Minimierung der Hypoxie in Hippocampal Scheiben von erwachsenen und alternden Mäusen

Zusammenfassung

Dies ist ein Protokoll zur akuten Scheibenpräparation von erwachsenen und alternden Maus Hippocampi, die Vorteile der transkardialen Perfusion und Schneiden schneiden mit eiskalten NMDG-aCSF nutzt, um hypoxische Schäden am Gewebe zu reduzieren. Die resultierenden Scheiben bleiben über viele Stunden gesund und eignen sich für Langzeit-Patch-Clamp- und Field-Recordings.

Zusammenfassung

Akute Hippocampus-Scheiben haben es Generationen von Neurowissenschaftlern ermöglicht, synaptische, neuronale und Schaltkreiseigenschaften im Detail und mit hoher Genauigkeit zu erforschen. Die Erforschung von LTP- und LTD-Mechanismen, eine einzelne neurondendritische Berechnung und erfahrungsabhängige Veränderungen in den Schaltkreisen wären ohne diese klassische Zubereitung nicht möglich gewesen. Jedoch, mit wenigen Ausnahmen, die meisten Grundlagenforschung mit akuten Hippocampus Scheiben wurde mit Scheiben von Nagetieren relativ jungen Alters durchgeführt, P20-P40, obwohl synaptische und intrinsische Erregbarkeitsmechanismen haben einen langen Entwicklungsschwanz, der über P60 reicht. Der Hauptreiz der Verwendung von jungen Hippocampus-Scheiben ist die Erhaltung der neuronalen Gesundheit durch höhere Toleranz gegenüber hypoxischen Schäden unterstützt. Es ist jedoch notwendig, die neuronale Funktion in reiferen Entwicklungsstadien zu verstehen, was durch die Entwicklung verschiedener Tiermodelle neurodegenerativer Erkrankungen, die eine alternde Gehirnpräparation erfordern, noch verstärkt wird. Hier beschreiben wir eine Modifikation zu einem akuten Hippocampus-Scheibenpräparat, das zuverlässig gesunde Scheiben von erwachsenen und alternden Maus-Hippocampi liefert. Die entscheidenden Schritte des Protokolls sind die transkardiale Perfusion und das Schneiden mit eiskaltem natriumfreiem NMDG-aSCF. Zusammen dämpfen diese Schritte den Hypoxie-induzierten Rückgang des ATP bei enthauptender Enthauptung sowie zytotoxische Ödeme, die durch passive Natriumflüsse verursacht werden. Wir zeigen, wie man transversale Scheiben von Hippocampus plus Kortex mit einem vibrierenden Mikrotom schneidet. Akute Hippocampus-Scheiben, die auf diese Weise erhalten werden, sind über viele Stunden der Aufnahme zuverlässig gesund und eignen sich sowohl für Feldaufnahmen als auch für gezielte Patch-Clamp-Aufnahmen, einschließlich der Ausrichtung auf fluoreszierend markierte Neuronen.

Einleitung

Das Aufkommen von akuten Hirnscheibenpräparaten von Säugetieren erleichterte Experimente auf zellulärer und synaptischer Ebene, die bisher nur in wirbellosen Präparaten wie Aplysia¹möglich waren. Die Entwicklung von akuten Hippocampus-Scheiben war von besonderer Bedeutung, da es sich um eine Struktur handelt, die für die Arbeitsgedächtnis- und Kontextbildung verantwortlich ist, und eine spezialisierte tri-synaptische Schaltung hat, die für eine einfache physiologische Manipulation zugänglich ist. Jedoch, die überwiegende Mehrheit der akuten Gehirnscheiben sind immer noch von relativ jungen Mäusen und Ratten vorbereitet, da es einfacher ist, gesunde Neuronen und Schaltkreise zu erhalten, und die Scheiben bleiben lebensfähig für längere Zeit^2,3,4. Hier führen wir Änderungen an Standard-Slicing-Protokollen ein, die zu einer erhöhten Lebensfähigkeit von akuten Hippocampus-Scheiben von erwachsenen und alternden Mäusen führen.

Das Haupthindernis für die langfristige Ex-vivo-Lebensfähigkeit des Säugetierhirnparenchyms ist die anfängliche hypoxische Schädigung, die schnell auftritt, sobald der Blutfluss zum Gehirn nach der Enthauptung aufhört. Der Verlust von Sauerstoff führt zu einem schnellen metabolischen Verbrauch wichtiger Energieressourcen im Gehirn, wobei der Verlust von Phospho-Kreatin (P-Kreatin) am schnellsten ist, gefolgt von Glukose, Adenosintriphosphat (ATP) und Glykogen⁴. Die Erhaltung von ATP ist von besonderer Bedeutung für die langfristige Gesundheit von Hirnscheiben, da ATP benötigt wird, um das Membranpotenzial über die Na-K ATPase und damit die neuronale Aktivität^5,6zu erhalten. Der ATP-Spiegel im erwachsenen Nagetierhirn beträgt 2,5 mM, und er fällt steil innerhalb von 20 s der Enthauptung ab, um einen basalen stationären Zustand (0,5 mM) bei etwa 1 min nach der Enthauptung^4,7,8zu erreichen. Bei Jungtieren dauert es länger, den gleichen Rückgang der ATP zu beobachten (ca. 2 min); mit Phenobarbitalanästhesie wird es weiter auf 4 min⁴verlangsamt. Diese Überlegungen zeigen, dass die Verhinderung des Verlusts von ATP und anderen Energieressourcen eine notwendige Strategie ist, um hypoxische Schädigungen des Gehirns zu verhindern und im Gegenzug die Gesundheit von Gehirnscheiben über längere Zeiträume, insbesondere bei erwachsenen Tieren, aufrechtzuerhalten.

Niedrige Temperaturen verlangsamen den Stoffwechsel. Daher wurde nachgewiesen, dass eine bescheidene Unterkühlung die Energiereserven des Gehirns schützt: Bei Jungen Tieren, die die Körpertemperatur um sechs Grad von 37 °C auf 31 °C senken, bleibt der ATP-Gehalt auf etwa 80 % des normalen Niveaus über 4 h der kontrollierten Hypoxie⁹erhalten. Die P-Kreatin-Spiegel sind in ähnlicher Weise erhalten, ebenso wie das Gesamtphosphorylierungspotential⁹. Dies deutet darauf hin, dass die Senkung der Körpertemperatur vor der Enthauptung neuroprotektive sein könnte, da fast normale NIVEAUS von ATP durch die Schnitt- und Slice-Recovery-Perioden aufrechterhalten werden könnten.

In dem Maße, in dem ein ATP-Tropfen bei Enthauptung nicht vollständig verhindert werden kann, wird eine teilweise beeinträchtigte Funktion des Na-K ATPase erwartet, gefolgt von einer Depolarisation über passiven Natriumzufluss. Da auf den passiven Natriumzufluss wasserdurchströmt wird, verursacht er zytotoxische Ödeme und schließlich Pyknose. Bei erwachsenen Ratten war das Ersetzen von Na+-Ionen durch Saccharose in Slice-Cutting-Lösungen eine erfolgreiche Strategie, um die Belastung durch zytotoxische Ödeme zu lindern^10,11. In jüngerer Zeit haben methylierte organische Kationen, die die Natriumkanaldurchlässigkeit¹² verringern, gezeigt, dass sie einen wirksameren Schutz als Saccharose bieten, insbesondere in Scheiben von erwachsenen Mäusen, wobei N-Methyl-D-Glucamine (NMDG) in verschiedenen Altersgruppen und Gehirnregionen am weitesten verbreitet ist^13,14,15,16.

Zahlreiche Brain-Slicing-Protokolle beinhalten die Verwendung kalter Temperaturen nur während des Slice-Cutting-Schritts, manchmal in Kombination mit DerN⁺ Ionen-Ersatzstrategie^16,17. Bei Jungen Tieren scheinen diese Protokolle ausreichend Neuroprotektion zu bieten, da die Gehirne nach der Enthauptung schnell extrahiert werden können, da der Schädel noch dünn und leicht zu entfernen ist³. Diese Strategie produziert jedoch keine gesunden Scheiben von erwachsenen Tieren. Im Laufe der Zeit haben eine Reihe von Laboratorien, die erwachsene Nagetiere untersuchen, eine transkardiale Perfusion mit einer eiskalten Lösung eingeführt, um die Körpertemperatur des Tieres und damit hypoxische Schädigungen des Gehirns vor der Enthauptung zu verringern. Dieses Verfahren wurde erfolgreich angewendet, um Kleinhirnscheiben¹⁸, Midbrain Scheiben¹⁹, neokortikale Scheiben^11,20, perirhinal cortex²¹, rat hippocampus^10,22,23, olfaktorische Glühbirne²⁴, ventrales Striatum²⁵, visuelle Kortex²⁶.

Trotz der Vorteile, die die transkardiale Perfusion und der Na⁺ Ionenersatz bei der Vorbereitung von Scheiben von Ratten und in einigen Hirnregionen bei Mäusen bieten, bleibt der Hippocampus der Maus einer der schwierigsten Bereiche, um vor Hypoxie zu schützen^13,20. Bis heute beinhaltet einer der häufigsten Ansätze, Hippocampus aus alternden Mäusen und Mausmodellen der Neurodegeneration zu schneiden, das klassische schnelle Schneiden des isolierten Hippocampi²⁷. In dem hier beschriebenen Protokoll minimieren wir den Verlust von ATP im erwachsenen Gehirn, indem wir Hypothermie vor der Enthauptung einführen, indem wir das Tier transkardial mit eiskaltem Na⁺- freier künstlicher NMDG-basierter künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (NMDG-aCSF) durchdringen. Die Scheiben werden dann in eiskalten Na⁺-free NMDG-aCSF geschnitten. Mit diesem verbesserten Protokoll erhalten wir akute Hippocampus-Scheiben von erwachsenen und alternden Mäusen, die nach dem Schneiden bis zu 10 h gesund sind und für langzeitige Feldaufnahmen und Patch-Clamp-Studien geeignet sind.

Protokoll

Das Protokoll wird in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt und vom Stanford University Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt. Die Methoden entsprechen auch der Politik der Gesellschaft für Neurowissenschaften über den Einsatz von Tieren und Menschen in der neurowissenschaftlichen Forschung.

HINWEIS: Alle Mäuse wurden in einer pathogenenfreien Umgebung gehalten. Wildtyp-Mäuse auf gemischtem C57Bl/ 6 x SV/ 129J genetischem Hintergrund wurden hier verwendet, sofern nicht anders angegeben.

1. Setup

1. Bereiten Sie 1 L von 1x aCSF (in mM): 125 NaCl, 26 NaHCO₃, 2.3 KCl, 1.26 KH₂PO₄, 1.3 Mg₂SO_{4 '7H2}O, 2.5 CaCl₂, 25 Glucose (Tabelle 1). Verwenden Sie diese Lösung für die Rückgewinnungskammer und nachfolgende Aufnahmen.
   HINWEIS: Bewahren Sie aCSF als 10-fache Lagerlösung auf, die NaCl, NaHCO₃, KCl und KH₂PO₄enthält. Bewahren Sie Mg₂SO₄7H₂O und CaCl₂ als 1 M Lagerlösungen auf. Bereiten Sie die Arbeitslösung am Tag des Experiments aus den oben genannten Stocklösungen vor, und fügen Sie Glukose hinzu, bevor Sie das Endvolumen mit 18 Mio. Wasser anpassen.
   HINWEIS: Je nach Hirnregion oder Mausstamm kann gekühltes aCSF auch für die transkardiale Perfusion mit Erfolg^11,15,26verwendet werden.
2. Bereiten Sie 300 ml NMDG-aCSF (in mM): 135 NMDG, 1 KCl, 1.2 KH₂PO₄, 1.5 MgCl₂, 0.5 CaCl₂, 20 Cholinbicarbonat, 10 Glucose (Tabelle 1). Dieses Volumen von NMDG-aCSF reicht sowohl für die transkardiale Perfusion als auch für die Schneideschritte aus.
   HINWEIS: NMDG-aCSF als 3x Lagerlösung bei 4 °C lagern. Vorbereiten der Arbeitslösung am Tag des Experiments; Cholin-Bicarbonat und Glukose hinzufügen, bevor Sie das Endvolumen mit 18 Mio. Wasser einstellen. Blasen Sie die Lösung mit 95%O₂/5%CO2, um sie zu puffern, und sättigen Sie sie mit Sauerstoff.₂
   HINWEIS: Der NMDG-Bestand beginnt als hochalkalisch und benötigt konzentrierte Salzsäure (HCl), um den pH-Wert auf 7,4 Dollar einzustellen. Die Zugabe von Salzsäure sollte langsam sein, sobald sie unter pH 8 liegt, da es leicht ist, die Lösung mit überschüssigem HCl auf pH 3 zu säuern. Diese Anpassung sollte vor dem Hinzufügen von divalenten Kationen erfolgen. Dieses NMDG-aCSF Rezept ist natriumfrei. Zuvor veröffentlichte NMDG-Rezepte verwenden 30 mM NaHCO₃ für die Pufferung, was zu 30 mM Natrium in NMDG-aCSF^13,20führt.
3. Stellen Sie das vibrierende Mikrotom-Schneidfach und die Montagescheibe auf -20 °C ein.
4. Bereiten Sie die Rückgewinnungskammer vor.
   1. Füllen Sie die Rückgewinnungskammer bis knapp über dem Scheibenhaltenetz, halten Sie sie bei Raumtemperatur auf der Bank und blasen Sie sie.
      HINWEIS: Die hier verwendete Scheibenrückgewinnungskammer ist den klassischen Kammern, die zuvor von Edwards und Konnerth³beschrieben wurden, sehr ähnlich. aCSF wird in einem Glasbecher (400 ml) aufbewahrt, der einen runden Acrylrahmen mit schwarzem Nylongewebe hält, das an den Boden geklebt ist. Der Acrylrahmen wird in der Mitte des Bechers über einen Acrylhaken über den Rand des Bechers aufgehängt. Die Glasblase wird bis zum Boden eingelegt. Das Design ermöglicht die Sauerstoffversorgung beider Scheibenseiten. Bubbling sorgt auch für eine konstante Vermischung eines CSF in der Rückgewinnungskammer. Das schwarze Netz bietet einen hohen Kontrast zu den nicht-weißen Scheiben, die dann leichter zu sehen sind.
5. Bereiten Sie die transkardiale Perfusion und Schneidlösung vor.
   1. Kühlen Sie die gesamten 300 ml NMDG-aCSF in einem Gefrierschrank ab, bis sich Eiskristalle an der Oberfläche und an den Wänden der Flasche zu bilden beginnen. Nicht überfrieren!
   2. Die Flasche mit gekühltem NMDG-aCSF auf Eis und Blase legen. Die Lösung sollte zwischen 0 und 20122 °C liegen.
      HINWEIS: Slushy NMDG- aCSF impliziert, dass der größte Teil der Lösung als Flüssigkeit, während ein kleiner Bruchteil des schlammigen Eises vorhanden wird die Lösung in der Nähe von 0 °C während der Perfusion und Schneiden zu halten. Es sollte darauf geachtet werden, Eiskristalle beim Schneiden vom Gehirn fernzuhalten.
6. Bereiten Sie die Gewebemontagescheibe vor.
   1. Nehmen Sie die Scheibe aus dem Gefrierschrank, wischen Sie sie bei Bedarf trocken.
   2. Schneiden Sie einen Block von 5% Agar aus der zuvor vorbereiteten Agarplatte aus und kleben Sie ihn in der Mitte der Scheibe mit einer dünnen Schicht Cyanoacrylatkleber. Das Agar-Stück sollte etwa so groß sein wie ein Maushirn. Legen Sie die Scheibe mit geklebtem Agar auf Eis und decken Sie sie mit Papiertüchern ab, bis sie einsatzbereit ist.
      1. Für 5% Agarplatte 5 g Agar in 100 ml 18 M'Wasser durch Mikrowaving auflösen und in eine saubere Petrischale gießen. Bei 4 °C aufbewahren.
7. Nehmen Sie die Schneidschale aus dem Gefrierschrank, legen Sie sie in das Mikrotom, umgeben Sie sie mit Eis und laden Sie die Klinge.

2. Transkardiale Perfusion und Hirnextraktion

1. Überdosierung von Mäusen über eine intraperitoneale Injektion von Anästhetikum. Überprüfen Sie die Anästhesietiefe, indem Sie den Schmerzreflex (Zehenkneife) überprüfen; eine Maus sollte den Reflex nicht aufweisen, sobald sie eine tiefe Anästhesie erreicht hat.
   HINWEIS: Nagetieranästhesie-Cocktail-Rezept: Ketamin HCl (66 mg/ml), Xylazin HCl (6,6 mg/ml), Acepromazin-Maleat (0,1 mg/ml), 18 Mio. Wasser bis zum Endvolumen. Dosis: 0,4 mg/g Körpergewicht, 0,04 mg/g Körpergewicht, 6 x 10^-4 mg/g Körpergewicht für Ketamin, Xylazin bzw. Acepromazin.
2. Richten Sie die peristaltische Pumpe für die transkardiale Perfusion ein. Legen Sie eine Seite des Pumpenschlauchs mit vereistem NMDG-aCSF in die Flasche ein. Passen Sie die andere Seite des Schlauches mit der 27 G Nadel an, die in den linken Ventrikel eingeführt wird.
3. Stellen Sie die Pumpendrehzahl auf ca. 3,5 ml/min ein. Bei dieser Geschwindigkeit ist der Abfluss von NMDG-aCSF ein schneller Tropf, nicht kontinuierlicher Fluss.
   HINWEIS: Die Perfusion durch Schwerkraft ist ein guter Ersatz für die peristaltische Pumpenperfusion, solange die gleiche ungefähre Durchflussrate erreicht werden kann. Eine Perfusion mit hoher Durchflussrate führt zu geplatzten Blutgefäßen im Gehirn. Ein verräterisches Zeichen einer zu schnellen Perfusion und eines erhöhten Drucks in den Blutgefäßen ist die Lösung, die aus der Nase des Tieres kommt.
4. Perfusion
   1. Legen Sie die richtig anästhesierte Maus auf den Rücken auf eine Windel. Mit Papierband, Klebeband nach unten seine Vorder- und Hinterbeine, so dass die Brust und Bauch ausgesetzt sind.
   2. Schneiden Sie einen großen Fleck der Haut auf der Brust, von unterhalb des Brustbeins bis zum Hals gehen; dies sollte einen großen Arbeitsbereich bieten. Schnappen Sie sich das Brustbein mit Zange, heben Sie sanft, und beginnen Sie, durch den Rippenkäfig auf beiden Seiten zu schneiden, bis die Brusthöhle ausgesetzt ist.
   3. Schneiden Sie durch das Zwerchfell, um die Brusthöhle freizulegen. Die Klappe des Rippenkäfigs sollte über ein dünnes Stück Muskel befestigt werden. Es sollte möglich sein, es auf eine Seite zu stellen, ohne dass es auf die exponierte Brusthöhle zurückfällt. Prüfen Sie, ob das Herz immer noch schlägt. Stellen Sie sicher, dass der größte Teil der Leber sichtbar ist.
   4. Setzen Sie die 27 G Nadel in den linken Ventrikel ein; Der linke Ventrikel der Maus sieht in der Farbe heller aus als der rechte. Suchen Sie das dunkelrot gefärbte rechte Atrium. Schneiden Sie durch das rechte Atrium mit einer kleinen Schere; das Blut sollte zu fließen beginnen.
   5. Starten Sie die Pumpe, die auf die richtige Durchflussgeschwindigkeit voreingestellt wurde. Wenn alles richtig gemacht wurde, sollte die Leber beginnen, die Farbe von rot zu braun kurz nach Beginn der Perfusion zu ändern. Überwachen Sie die Leberfarbe, um die Länge der Perfusion zu bestimmen; die Leber sollte blassbraun werden.
   6. Führen Sie die Pumpe noch einige Minuten aus. Bei Verwendung des Rektalthermometers sollte die Körpertemperatur auf 28 bis 20129 °C sinken, und die Nase des Tieres sollte kalt sein.
5. Gehirnextraktion.
   HINWEIS: Für diesen Schritt, halten Sie die folgenden Sezierwerkzeuge bereit: Enthauptungsschere, kleine Schere mit gerader oder abgewinkelter Klinge, Skalpell und #10 Klinge, einrandige Klinge, #3 Zange, Spachtel mit einer Seite auf 90° gebogen, ein Spachtel, ein "60°" Werkzeug (Abbildung 1A,B), und eine kleine weiche Bürste.
   1. Enthaupten Sie die Maus mit einer großen Enthauptungsschere. Mit einem Skalpell mit #10 Klinge, schneiden Sie die Haut auf dem Schädel. Mit einer kleinen abgewinkelten Schere den Schädel an der Mittellinie schneiden. Als nächstes, mit dem #3 Zange, hebeln Sie die rechte und linke Hälfte des Schädels, vorsichtig, um die Dura mit ihm zu nehmen. Das Gehirn sollte jetzt exponiert werden.
      HINWEIS: Wenn sich die Dura vom Schädel löst, bleibt sie über dem Gehirn und muss separat entfernt werden. Die Ränder der verbleibenden Dura können sich anziehen und tief durch das Gehirn schneiden, wodurch die Hirnregion von Interesse potenziell geschädigt wird.
   2. Entfernen Sie das Gehirn, indem Sie es mit einem kleinen Spachtel aushöhlen. Lassen Sie das Gehirn in die NMDG-aCSF-Lösung fallen, die in einem separaten kleinen Becher auf Eis gelegt wird. Lassen Sie es dort für bis zu einer Minute.
      HINWEIS: Neben der Unterkühlung straft die Exposition gegenüber der eiskalten Herzlinie das Gehirn, was für gleichmäßiges Schneiden notwendig ist. Das gesamte Verfahren von der Enthauptung bis zur Gehirnextraktion sollte unter 30 s sein.

3. Schneiden

1. Nehmen Sie das Gehirn aus dem NMDG-aCSF und legen Sie es auf ein Stück Filterpapier.
2. Schneiden und entfernen Sie einen 60° Keil aus dem rostralen Ende des Vorderhirns mit einem "60°" Werkzeug zentriert an der Mittellinie. Schnittflächen werden für die Montage verwendet, um den richtigen Winkel für transversale Hippocampusscheiben zu erreichen, wie unten beschrieben (Abbildung 1A,B).
   HINWEIS: Zwei einschneidige Klingen, die über einen selbstgeschneiderten Halter zusammengehalten werden, machen ein einfach zu bedienendes Werkzeug für den 60°-Schnitt (Abbildung 1A).
3. Trennen Sie Hemisphären auf der Mittellinie mit dem Skalpell.
4. Kleben Sie die Hemisphären wie folgt auf die Montagescheibe. Nehmen Sie die Montagescheibe, die bisher auf Eis war. Bei Bedarf wieder trocknen. Kleben Sie jede Hemisphäre vor dem Agarblock, seitlich nach unten schneiden.
5. Stellen Sie sicher, dass die ventrale Seite jeder Hemisphäre den Agarblock berührt. Der Agarblock bietet zusätzliche Unterstützung beim Schneiden und ist für gleichmäßige Scheiben unerlässlich. Dorsale Seiten jeder Hemisphäre sollten der Klinge zugewandt sein. Wenn sie auf die geschnittene Seite geklebt wird, wird jede Hemisphäre relativ zur Klinge in einer Weise ausgerichtet, die zu queren Scheiben des dorsalen Hippocampus in situ führt (Abbildung 1B).
6. Untertauchen Sie die Scheibe mit Hemisphären in eine Schneidkammer mit eiskaltem, kariertem NMDG-aCSF.
7. Schneiden Sie 400 m Abschnitte. Schneiden sollte in weniger als 10 min erfolgen. Verschiedene Mikrotome benötigen unterschiedliche Einstellungen, um diese Zeit zu erreichen. Insgesamt werden 8-u201210 Scheiben aus der dorsalen Hippocampus-Region erhalten.

4. Wiederherstellung

1. Mit Einweg-Transferpipetten mit Trennspitzen in eine Rückgewinnungskammer mit kariertem ACSF bei Raumtemperatur übertragen (Abbildung 1C).
   HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, die Rückgewinnungskammer-aSCF mit 5 mM Na-Ascorbat und 3 mM Na-Pyruvat zu stärken. Pyruvat ist ein Energiesubstrat, das gezeigt wird, um die Produktion von ATP in Scheiben²⁸zu steigern, während Na-Ascorbat ein freiradikaler Quencher²⁹ist.
2. Bei Raumtemperatur (22-u201224 °C) ca. 2 h vor aufnahmeweise (bis zu 4 h) inkubieren.
   HINWEIS: Eine längere Inkubation bei Raumtemperatur führt zu gesünderen Scheiben über einen längeren Zeitraum, im Vergleich zur Standardinkubation bei 37 °C für 30 min, gefolgt von einer Raumtemperaturinkubation. Eine Wiedererwärmung bei 37 °C kann ein zytotoxisches Ödem¹³einleiten.

Ergebnisse

Wir haben das obige Protokoll angewendet, um Hippocampus-Slices aus CamKIIa-Cre+ zu erzeugen; WT-Mäuse mit gemischtem genetischem Hintergrund C57Bl/ 6 x SV/ 129J, bei P > 120. Eine große Anzahl von Pyramidenzellen im CA1-Feld (Abbildung 2A) und Subikulum (Abbildung 2B) erscheinen in geringem Kontrast, wenn sie unter infraroter Differentialkontrastmikroskopie (IR-DIC) beobachtet werden, einem Kennzeichen gesunder Zellen in einer Scheibenpräparation. Mit dieser...

Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll zeigt, dass Hippocampus-Scheiben, die von erwachsenen und alternden Mäusen erhalten werden, nach dem Schneiden für viele Stunden gesund und lebensfähig bleiben können. Die mit diesem Protokoll vorbereiteten Slices eignen sich für Patch-Clamp-Aufnahmen sowie für langlebige Feldaufnahmen in den CA1-Regionen.

Dieses Protokoll besteht aus zwei wichtigen Schritten. Der erste Schritt ist der transkardiale Perfusionsschritt mit einer eiskalten Lösung. Schnelle B...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
“60 degree” tool	made in-house
#10 scalpel blade	Bard-Parker (Aspen Surgical)	371110
1M CaCl2	Fluka Analytical	21114
95%O2/5%CO2	Praxiar or another local supplier
Acepromazine maleate (AceproJect)	Henry Schein	5700850
Agar	Fisher	BP1423-500
Beakers, measuring cylinders, reagent bottles
Brushes size 00-2	Ted Pella		Crafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella.
CCD camera	Olympus	XM10
Choline bicarbonate	Pfalz & Bauer	C21240
Cyanoacrilate glue	Krazy glue		Singles
Decapitation scissors	FST	14130-17
Feather blades	Feather	FA-10
Filter paper #2	Whatman		Either rounds or pieces cut from a bigger sheet work well.
Forceps	A. Dumont & Fils	Inox 3c
Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) - porosity 3	Robuglas.com	18103 or 18113	Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time.
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
HCl	Fisher	A144SI-212
Ice buckets
KCl	Sigma-Aldrich	P4504
Ketamine HCl (KetaVed)	VEDCO	NDC 50989-996-06
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662
Leica Tissue slicer VT1000S			The cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2
Magnetic stirrers and stir bars
Mg2SO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	230391
MgCl2	Sigma-Aldrich	M9272
MilliQ water machine	Millipore		Source for 18 Mohm water
Na-ascorbate	Sigma-Aldrich	A4035
Na-pyruvate	Sigma-Aldrich	P8574
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
NaHCO3	EMD	SX0320-1
Needle 27G1/2
NMDG	Sigma-Aldrich	M2004
Paper tape
Peristaltic pump	Cole-Parmer	#7553-70
Peristaltic pump head	Cole-Parmer	Masterflex #7518-00
Personna blades		Personna double edge	Amazon
pH meter
Recovery chamber	in-house made
Scalpel blade handle size 3	Bard-Parker (Aspen Surgical)	371030
Scissors angled blade	FST	14081-09
Single edge industrial razor blade #9	VWR	55411
Spatulas
Transfer pipettes	Samco Scientific	225
Upright microscope	Olympus BX51WI
Xylazine HCl (XylaMed)	VetOne	510650