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  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este es un protocolo para la preparación aguda de la rebanada de hipocampo adulto y envejecido del ratón que aprovecha la perfusión transcardial y el corte de rodajas con NMDG-aCSF helado para reducir el daño hipoxico al tejido. Las rebanadas resultantes se mantienen saludables durante muchas horas y son adecuadas para grabaciones de parches y de campo a largo plazo.

Resumen

Las rebanadas agudas del hipocampo han permitido a generaciones de neurocientíficos explorar las propiedades sinápticas, neuronales y de circuito en detalle y con alta fidelidad. La exploración de los mecanismos LTP y LTD, el cálculo dendrítico de una sola neurona y los cambios dependientes de la experiencia en los circuitos, no habrían sido posibles sin esta preparación clásica. Sin embargo, con algunas excepciones, la mayoría de las investigaciones básicas utilizando rodajas agudas de hipocampo se han realizado utilizando rebanadas de roedores de edades relativamente jóvenes, P20-P40, a pesar de que los mecanismos de excitabilidad sináptica e intrínseca tienen una larga cola de desarrollo que supera el P60. El principal atractivo del uso de rebanadas de hipocampo joven es la preservación de la salud neuronal ayudada por una mayor tolerancia al daño hipoxico. Sin embargo, hay una necesidad de entender la función neuronal en etapas más maduras de desarrollo, acentuado aún más por el desarrollo de varios modelos animales de enfermedades neurodegenerativas que requieren una preparación cerebral envejecida. Aquí describimos una modificación a una preparación aguda de la rebanada del hipocampo que entrega de forma fiable rebanadas saludables de hipocampos adultos y de ratón envejecido. Los pasos críticos del protocolo son la perfusión transcardial y el corte con NMDG-aSCF sin sodio helado. Juntos, estos pasos atenúan la caída inducida por hipoxia en ATP tras la decapitación, así como el edema citotóxico causado por los flujos pasivos de sodio. Demostramos cómo cortar rodajas transversales de hipocampo más corteza usando un microtoma vibratorio. Las rebanadas agudas del hipocampo obtenidas de esta manera son confiablemente saludables durante muchas horas de grabación, y son apropiadas tanto para grabaciones de campo como para grabaciones dirigidas de abrazaderas de parches, incluida la segmentación de neuronas con la etiqueta fluorescente.

Introducción

El advenimiento de las preparaciones agudas de la rebanada cerebral de los mamíferos facilitó experimentos a nivel celular y sináptico que antes sólo eran posibles en preparaciones de invertebrados como Aplysia1. El desarrollo de rebanadas agudas del hipocampo fue de particular importancia, ya que es una estructura responsable de la memoria de trabajo y la formación de contexto, y tiene un circuito trisináptico especializado que es amenable a la manipulación fisiológica fácil. Sin embargo, la gran mayoría de las rebanadas cerebrales agudas todavía se preparan a partir de ratones y ratas relativamente jóvenes, ya que es más fácil preservar las neuronas y circuitos sanos, y las rebanadas siguen siendo viables durante períodos más largos de tiempo2,,3,,4. Aquí, introducimos modificaciones en los protocolos de corte estándar que resultan en una mayor viabilidad de las rodajas agudas del hipocampo de ratones adultos y envejecidos.

El principal impedimento para la viabilidad ex vivo a largo plazo del parénquima cerebral de los mamíferos es el daño hipoxico inicial que ocurre rápidamente una vez que el flujo sanguíneo al cerebro deja de disminuir. La pérdida de oxígeno resulta en un consumo metabólico rápido de los principales recursos energéticos en el cerebro con la pérdida de fosfo-creatina (P-creatina) siendo el más rápido, seguido de glucosa, trifosfato de adenosina (ATP), y glucógeno4. La preservación de ATP es de particular importancia para la salud a largo plazo de las rebanadas cerebrales, ya que el ATP es necesario para mantener el potencial de membrana a través de la ATPase Na-K, y en consecuencia la actividad neuronal5,6. El nivel de ATP en el cerebro de los roedores adultos es de 2,5 mM, y cae precipitadamente dentro de 20 s de decapitación para alcanzar un estado estacionario basal (0,5 mM) en alrededor de 1 min después de la decapitación4,7,8. En animales jóvenes, se tarda más en observar la misma caída en ATP (2 min); con anestesia fenobarbital se ralentiza aún más a 4 min4. Estas consideraciones muestran que prevenir la pérdida de ATP y otros recursos energéticos es una estrategia necesaria para prevenir el daño hipoxico al cerebro y a su vez para mantener la salud de las rebanadas cerebrales durante períodos más largos de tiempo, especialmente en animales adultos.

Las bajas temperaturas ralentizan el metabolismo. Por lo tanto, se ha demostrado que la hipotermia modesta protege las reservas de energía cerebral: en animales jóvenes, reduciendo la temperatura corporal en seis grados, de 37 oC a 31 oC, preserva los niveles de ATP a alrededor del 80% de los niveles normales durante 4 h de hipoxia controlada9. Los niveles de P-creatina se conservan de manera similar, así como el potencial general de fosforilación9. Esto sugiere que bajar la temperatura corporal antes de la decapitación podría ser neuroprotector, como niveles casi normales de ATP podrían mantenerse a través de los períodos de corte por rebanada y recuperación de la rebanada.

En la medida en que una caída de ATP no se puede prevenir completamente tras la decapitación, se espera una función parcialmente deteriorada de la ATPase Na-K, seguida de la despolarización a través de la afluencia pasiva de sodio. Como la afluencia pasiva de sodio es seguida por la entrada de agua en las células, causa edema citotóxico y eventualmente piknosis. En ratas adultas, la sustitución de iones Na+ por sacarosa en soluciones de corte por rodajas ha sido una estrategia exitosa para aliviar la carga del edema citotóxico10,11. Más recientemente, los cationes orgánicos metilados que disminuyen la permeabilidad del canal de sodio12 han demostrado ofrecer una protección más eficaz que la sacarosa, especialmente en rodajas de ratones adultos, siendo N-metil-D-glucamina (NMDG) más ampliamente aplicable en diferentes edades y regiones cerebrales13,,14,,15,,16.

Numerosos protocolos de corte cerebral implican el uso de temperaturas frías sólo durante el paso de corte por rebanadas, a veces en combinación con La estrategia de reemplazo de Na+ ion16,17. En animales jóvenes, estos protocolos parecen ofrecer suficiente neuroprotección ya que los cerebros se pueden extraer rápidamente después de la decapitación porque el cráneo es todavía delgado y fácil de eliminar3. Sin embargo, esta estrategia no produce rebanadas saludables de animales adultos. Con el tiempo, varios laboratorios que estudian roedores adultos han introducido la perfusión transcardial con una solución helada para disminuir la temperatura corporal del animal, y por lo tanto daño hipoxico al cerebro, antes de la decapitación. Este procedimiento se aplicó con éxito para producir rodajas cerebelosas18, rodajas de cerebro medio19, rodajas neocorticales11,20, corteza perirhinal21, hipocampo de rata10,22,23, bulbo olfativo24, estriado ventral25, corteza visual26.

A pesar de las ventajas que ofrece la perfusión transcardial y el reemplazo de iones Na+ en la preparación de rodajas de rata y en algunas regiones cerebrales en ratones, el hipocampo de ratón sigue siendo una de las zonas más desafiantes para protegerse de la hipoxia13,,20. Hasta la fecha, uno de los enfoques más comunes para cortar el hipocampo de ratones envejecidos y modelos de ratón de neurodegeneración implica el corte rápido clásico del hipocampo aislado27. En el protocolo descrito aquí, minimizamos la pérdida de ATP en el cerebro adulto mediante la introducción de hipotermia antes de la decapitación perfundiendo transcardimente al animal con el frío helado Na+- fluido cefalorraquídeo artificial basado en NMDG libre (NMDG-aCSF). Las rebanadas se cortan en Na+libre de hielo NMDG-aCSF. Con este protocolo mejorado obtenemos rebanadas agudas de hipocampo de ratones adultos y envejecidos que son saludables hasta 10 h después del corte y son apropiados para grabaciones de campo a largo plazo y estudios de parches.

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Protocolo

El protocolo se lleva a cabo de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud y aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Stanford. Los métodos también están de acuerdo con las Políticas de la Sociedad para la Neurociencia sobre el Uso de Animales y Humanos en la Investigación de Neurociencia.

NOTA: Todos los ratones se mantuvieron en un ambiente libre de patógenos. Ratones de tipo salvaje en mezcla C57Bl / 6 x SV / 129J fondo genético se utilizaron aquí, a menos que se indique lo contrario.

1. Configuración

  1. Preparar 1 L de 1x aCSF (en mM): 125 NaCl, 26 NaHCO3, 2,3 KCl, 1.26 KH2PO4, 1,3 Mg2SO4x7H 2O, 2,5 CaCl2, 25 glucosa(Tabla 1). Utilice esta solución para la cámara de recuperación y las grabaciones posteriores.
    NOTA: Almacene aCSF como una solución de stock 10x que contenga NaCl, NaHCO3, KCl y KH2PO4. Almacene Mg2SO4x 7H2O y CaCl2 como soluciones de stock de 1 M. Prepare la solución de trabajo el día del experimento a partir de las soluciones de stock anteriores y agregue glucosa antes de ajustar el volumen final con agua de 18 M.
    NOTA: Dependiendo de la región cerebral o la tensión del ratón, el aCSF refrigerado también se puede utilizar para la perfusión transcardial con éxito11,15,26.
  2. Preparar 300 mL de NMDG-aCSF (en mM): 135 NMDG, 1 KCl, 1.2 KH2PO4, 1.5 MgCl2, 0.5 CaCl2, 20 bicarbonato de colina, 10 glucosa (Tabla 1). Este volumen de NMDG-aCSF es suficiente tanto para la perfusión transcardial como para los pasos de corte.
    NOTA: Almacene NMDG-aCSF como una solución de stock 3x a 4 oC. Preparar la solución de trabajo el día del experimento; añadir bicarbonato de colina y glucosa antes de ajustar el volumen final con 18 M de agua. Burbuja la solución con 95%O2/5%CO2 para amortiguar, y saturar con oxígeno.
    NOTA: El stock NMDG comienza como altamente alcalino, y requiere ácido clorhídrico concentrado (HCl) para ajustar el pH a 7,4 euros. La adición de ácido clorhídrico debe ser lenta una vez por debajo del pH 8, ya que es fácil acidificar la solución a pH 3 con exceso de HCl. Este ajuste debe realizarse antes de añadir cationes divalentes. Esta receta NMDG-aCSF no tiene sodio. Las recetas NMDG publicadas anteriormente utilizan 30 mM NaHCO3 para el almacenamiento en búfer, lo que da como resultado 30 mM de sodio presente en NMDG-aCSF13,,20.
  3. Ajuste la bandeja de corte de microtoma vibratoria y el disco de montaje a -20 oC.
  4. Preparen la cámara de recuperación.
    1. Llene la cámara de recuperación justo por encima de la malla de sujeción de la rebanada, manténgala en el banco a temperatura ambiente y burbujee.
      NOTA: La cámara de recuperación de rebanadas utilizada aquí es muy similar a las cámaras clásicas descritas anteriormente por Edwards y Konnerth3. aCSF se mantiene en un vaso de precipitados de vidrio (400 ml) que sostiene un marco acrílico redondo con malla de nylon negro pegada a la parte inferior. El marco de acrílico se suspende en el centro del vaso de precipitados a través de un gancho de acrílico que descansa sobre el borde del vaso de precipitados. El burbujeador de vidrio se inserta hasta la parte inferior. El diseño permite la oxigenación de ambos lados de las rodajas. El burbujeo también proporciona una mezcla constante de aCSF en la cámara de recuperación. La malla negra proporciona un alto contraste con las rebanadas blanqueo-blancas, que luego son más fáciles de ver.
  5. Preparar la perfusión transcardial y la solución de corte.
    1. Enfríe los 300 ml de NMDG-aCSF en un congelador, hasta que los cristales de hielo comiencen a formarse en la superficie y las paredes de la botella. ¡NO se congele demasiado!
    2. Coloque la botella con NMDG-aCSF refrigerado sobre hielo y burbuja. La solución debe estar entre 0-u20122 oC.
      NOTA: Slushy NMDG- aCSF implica tener la mayor parte de la solución como líquido, mientras que una pequeña fracción de hielo slushy presente mantendrá la solución cerca de 0 oC durante la perfusión y el corte. Se debe tener cuidado de mantener alejados los cristales de hielo del cerebro durante el corte.
  6. Prepare el disco de montaje de tejido.
    1. Saque el disco del congelador, lléelo si es necesario.
    2. Cortar un bloque de 5% de agar de la placa de agar previamente preparada, y pegarlo en el centro del disco utilizando una fina capa de pegamento de cianoacrilato. La pieza de agar debe ser del tamaño de un cerebro de ratón. Coloque el disco con agar pegado sobre hielo y cúbralo con toallas de papel hasta que esté listo para usar.
      1. Para una placa de agar del 5%, disuelva 5 g de agar en 100 ml de agua de 18 M por microwaving, y vierta en un plato limpio de petri. Mantener a 4oC.
  7. Saque la bandeja de corte del congelador, colóquela en el microtoma, rodeándola de hielo y cargue la cuchilla.

2. Perfusión transcardial y extracción cerebral

  1. Sobredosis de ratones a través de una inyección intraperitoneal de cóctel anestésico. Compruebe la profundidad de la anestesia comprobando el reflejo del dolor (pellizco del dedo del dedo); un ratón no debe exhibir el reflejo una vez que alcanza la anestesia profunda.
    NOTA: Receta de cóctel de anestesia de roedores: Ketamina HCl (66 mg/ml), xilazina HCl (6,6 mg/ml), maleato de acepromazina (0,1 mg/ml), agua de 18 M hasta el volumen final. Dosis: 0,4 mg/g de peso corporal, 0,04 mg/g de peso corporal, 6 x 10-4 mg/g de peso corporal para ketamina, xilazina y acepromazina, respectivamente.
  2. Configuración de la bomba peristáltica para perfusión transcardial. Inserte un lado del tubo de la bomba en la botella con NMDG-aCSF helado. Coloque el otro lado del tubo con la aguja de 27 G que se insertará en el ventrículo izquierdo.
  3. Ajuste la velocidad de la bomba a aproximadamente 3,5 ml/min. A esta velocidad, la salida de NMDG-aCSF es un goteo rápido, no un flujo continuo.
    NOTA: La perfusión por gravedad es un buen sustituto de la perfusión peristáltica de la bomba, siempre y cuando se pueda alcanzar el mismo caudal aproximado. Una perfusión a alto caudal dará lugar a vasos sanguíneos reventados en el cerebro. Un signo revelador de una perfusión demasiado rápida y aumento de la presión en los vasos sanguíneos es la solución que sale de la nariz del animal.
  4. Perfusión
    1. Coloque el ratón anestesiado correctamente sobre su espalda en un pañal. Usando cinta adhesiva, pegue las patas delanteras y traseras para que el pecho y el abdomen estén expuestos.
    2. Cortar un parche grande de la piel en la parte superior del pecho, yendo desde debajo del esternón hasta la garganta; esto debería proporcionar una gran área de trabajo. Agarre el esternón con fórceps, levante suavemente y comience a cortar a través de la caja torácica en ambos lados hasta que la cavidad torácica esté expuesta.
    3. Corte a través del diafragma para exponer la cavidad torácica. La solapa de la caja torácica debe dejarse unida a través de un trozo delgado de músculo. Debe ser posible establecerlo en un lado sin que vuelva a caer sobre la cavidad torácica expuesta. Comprueba que el corazón sigue latiendo. Asegúrese de que la mayor parte del hígado sea visible.
    4. Inserte la aguja de 27 G en el ventrículo izquierdo; el ventrículo izquierdo del ratón se ve más claro en color que el derecho. Localice la aurícula derecha de color rojo oscuro. Cortar a través de la aurícula derecha con tijeras pequeñas; la sangre debe empezar a fluir.
    5. Encienda la bomba que se ha preestablecida a la velocidad de flujo correcta. Si todo se hizo correctamente, el hígado debe comenzar a cambiar de color de rojo a marrón poco después del inicio de la perfusión. Monitorear el color del hígado para determinar la longitud de la perfusión; el hígado debe volverse marrón pálido.
    6. Ejecute la bomba durante unos minutos más. Si se utiliza un termómetro rectal, la temperatura corporal debe bajar a 28o 201229 oC, y la nariz del animal debe ser fría al tacto.
  5. Extracción cerebral.
    NOTA: Para este paso, tenga listas las siguientes herramientas de disección: tijeras de decapitación, tijeras pequeñas con cuchilla recta o en ángulo, bisturí y #10 hoja, hoja de un solo filo, fórceps #3, espátula con un lado doblado a 90o, una espátula, una herramienta "60o"(Figura 1A,B)y un pequeño cepillo suave.
    1. Decapitar el ratón con grandes tijeras de decapitación. Usando un bisturí con #10 cuchilla, abre la piel en la parte superior del cráneo. Con pequeñas tijeras en ángulo, corta el cráneo en la línea media. A continuación, usando el #3 fórceps, aleje las mitades derecha e izquierda del cráneo, teniendo cuidado de quitarle la dura. El cerebro debería estar expuesto ahora.
      NOTA: Si la dura se desprende del cráneo, permanecerá sobre el cerebro y tendrá que ser removida por separado. Los bordes de la dura restante pueden apretar y cortar profundamente a través del cerebro, potencialmente dañando la región cerebral de interés.
    2. Retire el cerebro sacándolo con una pequeña espátula. Suelte el cerebro en la solución NMDG-aCSF colocada en un vaso de precipitados pequeño separado sobre hielo. Déjalo ahí hasta un minuto.
      NOTA: Además de la hipotermia, la exposición a la solución salina helada reafirma el cerebro, que es necesario para cortar uniformemente. Todo el procedimiento de decapitación a la extracción cerebral debe ser inferior a 30 s.

3. Cortar

  1. Saque el cerebro del NMDG-aCSF y colóquelo en un pedazo de papel de filtro.
  2. Corte y retire una cuña de 60o del extremo rostral del antebrao con una herramienta "60o" centrada en la línea media. Las superficies cortadas se utilizarán para el montaje para lograr el ángulo adecuado para las rebanadas transversales del hipocampo como se explica a continuación (Figura 1A,B).
    NOTA: Dos cuchillas de un solo filo unidas a través de un soporte casero hacen una herramienta fácil de usar para hacer el corte de 60o (Figura 1A).
  3. Separe los hemisferios en la línea media con el bisturí.
  4. Pegue los hemisferios en el disco de montaje de la siguiente manera. Tome el disco de montaje que ha estado en hielo hasta ahora. Si es necesario, límpielo de nuevo. Pega cada hemisferio delante del bloque de agar, corta de lado hacia abajo.
  5. Asegúrese de que el lado ventral de cada hemisferio esté tocando el bloque de agar. El bloque de agar proporciona soporte adicional durante el corte y es esencial para rodajas uniformes. Los lados dorsales de cada hemisferio deben estar orientados hacia la hoja. Cuando se pega en el lado de corte, cada hemisferio se orienta en relación con la hoja de una manera que resulta en rodajas transversales de hipocampo dorsal in situ (Figura 1B).
  6. Sumerja el disco con hemisferios en una cámara de corte que contenga NMDG-aCSF carisfado con frío helado.
  7. Cortar secciones de 400 m. El corte debe realizarse en menos de 10 min. Diferentes microtomos requerirán diferentes ajustes para lograr este tiempo. Se obtendrán un total de 8 u201210 rodajas de la región dorsal del hipocampo.

4. Recuperación

  1. Transfiera las rodajas a una cámara de recuperación que contenga aCSF carbogenado a temperatura ambiente utilizando pipetas de transferencia desechables con puntas de corte (Figura 1C).
    NOTA: Se recomienda encarecidamente fortificar la cámara de recuperación-aSCF con 5 mM de Na-ascorbato y 3 mM de Na-piruvato. El piruvato es un sustrato energético demostrado para aumentar la producción de ATP en rodajas28,mientras que Na-ascorbate es un quencher radical libre29.
  2. Incubar a temperatura ambiente (22-u201224 oC) durante aproximadamente 2 horas antes de la grabación (hasta 4 h).
    NOTA: Una incubación más larga a temperatura ambiente da como resultado rodajas más saludables durante períodos de tiempo más largos, en relación con la incubación estándar a 37 oC durante 30 minutos seguido de la incubación a temperatura ambiente. El recalentamiento a 37 oC puede introducir edema citotóxico13.

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Resultados

Aplicamos el protocolo anterior para generar rebanadas de hipocampo de CamKIIa-Cre+; Ratones WT sobre un fondo genético mixto C57Bl/ 6 x SV/ 129J, en P > 120. Un gran número de células piramidales en el campo CA1 (Figura 2A) y subiculum (Figura 2B) aparecen en bajo contraste cuando se observan bajo microscopía de contraste diferencial infrarrojo (IR-DIC), un sello distintivo de las células sanas en la preparación de una rebanada. Con esta preparación, una...

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Discusión

El protocolo descrito aquí demuestra que las rebanadas de hipocampo obtenidas de ratones adultos y envejecidos pueden permanecer saludables y viables durante muchas horas después del corte. Los sectores preparados con este protocolo son adecuados para grabaciones de abrazaderas de parches, así como grabaciones de campo de larga duración en las regiones CA1.

Hay dos pasos críticos en este protocolo. El primer paso es el paso de perfusión transcardial con una solución helada. El aclaramie...

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Divulgaciones

El autor no tiene nada que revelar.

Agradecimientos

Agradezco a la Dra. Carla J. Shatz por consejo y apoyo, y a la Dra. Barbara K. Brott y Michelle K. Drews por leer críticamente el manuscrito. El trabajo es apoyado por NIH EY02858 y la Fundación Mathers Charitable otorga a CJS.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
“60 degree” toolmade in-house
#10 scalpel bladeBard-Parker (Aspen Surgical)371110
1M CaCl2Fluka Analytical21114
95%O2/5%CO2Praxiar or another local supplier
Acepromazine maleate (AceproJect)Henry Schein5700850
AgarFisherBP1423-500
Beakers, measuring cylinders, reagent bottles
Brushes size 00-2Ted PellaCrafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella.
CCD cameraOlympusXM10
Choline bicarbonatePfalz & BauerC21240
Cyanoacrilate glueKrazy glueSingles
Decapitation scissorsFST14130-17
Feather bladesFeatherFA-10
Filter paper #2WhatmanEither rounds or pieces cut from a bigger sheet work well.
ForcepsA. Dumont & FilsInox 3c
Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) - porosity 3Robuglas.com18103 or 18113Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time.
GlucoseSigma-AldrichG8270
HClFisherA144SI-212
Ice buckets
KClSigma-AldrichP4504
Ketamine HCl (KetaVed)VEDCONDC 50989-996-06
KH2PO4Sigma-AldrichP0662
Leica Tissue slicer VT1000SThe cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2
Magnetic stirrers and stir bars
Mg2SO4 x 7H2OSigma-Aldrich230391
MgCl2Sigma-AldrichM9272
MilliQ water machineMilliporeSource for 18 Mohm water
Na-ascorbateSigma-AldrichA4035
Na-pyruvateSigma-AldrichP8574
NaClSigma-AldrichS3014
NaHCO3EMDSX0320-1
Needle 27G1/2
NMDGSigma-AldrichM2004
Paper tape
Peristaltic pumpCole-Parmer#7553-70
Peristaltic pump headCole-ParmerMasterflex #7518-00
Personna bladesPersonna double edgeAmazon
pH meter
Recovery chamberin-house made
Scalpel blade handle size 3Bard-Parker (Aspen Surgical)371030
Scissors angled bladeFST14081-09
Single edge industrial razor blade #9VWR55411
Spatulas
Transfer pipettesSamco Scientific225
Upright microscopeOlympus BX51WI
Xylazine HCl (XylaMed)VetOne510650

Referencias

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