдают за пластиной под световым микроскопом, чтобы обеспечить образование сфероидов.

3. Лечение 3D-клеток колоректального рака с помощью LCFS

  1. Создайте сфероиды, как описано в шагах 2 и 3.
  2. Перед выполнением процедуры LCFS разморозить замороженный LCFS при комнатной температуре (RT) в течение 10 - 20 мин.
  3. Инокулируйте раствор запасов LCFS в питательную среду. Последовательно разбавляют до 25%, 12,5% и 6% в питательной среде (т.е. 25% LCFS = 150 мкл питательной среды + 50 мкл LCFS).
  4. Извлеките из инкубатора пластину для культивации клеток, содержащую сфероиды, и удалите как можно больше питательной среды из каждой скважины с помощью пипетки 200 мкл.
  5. Добавьте среду роста с LCFS на клетки и инкубируют при 37 °C в 5% CO2 инкубаторе в течение 24 - 48 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем, который будет использоваться, будет зависеть от размера пластины следующим образом: 2 мл для 6-скважинных пластин клеточных культур; 200 мкл для 96-скважинных пластин для культивированных клеток.

4. Жизнеспособность клеток для сфероидов

  1. Приготовьте 8 - 10 обработанных LCFS сфероидов колоректального рака в непрозрачных многосквазных пластинах (анализы жизнеспособности клеток проводят через 48 ч после лечения LCFS).
  2. Разморозить реагент жизнеспособности клеток (см. Таблицу материалов)при 4 °C на ночь.
  3. Уравновешивают жизнеспособность клеточного реагента до комнатной температуры перед использованием.
  4. Перед выполнением анализа удалите 50% ростовых сред из сфероидов.
  5. Добавьте 100 мкл реагента жизнеспособности клеток в каждую скважину.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем, который будет использоваться, будет зависеть от размера пластины следующим образом: 100 мкл для 96-скважинных пластин клеточной культуры.
  6. Энергично перемешайте реагент в течение 5 мин, чтобы способствовать лизису клеток.
  7. Инкубировать в течение 30 мин – 2 ч при 37 °C.
  8. Запишите люминесценцию.

5. Количественный анализ полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для сфероидов

  1. Для каждого состояния подготовьте 10 - 15 сфероидов в пробирке 2 мл и центрифуге в течение 3 мин при 400 х г.
  2. Выбросьте супернатант и промыть сфероиды дважды в 1 мл ледяного 1x PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте центрифугирования, дайте сфероидам успокоиться.
  3. Аспирировать как можно больше из 1x PBS и изолировать РНК с помощью коммерчески доступного комплекта.
  4. Синтезировать кДНК из 1 мкг РНК с помощью коммерчески доступного комплекта в соответствии с протоколом производителя.
  5. Подготовьте мастер-микс для запуска всех образцов в трехместном формате (см. Таблицу 1 и Таблицу 2).
  6. Выполните усиление в 20 мкл шаблона мастер-микса в каждую пластину qPCR.
  7. Хорошо перемешайте реакции и при необходимости раскрутите.
  8. Запуск образцов в соответствии с рекомендациями производителя прибора(табл. 3).

6. Вестерн-блоттинг из сфероидов

ПРИМЕЧАНИЕ: При сборе сфероидов используйте пипетку 200 мкл и обрежьте конец наконечников, чтобы не нарушить их структуру.

  1. Для каждого состояния подготовьте 30 - 40 сфероидов в трубке 2 мл.
  2. Поместите трубку на лед и дайте сфероидам осесть на дно трубки 2 мл.
  3. Выбросьте супернатант и дважды промыте сфероиды в 1 мл ледяного холода 1x PBS
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте центрифугирования, дайте сфероидам успокоиться.
  4. Аспирировать как можно больше из 1x PBS и добавить буфер RIPA с коктейлем ингибитора протеазы (10 сфероидов = 30 мкл буфера RIPA).
  5. Различает клетки путем пипетки вверх и вниз и выполняет ультразвук в течение 30 с с 30 с отдыха на льду в течение 10 циклов.
  6. Центрифугируют лизаты белка при 15000 х г в течение 15 мин при 4 °C.
  7. Определите концентрацию белка для каждой клетки лизата.
  8. Перед загрузкой вскипятите каждую клетку лизата в буфере образца при 100 °C в течение 10 мин.
  9. Загрузите равное количество белка в колодцы геля SDS-PAGE и запустите гель в течение 1 - 2 ч при 100 В.
  10. Перенесите белок из геля на мембрану PVDF.
  11. После переноса блокируют мембрану на 1 ч при комнатной температуре с помощью блокирующего буфера (5% обезжиренного молока + TBS с 0,05% Tween-20).
  12. Инкубировать мембрану с 1:1000 разведениями первичных антител(таблица 4)в 1x TBST с 5% буфером BSA при 4 °C в течение ночи.
  13. Промывайте мембрану три раза с помощью TBST, 15 мин для каждой стирки.
  14. Инкубируют мембрану с разведениями вторичных антител 1:2 500 в блокирующий буфер при комнатной температуре в течение 2 ч (см. Таблицу материалов).
  15. Промывайте мембрану три раза с помощью TBST, 15 мин для каждой стирки.
  16. Подготовьте мембрану для обнаружения HRP с помощью хемилюминесцентного субстрата.
  17. Получайте хемилуминесцентные изображения.

7. Окрашивание сфероидов йодидом пропидия (PI)

  1. Подготовьте 5-10 сфероидов, как описано на этапе 4.1, и поместите сфероиды в инкубатор при 37 °C и 5% CO2.
  2. Разбавить 1 мг/мл запаса PI 1:100 в 1x PBS.
  3. Удалите 50% среды из каждой скважины плиты из 96 скважин.
  4. Добавляют 100 мкл раствора PI в каждую скважину и помещают скважины в инкубатор при 37 °C и 5% CO2 в течение 10 - 15 мин.
  5. Вымойте раствор PI с помощью 1x PBS.
  6. Добавьте 200 мкл питательной среды и сделайте снимок с помощью флуоресцентного микроскопа. Проанализируйте интенсивность флуоресценции с помощью изображения J, чтобы получить показатель жизнеспособности сфероида.

8. FACS анализ сфероидов

  1. Создавайте сфероиды, как описано выше.
  2. Для каждого состояния подготовьте 30 - 40 сфероидов в трубке FACS и центрифуге в течение 3 мин при 400 х г и RT.
  3. Аспирировать супернатант и промыть сфероиды в 3 мл 1x PBS, затем центрифугу при 400 х г в течение 3 мин при 4 °C.
  4. Аспирировать супернатант и добавить 200 мкл 0,25% трипсина-ЭДТА, затем инкубировать на RT в течение 2-3 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации зависит от размера сфероида и типа клетки.
  5. Добавьте 1 мл буфера FACS и аккуратно диссоциируйте сфероиды с помощью пипетки 200 мкл.
  6. Центрифугируют диссоциированные ячейки при 400 х г и 4 °C в течение 3 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер FACS = 1x PBS + 2,5% FBS, отфильтрованный с помощью верхнего фильтра 0,22 мкм.
  7. Откажитесь от супернатанта и добавьте реагент 7-AAD/Annexin V (7AAD (5 мкл), Annexin V (5 мкл)/образец).
  8. Осторожно вихрь клетки и насиживают в течение 13 - 30 мин при РТ в темноте.
  9. Добавьте 500 мкл буфера FACS и отфильтруйте ячейки с помощью конических полистирольных пробирок для удаления заполнителей.
  10. Центрифуга при 400 х г и 4 °C в течение 3 мин.
  11. Добавьте 500 мкл буфера связывания Annexin V в каждую трубку и повторно суспендировать.
  12. Анализ с помощью проточного цитометра.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Описан протокол получения сфероидов из разнообразных линий клеток колоректального рака. Добавки с метилцеллюлозой требовались для получения сфероидов. Также представлен метод получения LCFS и представлена модель для изучения корреляции между пробиотиками и колоректальным раком. Прот...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Микроокружение тканей, включая соседние клетки и внеклеточный матрикс (ECM), имеет основополагающее значение для генерации тканей и имеет решающее значение для контроля роста клеток и развития тканей13. Однако 2D-культуры имеют ряд недостатков, таких как нарушение клеточных ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы не имеют соответствующей финансовой информации.

Благодарности

Это исследование было поддержано «Установлением эталонов для химии и радиации», номер гранта KRISS-2020-GP2020-0003 и «Разработка стандартов измерений и технологий для биоматериалов и медицинской конвергенции», грант No KRISS-2020-GP2020-0004, финансируемый Корейским научно-исследовательским институтом стандартов и науки. Это исследование также было поддержано Министерством науки и ИКТ (MSIT), Национальным исследовательским фондом Кореи (NRF-2019M3A9F3065868), Министерством здравоохранения и социального обеспечения (MOHW), Корейским институтом развития индустрии здравоохранения (KHIDI, HI20C0558), Министерством торговли, промышленности и энергетики (MOTIE) и Корейским институтом оценки промышленных технологий (KEIT, 20009350). ORCID ID (Хи Мин Ю: 0000-0002-5951-2137; Дукджин Кан: 0000-0002-5924-9674; Сейл Ким: 0000-0003-3465-7118; Джу-Ын Ли: 0000-0002-2495-1439; Джина Ли: 0000-0002-3661-3701). Благодарим Чанг Ву Парк за помощь в проведении экспериментов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments

10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 15-well, 15 µl		Biorad4561036Pkg of 10
Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive FilmThermo Fisher Scientific4311971100 covers
10x transfer bufferIntronIBS-BT031A1 L
10X Tris-Glycine (W/SDS)IntronIBS-BT0141 L
Axygen 2.0 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube, Polypropylene, Clear, Nonsterile, 500 Tubes/Pack, 10 Packs/CaseCorningSCT-200-C500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case
BD Difco Bacto AgarBD214010500 g
BD Difco Lactobacilli MRS BrothBDDF0881-17-5500 g
CellTiter-Glo 3D Cell viability assayPromegaG9681100μl/assay in 96-well plates
Complete Protease Inhibitor CocktailSigma-Aldrich11697498001vial of 20 tablets
Corning Phosphate-Buffered Saline, 1X without calcium and magnesium, PH 7.4 ± 0.1Corning21-040-CV500 mL
EMD Millipore Immobilon-P PVDF Transfer Membranesfisher ScientificIPVH0001026.5cm x 3.75m roll; Pore Size: 0.45um
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap CapCorning35223525/Pack, 500/Case
Fetal Bovine Serum, certified, US originThermo Fisher Scientific16000044500 mL
iScript cDNA Synthesis Kit, 25 x 20 µl rxns #1708890Biorad170889025 x 20 µL rxns
iTaq Universal SYBR Green SupermixBiorad17251215 x 1 mL
Lactobacillus fermentumKorean Collection for Type CulturesKCTC 3112
L-Cysteine hydrochloride monohydrateSigma-AldrichC6852-25G25 g
Methyl Cellulose (3500-5600mPa·s, 2% in Water at 20°C)TCIM0185500 g
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mLApplied Biosystems434690620 plates
Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilizedMilliporeSLGS033SB250
PE Annexin V Apoptosis Detection Kit with 7-AADBiolegend640934100 tests
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122100 mL
Propidium IodideIntrogenP1304MP100 mg
RIPA Lysis and Extraction BufferThermo Fisher Scientific89901250 mL
RNeasy Mini Kit (250)Qiagen74106250
RPMI-1640Gibco11875-119500 mL
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redThermo Fisher Scientific25200056100 mL
Name of Materials/Equipment/SoftwareCompanyCatalog NumberComments/Description
anti - p-IκBα (B-9)Santa cruzesc-8404200 µg/mL
anti-BclxL (H-5)Santa cruzesc-8392200 µg/mL
anti-PARP 1 (C2-10)Santa cruzesc-5364350 µl ascites
anti-β-actin (C4)Santa cruzesc-47778200 µg/mL
BD FACSVerseBD BiosciencesSan Diego, CA, USA
Synergy HTX Multi-Mode Microplate ReaderBioTS1LFA
CO2 incubatorThermo fisherHERAcell 150i
Conical tube 15 mlSPL50015
Conical tube 50 mlSPL50050
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well PlateSigma-AldrichCLS7007
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well PlateSigma-AldrichCLS3471
Costar 50 mL Reagent Reservoirs, 5/Bag, SterileCostar4870
Countess Cell Counting Chamber SlidesThermofisherC10228
Countess II FL Automated Cell CounterinvitrogenAMQAF1000
EnSpire Multimode ReaderPerkin ElmerEnspire 2300
Eppendorf Research Plus Multi Channel Pipette, 8-channelEppendorf3122000051
FlowJo softwareTreeStarAshland, OR, USA
Goat Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson immunoresearch115-035-0621.5 mL
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson immunoresearch111-035-1442.0 mL
GraphPad Prism 5GraphPad SoftwareInc., San Diego, CA, USA
ImageJNIH
ImageQuant LAS 4000 miniFujifilmTokyo, Japan
Incubated shakerLab companionSIF-6000R
Multi Gauge Ver. 3.0,FujifilmTokyo, Japan
Optical density (OD)LAMBDA UV/Vis SpectrophotometersPerkin ElmerWaltham, MA, USA
Phase-contrast microscopeOlympusTokyo, Japan
SPL microcentrifuge tube 1.5mLSPL60015
SPL Multi Channel Reservoirs, 12-Chs, PS, SterileSPL21012
StepOnePlus Real-Time PCR systemThermo Fisher ScientificWaltham, MA, USA
Vibra-Cell Ultrasonic Liquid ProcessorsSONICS-vibra cellVC 505500 Watt ultrasonic processor
Vinyl Anaerobic ChamberCOY LAB PRODUCTS

Ссылки

  1. Bron, P. A., Van Baarlen, P., Kleerebezem, M. Emerging molecular insights into the interaction between probiotics and the host intestinal mucosa. Nature Reviews Microbiology. 10 (1), 66-78 (2012).
  2. Ruiz, L., Delgado, S., Ruas-Madiedo, P., Sánchez, B., Margolles, A. Bifidobacteria and their molecular communication with the immune system. Frontiers in Microbiology. 8, 1-9 (2017).
  3. Sanders, M. E., Merenstein, D. J., Reid, G., Gibson, G. R., Rastall, R. A. Probiotics and prebiotics in intestinal health and disease: from biology to the clinic. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 16 (10), 605-616 (2019).
  4. Pandey, K. R., Naik, S. R., Vakil, B. V. Probiotics, prebiotics and synbiotics- a review. Journal of Food Science and Technology. 52 (12), 7577-7587 (2015).
  5. Harish, K., Varghese, T. Probiotics in humans-evidence based review. Calicut Medical Journal. 4 (4), 3(2006).
  6. Routy, B., et al. The gut microbiota influences anticancer immunosurveillance and general health. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (6), 382-396 (2018).
  7. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. Most of the cell-based data-harvesting efforts that drive the integration of cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  8. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  9. Jong, B. K. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 365-377 (2005).
  10. Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103(2016).
  11. Anton, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: A breakthrough in vivo. International Journal of Molecular Sciences. 16 (3), 5517-5527 (2015).
  12. Lee, J. E., et al. Characterization of the Anti-Cancer Activity of the Probiotic Bacterium Lactobacillus fermentum Using 2D vs. 3D Culture in Colorectal Cancer Cells. Biomolecules. 9 (10), 557(2019).
  13. Koledova, Z. 3D cell culture: An introduction. Methods in Molecular Biology. 1612, (2017).
  14. Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
  15. Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 1-14 (2018).
  16. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: The missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  17. Mazzocchi, A. R., Rajan, S. A. P., Votanopoulos, K. I., Hall, A. R., Skardal, A. In vitro patient-derived 3D mesothelioma tumor organoids facilitate patient-centric therapeutic screening. Scientific Reports. 8, 2886(2018).
  18. Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
  19. Thirumala, S., Gimble, J., Devireddy, R. Methylcellulose Based Thermally Reversible Hydrogel System for Tissue Engineering Applications. Cells. 2 (3), 460-475 (2013).
  20. Chandrashekran, A., et al. Methylcellulose as a scaffold in the culture of liver-organoids for the potential of treating acute liver failure. Cell and Gene Therapy Insights. 4 (11), 1087-1103 (2018).
  21. Lee, W., Park, J. 3D patterned stem cell differentiation using thermo-responsive methylcellulose hydrogel molds. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
  22. Fan, H., Demirci, U., Chen, P. Emerging organoid models: Leaping forward in cancer research. Journal of Hematology and Oncology. 12 (1), 1-10 (2019).
  23. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  24. Liou, C. S., et al. A Metabolic Pathway for Activation of Dietary Glucosinolates by a Human Gut Symbiont. Cell. 180 (4), 717-728 (2020).
  25. Sherwin, E., Bordenstein, S. R., Quinn, J. L., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Microbiota and the social brain. Science. 366 (6465), 2016(2019).
  26. Honda, K., Littman, D. R. The microbiota in adaptive immune homeostasis and disease. Nature. 535 (7610), 75-84 (2016).
  27. Bárcena, C., et al. Healthspan and lifespan extension by fecal microbiota transplantation into progeroid mice. Nature Medicine. 25 (8), 1234-1242 (2019).
  28. Michalovich, D., et al. Obesity and disease severity magnify disturbed microbiome-immune interactions in asthma patients. Nature Communications. 10, 5711(2019).
  29. Ansaldo, E., et al. Akkermansia muciniphila induces intestinal adaptive immune responses during homeostasis. Science. 364 (6446), 1179-1184 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

160Lactobacillus fermentum3DLactobacillus LCFS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены