מזעור היפוקסיה בפרוסות היפוקמפוס מעכברים מבוגרים ומזדקנים

Summary

זהו פרוטוקול להכנת פרוסה חריפה מהיפוקמפוס עכבר מבוגר ומזדקן המנצל את התסיסה הקרדיאלית וחיתוך פרוסה עם NMDG-aCSF קר כקרח כדי להפחית את הנזק היפוקסי לרקמות. הפרוסות המתוברות נשארות בריאות במשך שעות רבות, ומתאימים לטלאים ארוכי טווח ולהקלטות שדה.

Abstract

פרוסות היפוקמפוס אקוטי אפשרו דורות של מדעני מוח לחקור תכונות סינפטיות, עצביות, ומעגל בפירוט ובנאמנות גבוהה. חקירה של מנגנוני LTP ו-LTD, חישוב דנדריטי נוירון יחיד, ושינויים תלויי ניסיון במעגלים, לא היו אפשריים ללא הכנה קלאסית זו. עם זאת, עם כמה יוצאים מן הכלל, המחקר הבסיסי ביותר באמצעות פרוסות היפוקמפוס חריפה בוצע באמצעות פרוסות מכרסמים של גילים צעירים יחסית, ~ P20-P40, למרות מנגנוני עירור סינפטיים פנימיים יש זנב התפתחותי ארוך שמגיע מעבר P60. הערעור העיקרי של שימוש בפרוסות היפוקמפוס צעירות הוא שימור של בריאות עצבית בסיוע סובלנות גבוהה יותר לנזק היפוקסי. עם זאת, יש צורך להבין את התפקוד העצבי בשלבים בוגרים יותר של התפתחות, מודגש עוד יותר על ידי התפתחות מודלים שונים של בעלי חיים של מחלות ניווניות הדורשות הכנה מוחית מזדקנת. כאן אנו מתארים שינוי בהכנת פרוסת היפוקמפוס חריפה המספקת באופן אמין פרוסות בריאות מהיפוקמפוס עכבר מבוגר ומזדקן. השלבים הקריטיים של הפרוטוקול הם זיעה וחיתוך בין-לב וחיתוך עם NMDG-aSCF ללא נתרן קר כקרח. יחד, שלבים אלה להחית את הירידה המושרה היפוקסיה ATP על עריפת ראש, כמו גם בצקת ציטוקוקסית הנגרמת על ידי שטף נתרן פסיבי. אנו מדגימים כיצד לחתוך פרוסות טרנסוורס של היפוקמפוס בתוספת קליפת המוח באמצעות מיקרוטומיה רוטטת. פרוסות היפוקמפוס אקוטיות שהושגו בדרך זו הן בריאות באופן מהימנים במשך שעות רבות של הקלטה, והן מתאימות הן להקלטות שדה והן להקלטות ממוקדות של מהדק טלאי, כולל מיקוד של נוירונים המסומנים בפלורסנט.

Introduction

הופעתם של ההכנות לחתיכה מוחית חריפה של היונקים הקלה על ניסויים ברמה התאית והסינופטית שהיו אפשריים בעבר רק בהכנות חסרי חוליות כמו Aplysia¹. פיתוח פרוסות היפוקמפוס אקוטיות היה בעל משמעות מיוחדת, כפי שהוא מבנה אחראי על זיכרון עבודה היווצרות הקשר, ויש לו מעגלים תלת-סינפטיים מיוחדים כי הוא נוח מניפולציה פיזיולוגית קלה. עם זאת, הרוב המכריע של פרוסות מוח אקוטיות עדיין מוכנים מעכברים וחולדות צעירים יחסית, כפי שקל יותר לשמר נוירונים ומעגלים בריאים, ואת הפרוסות להישאר קיימא לפרקי^{זמן ארוכים יותר 2,,3,,4}. כאן, אנו מציגים שינויים בפרוטוקולי חיתוך סטנדרטיים התוצאתם כדאיות מוגברת של פרוסות היפוקמפוס אקוטיות מעכברים בוגרים ומזדקנים.

המכשול העיקרי לכדאיות vivo לשעבר לטווח ארוך של parenchyma המוח יונקים הוא הנזק היפוקסי הראשוני המתרחשת במהירות ברגע זרימת הדם למוח מפסיק בעקבות עריפת ראש. אובדן חמצן גורם לצריכה חילוף חומרים מהירה של משאבי אנרגיה עיקריים במוח עם אובדן של פוספו-קריאטין (P-קריאטין) להיות המהיר ביותר, ואחריו גלוקוז, אדנוזין טריפוספט (ATP), וגלוקוגן^4. שימור ATP הוא בעל חשיבות מיוחדת לבריאות לטווח ארוך של פרוסות מוח, כמו ATP נדרש כדי לשמור על פוטנציאל קרום באמצעות ATPase Na-K, וכתוצאה מכך את הפעילות^{העצבית 5,6}. רמת ה-ATP במוח המכרסמים הבוגרים היא כ-2.5 מ"מ, והיא יורדת במהירות בתוך 20 שניות של עריפת ראש כדי להגיע למצב יציב של בסיס (כ-0.5 מ"מ) בסביבות דקה לאחר עריפת^{ראש 4,,7,,8}. בבעלי חיים צעירים, לוקח יותר זמן לצפות באותה ירידה ATP (~ 2 דקות); עם הרדמה פנוברביטל הוא הואט עוד יותר 4 דקות⁴. שיקולים אלה מראים כי מניעת אובדן ATP ומשאבי אנרגיה אחרים היא אסטרטגיה הכרחית כדי למנוע נזק היפוקסי למוח ובכך כדי לשמור על הבריאות של פרוסות המוח על פני פרקי זמן ארוכים יותר, במיוחד בבעלי חיים בוגרים.

טמפרטורות נמוכות מאטות את חילוף החומרים. כתוצאה מכך, הוכח כי היפותרמיה צנועה מגנה על עתודות אנרגיית המוח: בבעלי חיים צעירים, הורדת טמפרטורת הגוף בשש מעלות, מ 37 °C ל 31 ° C, משמרת את רמות ATP סביב 80% של רמות נורמליות מעל 4 שעות של היפוקסיה^{מבוקרת 9}. רמות P-קריאטין נשמרים באופן דומה, כמו גם פוטנציאל פוספורילציה^{הכוללת 9}. זה מצביע על כך שהורדת טמפרטורת הגוף לפני עריפת ראש יכול להיות neuroprotective, כמו רמות כמעט נורמליות של ATP יכול להישמר באמצעות חיתוך פרוסה ופרוסה התאוששות תקופות.

במידה כי ירידה ATP לא ניתן למנוע לחלוטין על עריפת ראש, פונקציה לקויה חלקית של ATPase Na-K צפוי, ואחריו depolarization באמצעות זרם נתרן פסיבי. כמו זרם נתרן פסיבי מלווה בכניסת מים לתאים, זה גורם בצקת ציטוקוקסית ובסופו של דבר פיקנוזיס. בחולדות בוגרות, החלפת יונים Na+ עם סוכרוז בפתרונות חיתוך פרוסה כבר אסטרטגיה מוצלחת כדי להקל על הנטל של בצקת cytotoxic^10,11. לאחרונה, cations אורגני מתילציה המפחיתים חחול^{ערוץ נתרן 12 הראו להציע הגנה} יעילה יותר מאשר סוכרוז, במיוחד פרוסות מעכברים בוגרים, עם N-מתיל-D-גלוקמין (NMDG) להיות ישים ביותר על פני גילאים שונים ואזורי מוח^{13,,14,,15,,16}.

פרוטוקולים רבים לחיתוך מוח כרוכים בשימוש בטמפרטורות קרות רק במהלך שלב חיתוך הפרוסה, לעתים בשילוב עם Na⁺ ion החלפת^{אסטרטגיה 16,17}. בבעלי חיים צעירים, פרוטוקולים אלה מופיעים להציע הגנה עצבית מספקת מאז המוח ניתן לחלץ במהירות לאחר עריפת ראש כי הגולגולת היא עדיין רזה וקל להסיר^3. עם זאת, אסטרטגיה זו אינה מייצרת פרוסות בריאות מבעלי חיים בוגרים. עם הזמן, מספר מעבדות החוקרות מכרסמים בוגרים הציגו זיעה בין-לבית עם תמיסה קרה כקרח כדי להקטין את טמפרטורת הגוף של החיה, ולכן נזק היפוקסי למוח, לפני עריפת ראש. הליך זה הוחל בהצלחה כדי לייצר פרוסות המוח¹⁸, פרוסות המוח האמצעי¹⁹, פרוסות neocortical^11,20, קליפת פריהינלית²¹, היפוקמפוס^{חולדה 10},^22,23, נורה^{חוש הריח 24}, סטריאטום^{אוורור 25}, קליפת המוח^{,החזותית 26}.

למרות היתרונות המוצעים על ידי עירוי transcardial ו Na⁺ תחליף יון בהכנת פרוסות מעכברוש ובאיזורים מסוימים במוח בעכברים, היפוקמפוס העכבר נשאר אחד האזורים המאתגרים ביותר כדי להגן מפני היפוקסיה^13,20. עד כה, אחת הגישות הנפוצות ביותר לחיתוך היפוקמפוס מעכברים מזדקנים ומודלים עכבר של ניוון עצבי כרוך חיתוך מהיר קלאסי של היפוקמפוס מבודד²⁷. בפרוטוקול המתואר כאן, אנו ממזערים את אובדן ATP במוח הבוגר על ידי הצגת היפותרמיה לפני עריפת הראש על ידי חפירת החיה באופן טראנס-קר עם Na קר כקרח⁺- נוזל מוחי מוחי מלאכותי מבוסס NMDG חינם (NMDG-aCSF). לאחר מכן, הפרוסות נחתכו ב-Na^{הקר כקרח +}NMDG-aCSF ללא תשלום. עם פרוטוקול משופר זה אנו מקבלים פרוסות היפוקמפוס חריפה מעכברים בוגרים ומזדקנים כי הם בריאים עד 10 שעות לאחר חיתוך ומתאימים לטווח ארוך שדה הקלטות מחקרים טלאי-מהדק.

Protocol

הפרוטוקול מתבצע בהתאם למדריך לטיפול ולשימוש בבעלי חיים מעבדה של המכונים הלאומיים לבריאות ואושר על ידי הוועדה למוסדית לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת סטנפורד. שיטות הן גם בהתאם למדיניות של האגודה למדעי המוח על השימוש בבעלי חיים ובני אדם במחקר מדעי המוח.

הערה: כל העכברים נשמרו בסביבה ללא פתוגן. עכברים מסוג פראי על C57Bl מעורב / 6 x SV / 129J רקע גנטי שימשו כאן, אלא אם צוין אחרת.

1. כיוונון

1. הכן 1 L של 1 aCSF (בmM): 125 NaCl, 26 NaHCO₃, 2.3 KCl, 1.26 KH₂PO₄, 1.3 מ"ג_{2 אז4}·7H₂O, 2.5 CaCl₂, 25 גלוקוז (טבלה 1). השתמש בפתרון זה עבור תא השחזור וההקלטות הבאות.
   הערה: אחסן aCSF כפתרון מניות 10x המכיל NaCl, NaHCO₃, KCl, ו KH₂PO₄. אחסן_{Mg 2}SO₄·7H₂O ו- CaCl_{2 כפתרונות} מניות 1 M. הכן את פתרון העבודה ביום הניסוי מפתרונות המלאי לעיל, והוסף גלוקוז לפני התאמת הנפח הסופי עם 18 MΩ מים.
   הערה: בהתאם לאזור המוח או לזן העכבר, aCSF מקורר יכול לשמש גם עבור עירוי עירוי^{עם הצלחה 11,15,26}.
2. להכין 300 מ"ל של NMDG-aCSF (בmM): 135 NMDG, 1 KCl, 1.2 KH₂PO₄, 1.5 MgCl₂, 0.5 CaCl₂, 20 כולין ביקרבונט, 10 גלוקוז(שולחן 1). נפח זה של NMDG-aCSF מספיק הן עבור עירוי בין-לב והן עבור שלבי חיתוך.
   הערה: אחסן NMDG-aCSF כפתרון מניות פי 3 ב- 4 °C. הכן פתרון עבודה ביום הניסוי; להוסיף כולין ביקרבונט וגלוקוז לפני התאמת הנפח הסופי עם 18 MΩ מים. מבעבע את הפתרון עם 95%O₂/5%CO₂ כדי לאגור אותו, ורוויה בחמצן.
   הערה: מניית NMDG מתחילה כאלקליין מאוד, ודורשת חומצה הידרוכלורית מרוכזת (HCl) כדי להתאים את ה-pH ל-7.4~ . תוספת של חומצה הידרוכלורית צריך להיות איטי פעם אחת מתחת pH 8, כפי שהוא קל חומצי את הפתרון ~ pH 3 עם HCl עודף. יש לבצע התאמה זו לפני הוספת cations divalent. מתכון NMDG-aCSF זה הוא ללא נתרן. מתכוני NMDG שפורסמו בעבר להשתמש 30 mM NaHCO₃ עבור אגירה, וכתוצאה מכך נתרן 30 mM קיים NMDG-aCSF^13,20.
3. הגדר את מגש החיתוך המיקרו-טומים הרוטט ואת דיסק ההרכבה ל- -20°C.
4. הכן את תא ההתאוששות.
   1. ממלאים את תא ההתאוששות מעל רשת הפרוסה, שומרים אותו על הספסל בטמפרטורת החדר, ובועות.
      הערה: תא שחזור הפרוסות המשמש כאן דומה מאוד לתאים הקלאסיים שתוארו קודם לכן על ידי אדוארדס וקונרת'³. aCSF נשמר ב זכוכית (400 מל) שמחזיק מסגרת אקריליק עגולה עם רשת ניילון שחורה מודבקת לתחתית. מסגרת אקריליק מושעה באמצע הבקת באמצעות וו אקרילי נח על קצה המסגרת. מבעבע הזכוכית מוכנס כל הדרך לתחתית. העיצוב מאפשר חמצון של שני צידי פרוסות. מבעבע מספק גם ערבוב מתמיד של aCSF בתא השחזור. הרשת השחורה מספקת ניגודיות גבוהה כנגד הפרוסות הלבנות, שאז קל יותר לראותן.
5. הכן את התמיסה והחיתוך של הקרדיה.
   1. מצננים את כל 300 מ"ל NMDG-aCSF במקפיא, עד גבישי קרח מתחילים להוות על פני השטח ועל הקירות של הבקבוק. אל תקפאו יותר!
   2. מניחים את הבקבוק עם NMDG-aCSF מקורר על קרח ובועות. הפתרון צריך להיות בין 0\u20122 °C.
      הערה: Slushy NMDG- aCSF מרמז על כך שיש את רוב הפתרון כנוזל, בעוד שבריר קטן של קרח ברד נוכח ישמור על הפתרון ליד 0 ° C לאורך כל perfusion וחיתוך. יש לנקוט טיפול כדי להרחיק גבישי קרח מהמוח במהלך החיתוך.
6. הכן את הדיסק להרכבת רקמות.
   1. להוציא את הדיסק מהמקפיא, לנגב אותו יבש במידת הצורך.
   2. חותכים בלוק של 5% אגר מצלחת הגר שהוכנה קודם לכן, ולהדביק אותו במרכז הדיסק באמצעות שכבה דקה של דבק ציאנוקרילט. החתיכה agar צריך להיות בערך בגודל של מוח עכבר. מניחים את הדיסק עם אגר מודבק על קרח, ומכסים במגבות נייר עד שהוא מוכן לשימוש.
      1. עבור 5% צלחת אגר, להמיס 5 גרם אגר ב 100 מ"ל של 18 MΩ מים על ידי microwaving, ויוצקים לתוך צלחת פטרי נקייה. שמור על 4 °C.
7. להוציא את מגש החיתוך מהמקפיא, למקם אותו לתוך microtome, להקיף אותו בקרח, ולטעון את הלהב.

2. עירוי טרנזיה וחילוץ מוח

1. עכברים ממנת יתר באמצעות הזרקת תוך-אפרטון של קוקטייל הרדמה. בדוק את עומק ההרדמה על ידי בדיקת רפלקס הכאב (צביטה בהון); עכבר לא צריך להציג את הרפלקס ברגע שהוא מגיע להרדמה עמוקה.
   הערה: מתכון קוקטייל הרדמה מכרסמים: קטמין HCl (66 מ"ג / מ"ל), xylazine HCl (6.6 מ"ג / מ"ל), acepromazine maleate (0.1 מ"ג / מ"ל), 18 MΩ מים לנפח הסופי. מינון: 0.4 מ"ג / g משקל גוף, 0.04 מ"ג / גרם משקל גוף, 6 x 10^-4 מ"ג / גרם משקל גוף עבור קטמין, קסילאזין, acepromazine, בהתאמה.
2. הגדר את המשאבה פריסלטית עבור עירוי טרנזיה בין-לב. הכנס צד אחד של משאבת הצינורות לתוך הבקבוק עם NMDG-aCSF קר. להתאים את הצד השני של הצינורות עם מחט 27 G כי יהיה מוכנס לתוך החדר השמאלי.
3. הגדר את מהירות המשאבה על כ 3.5 מ"ל/ דקה. במהירות זו, הזרימה של NMDG-aCSF היא טפטוף מהיר, לא זרימה רציפה.
   הערה: התפליטה בכוח המשיכה היא תחליף טוב לתחלוב המשאבה פריסלטית, כל עוד ניתן להשיג את אותו קצב זרימה משוער. תפרה בקצב זרימה גבוה תגרום לכלי דם מתפוצצים במוח. סימן מסגיר של תפרה מהירה מדי ולחץ מוגבר בכלי הדם הוא פתרון יוצא מהאף של החיה.
4. התפליטה
   1. מניחים את העכבר המהוים כראוי על גבו על חיתול. באמצעות נייר נייר, הדבק את רגליו הקדמיות וה האחוריות כך שהחזה והבטן ייחשפו.
   2. לחתוך חלקה גדולה של העור על גבי החזה, הולך מתחת לעצם החזה לגרון; תסה זה אמור לספק אזור עבודה גדול. תפוס את עצם החזה עם ממחטות, להרים בעדינות, ולהתחיל לחתוך דרך כלוב הצלעות משני הצדדים עד חלל החזה נחשף.
   3. חותכים את הסרעפת כדי לחשוף את חלל החזה. יש להשאיר את הדש של כלוב הצלעות מחובר באמצעות חתיכת שריר דקה. זה צריך להיות אפשרי להגדיר אותו בצד מבלי שהוא יפול בחזרה לחלל החזה החשוף. תבדוק שהלב עדיין פועם. ודא כי רוב הכבד גלוי.
   4. הכנס את מחט 27 G לחדר השמאלי; החדר השמאלי של העכבר נראה בהיר יותר בצבע מאשר ימין. אתר את האטריום הימני בצבע אדום כהה. חותכים דרך האטריום הימני עם מספריים קטנות; הדם צריך להתחיל לזרום החוצה.
   5. הפעל את המשאבה המוגדרת מראש למהירות הזרימה הנכונה. אם הכל נעשה כראוי, הכבד צריך להתחיל לשנות צבע מאדום לחום זמן קצר לאחר תחילת התחלוק. לפקח על צבע הכבד כדי לקבוע את אורך העירוי; הכבד אמור להפוך לחום חיוור.
   6. הפעל את המשאבה לעוד כמה דקות. אם באמצעות מדחום פי הטבעת, טמפרטורת הגוף צריך לרדת 28\u201229 °C, האף של בעלי חיים צריך להיות קר למגע.
5. חילוץ מוח.
   הערה: בשלב זה, יש את כלי החיתוך הבאים מוכנים: מספריים עריפת ראש, מספריים קטנים עם להב ישר או זוויתי, אזמל #10 להב, להב קצה יחיד, מקצות #3, מרית עם צד אחד כפוף 90°, מרית, "60 מעלות" כלי(איור 1A,B),ומברשת רכה קטנה.
   1. ערפו את ראשו של העכבר עם מספריים גדולים של עריפת ראש. בעזרת אזמל #10 להב, חותכים את העור מעל הגולגולת. עם מספריים בזווית קטנה, לחתוך את הגולגולת בקו האמצע. לאחר מכן, #3 מפסי התות, לחטט את החצאים הימניים ושמאליים של הגולגולת, להיות זהיר לקחת את הדורה עם זה. המוח צריך להיחשף עכשיו.
      הערה: אם dura ניתוק מהגולגולת, זה יישאר מעל המוח ויש להסיר בנפרד. הקצוות של dura הנותרים יכול להדק ולחתוך עמוק דרך המוח, פוטנציאל לפגוע באזור המוח של עניין.
   2. הסר את המוח על ידי גרף אותו החוצה עם מרית קטנה. השליכו את המוח לתמיסת NMDG-aCSF הממוקמת בבקת קטנה נפרדת על קרח. תשאיר את זה שם עד דקה.
      הערה: בנוסף להיפותרמיה, חשיפה לתמיסת מלח קרה כקרח מתמצת במוח, אשר הכרחי אפילו לחיתוך. כל ההליך מעריפת ראש לחילוץ המוח צריך להיות מתחת ל-30 שניות.

3. חיתוך

1. תוציא את המוח מה-NMDG-aCSF ושים אותו על פיסת נייר סינון.
2. גזור והסר טריז של 60° מהקצה הרוזסטרלי של התזה באמצעות כלי "60°" הממורכז בקו האמצע. משטחים חתוכים ישמשו להרכבה כדי להשיג את הזווית הנכונה עבור פרוסות היפוקמפוס transversal כפי שנדון להלן(איור 1A,B).
   NOTE: Two single-edged blades held together via a home-made holder make an easy-to-use tool for making the 60° cut (Figure 1A).
3. ההמיספרות הנפרדות בקו האמצע עם האזמל.
4. הדבק את ההמיספרות לדיסק ההרכבה כדלקמן. קח את דיסק ההרכבה שהיה על קרח עד עכשיו. במידת הצורך, נגב אותו שוב. להדביק כל חצי כדור לפני בלוק אגר, לחתוך את הצד למטה.
5. ודא שהצד האוורני של כל חצי כדור הארץ נוגע בבלוק הגר. בלוק אגר מספק תמיכה נוספת במהלך חיתוך והוא חיוני אפילו פרוסות. הצדדים הגב של כל חצי הכדור צריך להיות מול הלהב. כאשר מודבק בצד החתוך, כל חצי הכדור הוא מונחה ביחס ללהב באופן שתוצאות פרוסות רוחביות של היפוקמפוס גב ב situ (איור 1B).
6. להחזירה של הדיסק עם חציות לתוך תא חיתוך המכיל NMDG-aCSF קר כקרח.
7. חותכים 400 μm מקטעים. חיתוך צריך להיעשות בפחות מ 10 דקות. מיקרוטומים שונים ידרשו הגדרות שונות כדי להשיג הפעם. בסך הכל 8\u201210 פרוסות מאזור היפוקמפוס הגב יושגו.

4. שחזור

1. מעבירים פרוסות לתא שחזור המכיל aCSF מופוגן בטמפרטורת החדר באמצעות פיפטות העברה חד-פעמיות עםטיפים חתוכים (איור 1C).
   הערה: מומלץ מאוד לחזק את תא השחזור-aSCF עם 5 mM Na-ascorbate ו 3 mM Na-pyruvate. Pyruvate הוא פרוצה אנרגיה המוצגת כדי להגביר את הייצור של ATP בפרוסות²⁸, בעוד Na-ascorbate הוא quencher^{רדיקלים חופשיים 29}.
2. דגירה בטמפרטורת החדר (22\u201224 °C) במשך כ 2 שעות לפני ההקלטה (עד 4 שעות).
   הערה: דגירה ארוכה יותר בטמפרטורת החדר גורמת לפרוסות בריאות יותר לפרקי זמן ארוכים יותר, יחסית לדגירה הסטנדרטית ב-37°C למשך 30 דקות ולאחריה דגירה בטמפרטורת החדר. חממה מחדש ב 37 °C יכול להציג בצקת cytotoxic¹³.

תוצאות

יישם את הפרוטוקול לעיל כדי ליצור פרוסות היפוקמפוס מ Camkiia-Cre+; עכברי WT על רקע גנטי מעורב C57Bl / 6 x SV / 129J, ב P > 120. מספר גדול של תאים פירמידתיים בשדה CA1 (איור 2A) וסוביקולום(איור 2B)מופיעים בניגודיות נמוכה כאשר הם נצפים תחת מיקרוסקופ ניגודיות דיפרה-אדום (IR-DIC), סימן היכר ש...

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן מדגים כי פרוסות היפוקמפוס המתקבלות מעכברים מבוגרים ומזדקנים יכולים להישאר בריאים וכדאיים במשך שעות רבות לאחר החיתוך. הפרוסות שהוכנו באמצעות פרוטוקול זה מתאימות להקלטות של מהדק-תיקון, כמו גם להקלטות שדה לאורך זמן באזורי CA1.

קיימים שני שלבים קריטיים בפר...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
“60 degree” tool	made in-house
#10 scalpel blade	Bard-Parker (Aspen Surgical)	371110
1M CaCl2	Fluka Analytical	21114
95%O2/5%CO2	Praxiar or another local supplier
Acepromazine maleate (AceproJect)	Henry Schein	5700850
Agar	Fisher	BP1423-500
Beakers, measuring cylinders, reagent bottles
Brushes size 00-2	Ted Pella		Crafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella.
CCD camera	Olympus	XM10
Choline bicarbonate	Pfalz & Bauer	C21240
Cyanoacrilate glue	Krazy glue		Singles
Decapitation scissors	FST	14130-17
Feather blades	Feather	FA-10
Filter paper #2	Whatman		Either rounds or pieces cut from a bigger sheet work well.
Forceps	A. Dumont & Fils	Inox 3c
Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) - porosity 3	Robuglas.com	18103 or 18113	Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time.
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
HCl	Fisher	A144SI-212
Ice buckets
KCl	Sigma-Aldrich	P4504
Ketamine HCl (KetaVed)	VEDCO	NDC 50989-996-06
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662
Leica Tissue slicer VT1000S			The cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2
Magnetic stirrers and stir bars
Mg2SO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	230391
MgCl2	Sigma-Aldrich	M9272
MilliQ water machine	Millipore		Source for 18 Mohm water
Na-ascorbate	Sigma-Aldrich	A4035
Na-pyruvate	Sigma-Aldrich	P8574
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
NaHCO3	EMD	SX0320-1
Needle 27G1/2
NMDG	Sigma-Aldrich	M2004
Paper tape
Peristaltic pump	Cole-Parmer	#7553-70
Peristaltic pump head	Cole-Parmer	Masterflex #7518-00
Personna blades		Personna double edge	Amazon
pH meter
Recovery chamber	in-house made
Scalpel blade handle size 3	Bard-Parker (Aspen Surgical)	371030
Scissors angled blade	FST	14081-09
Single edge industrial razor blade #9	VWR	55411
Spatulas
Transfer pipettes	Samco Scientific	225
Upright microscope	Olympus BX51WI
Xylazine HCl (XylaMed)	VetOne	510650