JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هذا هو بروتوكول لإعداد شريحة حادة من الكبار والشيخوخة فرس النهر الماوس الذي يستفيد من الضخ عبر القلب وقطع شريحة مع الجليد البارد NMDG-aCSF للحد من الضرر نقص الأكسجة في الأنسجة. تبقى الشرائح الناتجة في صحة جيدة على مدار ساعات عديدة ، وهي مناسبة لـ Patch-clamp على المدى الطويل والتسجيلات الميدانية.

Abstract

وقد مكنت شرائح فرس النهر الحادة أجيال من علماء الأعصاب لاستكشاف خصائص متشابك، العصبية، والدوائر بالتفصيل وبدقة عالية. استكشاف LTP و LTD آليات، واحدة حساب تسخين الخلايا العصبية، والتغيرات التي تعتمد على الخبرة في الدوائر، لم يكن ممكنا بدون هذا الإعداد الكلاسيكي. ومع ذلك، مع بعض الاستثناءات القليلة، تم إجراء معظم البحوث الأساسية باستخدام شرائح فرس النهر الحادة باستخدام شرائح من القوارض من أعمار مبكرة نسبيا، ~ P20-P40، على الرغم من أن آليات الإثارة متشابك ومتأصلة لها ذيل التنموية الطويلة التي تصل إلى P60 الماضي. النداء الرئيسي لاستخدام شرائح فرس النهر الشباب هو الحفاظ على صحة الخلايا العصبية بمساعدة ارتفاع التسامح للأضرار نقص الأكسجة. ومع ذلك، هناك حاجة لفهم وظيفة الخلايا العصبية في مراحل أكثر نضجا من التنمية، وزيادة من خلال تطوير نماذج حيوانية مختلفة من الأمراض العصبية التي تتطلب إعداد الدماغ الشيخوخة. هنا وصفنا تعديلا لإعداد شريحة قرن آمون الحاد الذي يسلم بشكل موثوق شرائح صحية من فرس النهر الماوس الكبار والشيخوخة. الخطوات الحاسمة للبروتوكول هي الضخ عبر القلب والقطع مع الجليد الباردة خالية من الصوديوم NMDG-aSCF. معا، هذه الخطوات تخفيف انخفاض نقص الأكسجة الناجم عن ATP عند قطع الرأس، فضلا عن وذمة السامة للخلايا الناجمة عن تدفقات الصوديوم السلبية. نُوضِّفُ كيفية قصّ شرائح مُنَعَرِفِ مِنْ قرن آمون بالإضافة إلى قشرةِ قَدَسْةِ تَعْزِزِيْ بِنْفِرِةِ. شرائح فرس النهر الحادة التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة صحية بشكل موثوق على مدى ساعات عديدة من التسجيل ، وهي مناسبة لكل من التسجيلات الميدانية والتسجيلات المستهدفة باللصقبص ، بما في ذلك استهداف الخلايا العصبية ذات التسمية الفلورية.

Introduction

وقد سهل ظهور الثدييات الاستعدادات شريحة الدماغ الحادة التجارب على المستوى الخلوية والتشابكية التي كانت ممكنة سابقا إلا في الاستعدادات اللافقارية مثل Aplysia1. وكان تطوير شرائح فرس النهر الحادة ذات أهمية خاصة، حيث أنها هيكل مسؤول عن تكوين الذاكرة والعمل والسياق، ولها دوائر ثلاثية متشابك متخصصة قابلة للتلاعب الفسيولوجي السهل. ومع ذلك ، فإن الغالبية العظمى من شرائح الدماغ الحادة لا تزال مستعدة من الفئران والجرذان الصغيرة نسبيا ، حيث أنه من الأسهل الحفاظ على الخلايا العصبية والدوائر الصحية ، وتبقى الشرائح قابلة للحياة لفترات أطول من الزمن2،3،4. هنا، نقدم تعديلات على بروتوكولات التقطيع القياسية التي تؤدي إلى زيادة جدوى شرائح قرن آمون الحادة من الفئران البالغة والشيخوخة.

العائق الرئيسي أمام قدرة الجسم الحي السابق على البقاء على المدى الطويل من الثديات الدماغ parenchyma هو الضرر hypoxic الأولية التي تحدث بسرعة بمجرد تدفق الدم إلى الدماغ يتوقف بعد قطع الرأس. فقدان الأكسجين النتائج في الاستهلاك الأيضي السريع من موارد الطاقة الرئيسية في الدماغ مع فقدان فوسفو الكرياتين (ف- الكرياتين) كونها أسرع، تليها الجلوكوز، الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP)، والجليكوجين4. الحفاظ على ATP له أهمية خاصة لصحة طويلة الأجل لشرائح الدماغ، كما هو مطلوب ATP للحفاظ على إمكانات الغشاء عبر ATPase نا-K، وبالتالي النشاط العصبي5،,6. مستوى ATP في الدماغ القوارض الكبار هو ~ 2.5 mM، ويسقط بشكل حاد داخل 20 ق من قطع الرأس للوصول إلى حالة ثابتة القاعدية (~ 0.5 mM) في حوالي 1 دقيقة بعد قطع الرأس4،7،8. في الحيوانات الصغيرة، يستغرق وقتا أطول لمراقبة نفس الانخفاض في ATP (~ 2 دقيقة)؛ مع التخدير الفينوباربيالي هو مزيد من تباطؤ إلى 4 دقيقة4. وتبين هذه الاعتبارات أن منع فقدان ATP وغيرها من موارد الطاقة هو استراتيجية ضرورية لمنع تلف نقص الأكسجة في الدماغ، وبدوره للحفاظ على صحة شرائح الدماغ على مدى فترات أطول من الزمن، وخاصة في الحيوانات البالغة.

انخفاض درجات الحرارة تبطئ عملية التمثيل الغذائي. وبالتالي، فقد ثبت أن انخفاض حرارة الجسم متواضعة يحمي احتياطيات الطاقة في الدماغ: في الحيوانات الصغيرة، وخفض درجة حرارة الجسم بمقدار ست درجات، من 37 درجة مئوية إلى 31 درجة مئوية، يحافظ على مستويات ATP إلى حوالي 80٪ من المستويات العادية على مدى 4 ساعة من نقص الأكسجة الخاضعة للرقابة9. كما يتم الحفاظ على مستويات P-الكرياتين، وكذلك احتمالية الفسفور الشامل9. وهذا يشير إلى أن خفض درجة حرارة الجسم قبل قطع الرأس يمكن أن يكون عصبيا، حيث يمكن الحفاظ على مستويات شبه طبيعية من ATP من خلال قطع شريحة وشريحة فترات الانتعاش.

إلى درجة أن قطرة ATP لا يمكن منعها تماما عند قطع الرأس، ومن المتوقع وظيفة ضعف جزئي من ATPase نا- K، تليها إزالة التلوث عن طريق تدفق الصوديوم السلبي. كما يتبع تدفق الصوديوم السلبي من خلال دخول المياه إلى الخلايا، فإنه يسبب وذمة السامة للخلايا وفي نهاية المطاف pyknosis. في الفئران البالغة، استبدال نا + الأيونات مع السكروز في حلول قطع شريحة كانت استراتيجية ناجحة لتخفيف عبء الوذمة السامة للخلايا10،11. في الآونة الأخيرة، وقد أظهرت الكاتيونات العضوية الميثيلية التي تقلل نفاذية قناة الصوديوم12 لتقديم حماية أكثر فعالية من السكروز، وخاصة في شرائح من الفئران الكبار، مع N-الميثيل-D-جلوكوامين (NMDG) يجري الأكثر انطباقا على نطاق واسع عبر مختلف الأعمار ومناطق الدماغ13،14،15،16.

العديد من بروتوكولات تشريح الدماغ تنطوي على استخدام درجات الحرارة الباردة فقط خلال خطوة قطع شريحة، وأحيانا في تركيبة مع نا+ استراتيجية استبدال الأيونات16،17. في الحيوانات الصغيرة ، يبدو أن هذه البروتوكولات توفر الحماية العصبية الكافية حيث يمكن استخراج الأدمغة بسرعة بعد قطع الرأس لأن الجمجمة لا تزال رقيقة وسهلة لإزالة3. ومع ذلك، هذه الاستراتيجية لا تنتج شرائح صحية من الحيوانات البالغة. مع مرور الوقت، أدخلت عدد من المختبرات التي تدرس القوارض البالغة الضخ عبر القلب مع محلول الجليد البارد لخفض درجة حرارة جسم الحيوان، وبالتالي تلف نقص الأكسجة في الدماغ، قبل قطع الرأس. تم تطبيق هذا الإجراء بنجاح لإنتاج شرائح cerebellar18، شرائح midbrain19، شرائح القشرة الجديدة11،20، القشرة الرحاين21، قرن آمون الفئران10،22،23، لمبة الشم24، المخطط البطيني25، القشرة البصرية26.

على الرغم من المزايا التي يوفرها الضخ عبر القلب وNa+ استبدال الأيونات في إعداد شرائح من الفئران وفي بعض مناطق الدماغ في الفئران، يبقى قرن الماوس قرن آمين واحدة من أكثر المناطق تحديا للحماية من نقص الأكسجة13،20. حتى الآن، واحدة من النهج الأكثر شيوعا لشرائح قرن آمون من الفئران الشيخوخة ونماذج الماوس من الانعزال العصبي ينطوي على تشريح سريع الكلاسيكية من فرس النهر المعزول27. في البروتوكول الموصوف هنا ، نحن نقلل من فقدان ATP في الدماغ البالغ من خلال إدخال انخفاض حرارة الجسم قبل قطع الرأس عن طريق ضخ الحيوان عبر القلب مع الثلج البارد Na+- السائل النخاعي الاصطناعي المجاني NMDG القائم على NMDG (NMDG-aCSF). ثم يتم قطع شرائح في الجليد الباردة نا+-خالية NMDG-aCSF. مع هذا البروتوكول المعزز نحصل على شرائح قرن آمون حادة من الفئران البالغة والشيخوخة التي هي صحية لمدة تصل إلى 10 ساعة بعد التقطيع ومناسبة لتسجيلات ميدانية طويلة الأجل ودراسات التصحيح المشبك.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ويتم تنفيذ هذا البروتوكول وفقاً لدليل رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية التابع للمعاهد الوطنية للصحة، وهو دليل أقرته لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية للحيوانات في جامعة ستانفورد. كما تتوافق الطرق مع سياسات جمعية علم الأعصاب بشأن استخدام الحيوانات والبشر في أبحاث علم الأعصاب.

ملاحظة: تم الحفاظ على جميع الفئران في بيئة خالية من مسببات الأمراض. واستخدمت الفئران من النوع البري على مختلطة C57Bl / 6 س س / 129J الخلفية الوراثية استخدمت هنا، ما لم يذكر خلاف ذلك.

1. الإعداد

  1. إعداد 1 لتر من 1X aCSF (في mM): 125 NaCl، 26 NaHCO3،2.3 KCl، 1.26 KH2PO4، 1.3 Mg2SO4·7H2O، 2.5 CaCl2، 25 glucose (الجدول 1). استخدم هذا الحل لغرفة الاسترداد والتسجيلات اللاحقة.
    ملاحظة: تخزين aCSF كحل الأسهم 10x التي تحتوي على NaCl، NaHCO3،KCl، وخ2PO4. مخزن ملغ2SO4· 7H2O وCaCl2 كحلول الأسهم 1 M. إعداد حل العمل في يوم التجربة من حلول الأسهم المذكورة أعلاه، وإضافة الجلوكوز قبل تعديل حجم النهائي مع 18 MΩ المياه.
    ملاحظة: اعتمادا على منطقة الدماغ أو سلالة الماوس، يمكن أيضا أن تستخدم aCSF المبردة ل perfusion عبر القلب مع النجاح11،15،26.
  2. إعداد 300 مل من NMDG-aCSF (في mM): 135 NMDG، 1 KCl، 1.2 KH2PO4، 1.5 MgCl2، 0.5 CaCl2، 20 بيكربونات الكولين، 10 الجلوكوز(الجدول 1). هذا الحجم من NMDG-aCSF كافية لكل من التسريب عبر القلب وخطوات القطع.
    ملاحظة: تخزين NMDG-aCSF كحل الأسهم 3x في 4 درجة مئوية. إعداد حل العمل في يوم التجربة؛ إضافة بيكربونات الكولين والجلوكوز قبل ضبط حجم النهائي مع 18 MΩ الماء. فقاعة الحل مع 95٪ O2/5٪ CO2 لمخزنها ، وتشبع مع الأكسجين.
    ملاحظة: يبدأ مخزون NMDG ككلوية عالية، ويتطلب حمض الهيدروكلوريك المركز (HCl) لضبط الأس هيدروكلوريك إلى 7.4~ إضافة حمض الهيدروكلوريك ينبغي أن تكون بطيئة مرة واحدة تحت 8 pH، كما أنه من السهل أن تحمض الحل إلى ~ pH 3 مع حمض الهيدروكلوريك الزائدة. وينبغي أن يتم هذا التعديل قبل إضافة الكاتيونات divalent. هذه الوصفة NMDG-aCSF خالية من الصوديوم. نشرت سابقا وصفات NMDG استخدام 30 mM NaHCO3 للتخزين المؤقت، مما يؤدي إلى 30 mM الصوديوم موجودة في NMDG-aCSF13،20.
  3. تعيين علبة قطع microtome تهتز والقرص تصاعد إلى -20 درجة مئوية.
  4. تحضير غرفة الاسترداد.
    1. ملء غرفة الانتعاش إلى ما فوق شبكة شريحة عقد، والحفاظ على مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة، وفقاعات.
      ملاحظة: غرفة استرداد شريحة المستخدمة هنا هي مشابهة جدا للغرف الكلاسيكية التي سبق وصفها من قبل ادواردز وكونريث3. يتم الاحتفاظ aCSF في كوب زجاجي (400 مل) الذي يحمل إطار الاكريليك جولة مع شبكة النايلون السوداء لصقها على القاع. يتم تعليق إطار الاكريليك في منتصف الكأس عن طريق خطاف الاكريليك يستريح على حافة الكأس. يتم إدخال فقاعة الزجاج على طول الطريق إلى أسفل. تصميم يسمح للأكسجين من كلا الجانبين من شرائح. كما يوفر محتدما خلط مستمر من aCSF في غرفة الانتعاش. توفر الشبكة السوداء تباينًا عاليًا ضد الشرائح البيضاء ، والتي يسهل رؤيتها.
  5. إعداد محلول التسريب والقطع عبر القلب.
    1. هدئ كامل 300 مل من NMDG-aCSF في الثلاجة، حتى بلورات الجليد تبدأ في التشكل على السطح وجدران الزجاجة. لا الإفراط في تجميد!
    2. ضع الزجاجة مع NMDG-aCSF المبردة على الجليد والفقاعات. يجب أن يكون الحل بين 0\u20122 درجة مئوية.
      ملاحظة: SLushy NMDG- aCSF يعني وجود معظم الحل كسائل، في حين أن جزءا صغيرا من الجليد slushy الحالي سوف تبقي الحل بالقرب من 0 درجة مئوية في جميع أنحاء perfusion والقطع. وينبغي توخي الحذر لإبعاد بلورات الثلج عن الدماغ أثناء القطع.
  6. إعداد القرص الأنسجة المتصاعدة.
    1. أخرج القرص من الفريزر، وامسحه جافاً إذا لزم الأمر.
    2. قطع كتلة من 5٪ أجار من لوحة أجار أعدت سابقا، والغراء في وسط القرص باستخدام طبقة رقيقة من الغراء سيانوكريلا. قطعة أجار يجب أن تكون بحجم دماغ فأر. وضع القرص مع أجار لصقها على الجليد، وتغطية مع المناشف الورقية حتى يصبح جاهزا للاستخدام.
      1. ل5٪ agar لوحة، تذوب 5 غرام من أجار في 100 مل من 18 MΩ المياه عن طريق microwaving، وتصب في طبق بيتري نظيفة. يحفظ عند 4 درجة مئوية.
  7. أخرجي صينية القطع من الفريزر، وضعها في الميكراتوم، أحاطه بالثلج، وحمّل النصل.

2. الضخ عبر القلب واستخراج الدماغ

  1. جرّاء فئران الجرعة الزائدة عن طريق حقن داخل الصفاق من كوكتيل مخدر. التحقق من عمق التخدير عن طريق التحقق من انعكاس الألم (إصبع القدم قرصة); يجب أن لا يحمل الماوس رد الفعل بمجرد أن يصل إلى التخدير العميق.
    ملاحظة: وصفة كوكتيل تخدير القوارض: الكيتامين HCl (66 ملغ /مل), زيلازين HCl (6.6 ملغ / مل), ماليات الأسبرومازين (0.1 ملغ / مل), 18 MΩ المياه إلى الحجم النهائي. الجرعة: 0.4 ملغ/ز وزن الجسم, 0.04 ملغ / ز وزن الجسم, 6 × 10-4 ملغ / ز وزن الجسم للكيتامين, xylazine, و acepromazine, على التوالي.
  2. إعداد مضخة ال peristaltic ل perfusion عبر القلب. أدخل جانبًا واحدًا من أنابيب المضخة في الزجاجة باستخدام NMDG-aCSF المثلج. تناسب الجانب الآخر من أنابيب مع إبرة 27 G التي سيتم إدراجها في البطين الأيسر.
  3. تعيين سرعة المضخة في حوالي 3.5 مل / دقيقة. في هذه السرعة، وتدفق NMDG-aCSF هو بالتنقيط السريع، وليس تدفق مستمر.
    ملاحظة: الضخ بالجاذبية هو بديل جيد للضخ ال peristaltic الضخ، طالما يمكن تحقيق نفس معدل التدفق التقريبي. و perfusion في ارتفاع معدل تدفق يؤدي إلى انفجار الأوعية الدموية في الدماغ. علامة تنبئ من ضخ سريع بشكل مفرط وزيادة الضغط في الأوعية الدموية هو حل يخرج من أنف الحيوان.
  4. الضخ
    1. ضع الماوس المُهدّد بشكل صحيح على ظهره على حفاضة. باستخدام شريط ورقي، الشريط أسفل ساقيه الأمامية والذرية بحيث يتم كشف الصدر والبطن.
    2. قطع رقعة كبيرة من الجلد فوق الصدر, الانتقال من تحت القص إلى الحلق; هذا ينبغي أن توفر منطقة عمل كبيرة. الاستيلاء على القص مع ملقط، ورفع بلطف، والبدء في قطع من خلال القفص الصدري على كلا الجانبين حتى يتم الكشف عن تجويف الصدر.
    3. قطع من خلال الحجاب الحاجز من أجل فضح تجويف الصدر. يجب ترك رفرف القفص الصدري مرفقًا عن طريق قطعة رقيقة من العضلات. وينبغي أن يكون من الممكن لتعيينه على جانب دون أن يكون لها تقع مرة أخرى على تجويف الصدر المكشوفة. تأكد من أن القلب لا يزال ينبض. تأكد من أن معظم الكبد مرئي.
    4. أدخل إبرة 27 G في البطين الأيسر؛ البطين الأيسر الماوس تبدو أخف وزنا في اللون من اليمين. حدد مكان الأذين الأيمن الداكن ذو اللون الأحمر. قطع من خلال الأذين الأيمن مع مقص صغير; يجب أن يبدأ الدم في التدفق.
    5. بدء المضخة التي تم مسبقاً إلى سرعة التدفق الصحيح. إذا كان كل شيء قد تم بشكل صحيح، يجب أن تبدأ الكبد لتغيير اللون من الأحمر إلى البني بعد فترة وجيزة من بدء perfusion. مراقبة لون الكبد لتحديد طول الضخ; الكبد يجب أن تتحول البني شاحب.
    6. تشغيل المضخة لبضع دقائق أخرى. إذا كان استخدام ميزان الحرارة المستقيم، ينبغي أن تنخفض درجة حرارة الجسم إلى 28\u201229 درجة مئوية، وأنف الحيوان يجب أن يكون باردا لمسة.
  5. إستخراج الدماغ.
    ملاحظة: لهذه الخطوة، لديها أدوات تشريح التالية جاهزة: مقص قطع الرأس، مقص صغير مع شفرة مستقيمة أو زاوية، مشرط #10 شفرة، شفرة حافة واحدة، #3 ملقط، ملعقة مع جانب واحد عازمة على 90 درجة، ملعقة، أداة "60 درجة"(الشكل 1A، B)،وفرشاة ناعمة صغيرة.
    1. قطع رأس الماوس مع مقص قطع الرأس كبيرة. باستخدام مشرط مع شفرة #10، وقطع فتح الجلد على رأس الجمجمة. مع مقص صغير الزاوية، وقطع الجمجمة في خط الوسط. بعد ذلك ، باستخدام ملقط #3 ، نقب الأنصاف اليمنى واليسرى للجمجمة ، مع الحرص على أخذ الجافية معها. يجب أن يتعرض الدماغ الآن.
      ملاحظة: إذا كانت الجافة تنفصل عن الجمجمة، فإنها ستبقى فوق الدماغ ويجب إزالتها بشكل منفصل. يمكن لحافات الجافا المتبقية تشديد وشريحة عميقة من خلال الدماغ، مما قد يضر منطقة الدماغ من الفائدة.
    2. إزالة الدماغ عن طريق يغرف بها مع ملعقة صغيرة. إسقاط الدماغ في حل NMDG-aCSF وضعت في منقار صغير منفصل على الجليد. اتركه هناك لمدة تصل إلى دقيقة.
      ملاحظة: بالإضافة إلى انخفاض حرارة الجسم، والتعرض لشركات الملحية الجليد الباردة حتى الدماغ، وهو أمر ضروري حتى لقطع. وينبغي أن يكون الإجراء بأكمله من قطع الرأس إلى استخراج الدماغ تحت 30 ق.

3. تقطيع

  1. أخرج الدماغ من NMDG-aCSF وضعه على قطعة من ورق التصفية.
  2. قص وإزالة إسفين 60 درجة من نهاية الرسترالية من forebrain باستخدام أداة "60 درجة" تركزت في خط الوسط. سيتم استخدام الأسطح القطعية للتركيب لتحقيق الزاوية المناسبة لشرائح فرس النهر على النحو المبين أدناه (الشكل 1A, B).
    ملاحظة: اثنين من ريش ذات حدين واحد عقد معا عن طريق حامل من صنع المنزل جعل أداة سهلة الاستخدام لجعل قطع 60 درجة (الشكل 1A).
  3. نصفي الكرة الأرضية منفصلة أسفل خط الوسط مع مشرط.
  4. الغراء نصفي الكرة الأرضية على القرص المتصاعد على النحو التالي. خذ القرص المتصاعد الذي كان على الجليد حتى الآن. إذا لزم الأمر، امسحها مرة أخرى. الغراء كل نصف الكرة أمام كتلة أجار، وقطع الجانب إلى أسفل.
  5. تأكد من أن الجانب البطني من كل نصف الكرة الأرضية يلمس كتلة أجار. كتلة أجار يوفر دعما إضافيا أثناء القطع وضرورية لشرائح حتى. يجب أن تواجه الجوانب الظهرية لكل نصف الكرة الأرضية النصل. عندما لصقها على الجانب قطع، كل نصف الكرة الأرضية هو الموجهة بالنسبة إلى شفرة بطريقة تؤدي إلى شرائح عرضية من الحصين الظهرية في الموقع (الشكل 1B).
  6. غمر القرص مع نصفي الكرة الأرضية في غرفة القطع التي تحتوي على الجليد الباردة carbdG-aCSF.
  7. قطع 400 ميكرومتر المقاطع. وينبغي أن يتم قطع في أقل من 10 دقيقة. سوف تتطلب ميكروتومات مختلفة إعدادات مختلفة لتحقيق هذا الوقت. وسيتم الحصول على ما مجموعه 8\u201210 شرائح من منطقة الحصين الظهري.

4- التعافي

  1. نقل شرائح إلى غرفة الانتعاش التي تحتوي على aCSF carbogenated في درجة حرارة الغرفة باستخدام ماصات نقل المتاح مع نصائح قطع(الشكل 1C).
    ملاحظة: ينصح بشدة لتحصين غرفة الإنعاش-aSCF مع 5 mM Na-ascorbate و 3 mM Na-pyruvate. بيروفات هو الركيزة الطاقة أظهرت لتعزيز إنتاج ATP في شرائح28، في حين نا أسكوربات هو quencher الجذور الحرة29.
  2. احتضان في درجة حرارة الغرفة (22\u201224 درجة مئوية) لحوالي 2 ساعة قبل التسجيل (تصل إلى 4 ساعات).
    ملاحظة: يؤدي الاحتضان الأطول في درجة حرارة الغرفة إلى شرائح أكثر صحة لفترات زمنية أطول، مقارنة بحضانة الاحتضان القياسية عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة متبوعة باحتضان درجة حرارة الغرفة. يمكن إعادة توارنج في 37 درجة مئوية إدخال الوذمة السامة للخلايا13.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

طبقنا البروتوكول أعلاه لتوليد شرائح قرن آمون من CamKIIa-Cre+; WT الفئران على خلفية وراثية مختلطة C57Bl / 6 × SV / 129J، في P > 120. تظهر أعداد كبيرة من الخلايا الهرمية في حقل CA1(الشكل 2A)و subiculum(الشكل 2B)في تباين منخفض عندما لوحظ تحت المجهر التفاضلي للتباين تحت الحمراء (IR-DIC)، وهي ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ويوضح البروتوكول الموصوف هنا أن شرائح فرس النهر التي تم الحصول عليها من الفئران البالغة والشيخوخة يمكن أن تظل صحية وقابلة للحياة لساعات عديدة بعد القطع. الشرائح المعدة باستخدام هذا البروتوكول مناسبة لتسجيلات اللصق، وكذلك التسجيلات الميدانية طويلة الأمد في مناطق CA1.

هناك خ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

وليس لدى صاحب البلاغ ما يكشف عنه.

Acknowledgements

أشكر الدكتورة كارلا ج. شاتز على المشورة والدعم، والدكتورة باربرا ك. بروت وميشيل ك. دريس على قراءة المخطوطة بشكل نقدي. ويدعم العمل المعهد الوطني للصحة EY02858 ومنح مؤسسة ماذرز الخيرية إلى المركز.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
“60 degree” toolmade in-house
#10 scalpel bladeBard-Parker (Aspen Surgical)371110
1M CaCl2Fluka Analytical21114
95%O2/5%CO2Praxiar or another local supplier
Acepromazine maleate (AceproJect)Henry Schein5700850
AgarFisherBP1423-500
Beakers, measuring cylinders, reagent bottles
Brushes size 00-2Ted PellaCrafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella.
CCD cameraOlympusXM10
Choline bicarbonatePfalz & BauerC21240
Cyanoacrilate glueKrazy glueSingles
Decapitation scissorsFST14130-17
Feather bladesFeatherFA-10
Filter paper #2WhatmanEither rounds or pieces cut from a bigger sheet work well.
ForcepsA. Dumont & FilsInox 3c
Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) - porosity 3Robuglas.com18103 or 18113Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time.
GlucoseSigma-AldrichG8270
HClFisherA144SI-212
Ice buckets
KClSigma-AldrichP4504
Ketamine HCl (KetaVed)VEDCONDC 50989-996-06
KH2PO4Sigma-AldrichP0662
Leica Tissue slicer VT1000SThe cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2
Magnetic stirrers and stir bars
Mg2SO4 x 7H2OSigma-Aldrich230391
MgCl2Sigma-AldrichM9272
MilliQ water machineMilliporeSource for 18 Mohm water
Na-ascorbateSigma-AldrichA4035
Na-pyruvateSigma-AldrichP8574
NaClSigma-AldrichS3014
NaHCO3EMDSX0320-1
Needle 27G1/2
NMDGSigma-AldrichM2004
Paper tape
Peristaltic pumpCole-Parmer#7553-70
Peristaltic pump headCole-ParmerMasterflex #7518-00
Personna bladesPersonna double edgeAmazon
pH meter
Recovery chamberin-house made
Scalpel blade handle size 3Bard-Parker (Aspen Surgical)371030
Scissors angled bladeFST14081-09
Single edge industrial razor blade #9VWR55411
Spatulas
Transfer pipettesSamco Scientific225
Upright microscopeOlympus BX51WI
Xylazine HCl (XylaMed)VetOne510650

References

  1. Glanzman, D. L. The cellular mechanisms of learning in Aplysia: of blind men and elephants. Biological Bulletin. 210 (3), 271-279 (2006).
  2. Aitken, P. G., et al. Preparative methods for brain slices: a discussion. Journal of Neuroscince Methods. 59 (1), 139-149 (1995).
  3. Edwards, F. A., Konnerth, A. Patch-clamping cells in sliced tissue preparations. Methods in Enzymology. 207 (13), 208-222 (1992).
  4. Lowry, O. H., Passonneau, J. V., Hasselberger, F. X., Schulz, D. W. Effect of Ischemia on Known Substrates and Cofactors of the Glycolytic Pathway in Brain. Journal of Biological Chemistry. 239, 18-30 (1964).
  5. Lipton, P., Whittingham, T. S. The effect of hypoxia on evoked potentials in the in vitro hippocampus. Journal of Physiology. 287, 427-438 (1979).
  6. Lipton, P., Whittingham, T. S. Reduced ATP concentration as a basis for synaptic transmission failure during hypoxia in the in vitro guinea-pig hippocampus. Journal of Physiology. 325 (1), 51-65 (1982).
  7. Free Mandel, P. H.S. Free nucleotides of the brain in various mammals. Journal of Neurochemistry. 8, 116-125 (1961).
  8. Andjus, R. K., Dzakula, Z., Markley, J. L., Macura, S. Brain energetics and tolerance to anoxia in deep hypothermia. Annals of the New York Academy of Sciences. 1048, 10-35 (2005).
  9. Williams, G. D., Dardzinski, B. J., Buckalew, A. R., Smith, M. B. Modest hypothermia preserves cerebral energy metabolism during hypoxia-ischemia and correlates with brain damage: a 31P nuclear magnetic resonance study in unanesthetized neonatal rats. Pediatric Research. 42 (5), 700-708 (1997).
  10. Gasparini, S., Losonczy, A., Chen, X., Johnston, D., Magee, J. C. Associative pairing enhances action potential back-propagation in radial oblique branches of CA1 pyramidal neurons. Journal of Physiology. 580 (3), 787-800 (2007).
  11. Thomson, A. M., Bannister, A. P. Release-independent depression at pyramidal inputs onto specific cell targets: dual recordings in slices of rat cortex. Journal of Physiology. 519 (1), 57-70 (1999).
  12. Hille, B. The permeability of the sodium channel to organic cations in myelinated nerve. Journal of General Physiology. 58 (6), 599-619 (1971).
  13. Ting, J., Daigle, T., Chen, Q., Feng, G. Patch-Clamp Methods and Protocols. Martina, M., Taverna, S. 1183, Springer. Ch. 14 221-242 (2014).
  14. Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350 (6264), 1-10 (2015).
  15. Djurisic, M., Brott, B. K., Saw, N. L., Shamloo, M., Shatz, C. J. Activity-dependent modulation of hippocampal synaptic plasticity via PirB and endocannabinoids. Molecular Psychiatry. 24 (8), 1206-1219 (2019).
  16. Djurisic, M., et al. PirB regulates a structural substrate for cortical plasticity. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (51), 20771-20776 (2013).
  17. Vidal, G. S., Djurisic, M., Brown, K., Sapp, R. W., Shatz, C. J. Cell-Autonomous Regulation of Dendritic Spine Density by PirB. eNeuro. 3 (5), 1-15 (2016).
  18. Blot, A., Barbour, B. Ultra-rapid axon-axon ephaptic inhibition of cerebellar Purkinje cells by the pinceau. Nature Neuroscience. 17 (2), 289-295 (2014).
  19. Lammel, S., Ion, D. I., Roeper, J., Malenka, R. C. Projection-specific modulation of dopamine neuron synapses by aversive and rewarding stimuli. Neuron. 70 (5), 855-862 (2011).
  20. Ting, J. T., et al. Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method. Journal of Visual Experiments. (132), e53825(2018).
  21. Moyer, J. R., Brown, T. H. Methods for whole-cell recording from visually preselected neurons of perirhinal cortex in brain slices from young and aging rats. Journal of Neuroscience Methods. 86 (1), 35-54 (1998).
  22. Losonczy, A., Magee, J. C. Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Neuron. 50 (2), 291-307 (2006).
  23. Frick, A., Magee, J., Johnston, D. LTP is accompanied by an enhanced local excitability of pyramidal neuron dendrites. Nature Neuroscience. 7 (2), 126-135 (2004).
  24. Alvarado-Martinez, R., Salgado-Puga, K., Pena-Ortega, F. Amyloid beta inhibits olfactory bulb activity and the ability to smell. PLoS One. 8 (9), 75745(2013).
  25. Brooks, J. M., O'Donnell, P. Kappa Opioid Receptors Mediate Heterosynaptic Suppression of Hippocampal Inputs in the Rat Ventral Striatum. Journal of Neuroscience. 37 (30), 7140-7148 (2017).
  26. Goel, A., Lee, H. K. Persistence of experience-induced homeostatic synaptic plasticity through adulthood in superficial layers of mouse visual cortex. Journal of Neuroscience. 27 (25), 6692-6700 (2007).
  27. Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. Journal of Visual Experiments. (49), e2330(2011).
  28. Izumi, Y., Zorumski, C. F. Neuroprotective effects of pyruvate following NMDA-mediated excitotoxic insults in hippocampal slices. Neuroscience Letters. 478 (3), 131-135 (2010).
  29. Hajos, N., Mody, I. Establishing a physiological environment for visualized in vitro brain slice recordings by increasing oxygen supply and modifying aCSF content. Journal of Neuroscience Methods. 183 (2), 107-113 (2009).
  30. Fiala, J. C., Spacek, J. Hippocampus Rat. , Available from: https://synapseweb.clm.utexas.edu/hippocampus-rat (1999).
  31. Combe, C. L., Canavier, C. C., Gasparini, S. Intrinsic Mechanisms of Frequency Selectivity in the Proximal Dendrites of CA1 Pyramidal Neurons. Journal of Neuroscience. 38 (38), 8110-8127 (2018).
  32. Rothman, S. M. The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx. Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

161 ATP NMDG CA1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved