从成人和老化小鼠的河马切片中尽量减少低氧

摘要

这是一个急性切片制备从成人和老化的小鼠海马，利用转心灌注和切片切割与冰冷的NMDG-aCSF，以减少对组织的低氧损伤。生成的切片在几个小时内保持健康，并适用于长期的贴片夹和现场记录。

摘要

急性海马切片使几代神经科学家能够详细探索突触、神经元和电路特性，并具有高保真度。没有这种经典的准备，不可能探索LTP和LTC机制、单神经元树突计算以及电路中依赖于经验的变化。然而，除了少数例外，大多数使用急性海马切片的基础研究都是使用相对年轻的啮齿动物的切片进行，+P20-P40，即使突触和内在兴奋机制有一个长长的发育尾巴，达到过去的P60。使用年轻的海马切片的主要吸引力是维持神经元健康，辅之以对低氧损伤的耐受性。然而，有必要了解神经功能在更成熟的发展阶段，进一步突出了各种动物模型的神经退行性疾病，需要老化的大脑准备。在这里，我们描述了对急性海马切片制剂的修改，该制剂可靠地从成年和老化的小鼠海马中提供健康的切片。该协议的关键步骤是转心灌注和切割与无冰钠无NMDG-aSCF。总之，这些步骤一起减轻脱毛时 ATP 中缺氧引起的下降，以及被动钠通量引起的细胞毒性水肿。我们演示如何使用振动微原子切割海马体和皮层的横切片。用这种方式获得的急性海马切片在数小时的录音中可靠健康，适用于现场记录和靶向贴片记录，包括荧光标记神经元的目标。

引言

哺乳动物急性脑切片制剂的出现促进了细胞和突触水平的实验，这些实验以前只能在无脊椎动物制剂（如Aplysia^{1）中实现}。急性海马切片的发展具有特殊意义，因为它是一种负责工作记忆和上下文形成的结构，并且具有一种专门的三突触电路，易于生理操作。然而，绝大多数急性脑片仍然由相对年轻的小鼠和大鼠组成，因为它更容易保存健康的神经元和回路，而且这些切片在较长时间^{2、3、43期间仍然存活}。²在这里，我们引入对标准切片协议的修改，提高成年和老化小鼠急性海马切片的生存能力。

哺乳动物大脑白症的长期外生力的主要障碍是，一旦血液在斩首后停止流向大脑，就迅速发生最初的缺氧损伤。缺氧导致大脑中主要能量资源的快速代谢消耗，磷肌酸（P-肌酸）损失速度最快，其次是葡萄糖、三磷酸腺苷（ATP）和糖原^4。保存ATP对于大脑切片的长期健康特别重要，因为ATP需要通过Na-K ATPase保持膜电位，从而维持^{神经活动5，6。,6}成年啮齿动物大脑中的ATP水平为±2.5 mM，在斩首后约1分钟、7、8时，在斩首后20秒内急剧

研究方案

该协议是根据国家卫生研究院实验室动物护理和使用指南执行的，并经斯坦福大学机构动物护理和使用委员会批准。方法也符合神经科学学会关于在神经科学研究中使用动物和人类的政策。

注:所有小鼠都保持在无病原体的环境中。除非另有说明，否则此处使用混合C57Bl/6 x SV/129J遗传背景的野生小鼠。

1. 设置

1. 准备 1 L 的 1x aCSF （以 mM）: 125 NaCl， 26 NaHCO_3，2.3 KCl， 1.26 KH₂PO_4，1.3 毫克₂SO₄+7H₂O， 2.5 CaCl_2，25 葡萄糖 （表 1）.使用此解决方案进行恢复室和后续录制。
   注:将 aCSF 存储为包含 NaCl、NaHCO_3、KCl和 KH 2 PO₄的 10 倍_{库存解决方案}。将 Mg₂SO₄+7H₂O 和 CaCl_{2 存储为} 1 M 库存解决方案。在实验当天从上述库存溶液中准备工作溶液，并在用 18 MΩ 水调整最终体积之前添加葡萄糖。
   注:根据大脑区域或小鼠应变，冷冻ACSF

结果

我们应用上述协议，从CamKIIa-Cre+生成海马切片;混合遗传背景的WT小鼠C57Bl/ 6 x SV/ 129J，在P> 120。在CA1场（图2A）和亚分细胞（图2B）中，当在红外差分对比度显微镜（IR-DIC）下观察到时，会出现低对比度，这是切片制备中健康细胞的标志。通过这种制备，可高千兆欧姆密封件（>90%）当目标为表面以下约 20 微米的最健康细胞时，通常实现。对于此成功率，...

讨论

此处描述的协议表明，从成年和老化的小鼠获得的海马切片在切割后可以保持健康和存活数小时。使用此协议准备的切片适用于修补夹录制以及 CA1 区域中的持久现场录制。

此协议中有两个关键步骤。第一步是使用冰冷的溶液的跨心灌注步骤。快速清除血液是由肝脏颜色的快速变化发出的信号。提取的大脑应该是非白色的颜色。如果大脑保持粉红色，这意味着全身血液没有被...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
“60 degree” tool	made in-house
#10 scalpel blade	Bard-Parker (Aspen Surgical)	371110
1M CaCl2	Fluka Analytical	21114
95%O2/5%CO2	Praxiar or another local supplier
Acepromazine maleate (AceproJect)	Henry Schein	5700850
Agar	Fisher	BP1423-500
Beakers, measuring cylinders, reagent bottles
Brushes size 00-2	Ted Pella		Crafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella.
CCD camera	Olympus	XM10
Choline bicarbonate	Pfalz & Bauer	C21240
Cyanoacrilate glue	Krazy glue		Singles
Decapitation scissors	FST	14130-17
Feather blades	Feather	FA-10
Filter paper #2	Whatman		Either rounds or pieces cut from a bigger sheet work well.
Forceps	A. Dumont & Fils	Inox 3c
Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) - porosity 3	Robuglas.com	18103 or 18113	Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time.
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
HCl	Fisher	A144SI-212
Ice buckets
KCl	Sigma-Aldrich	P4504
Ketamine HCl (KetaVed)	VEDCO	NDC 50989-996-06
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662
Leica Tissue slicer VT1000S			The cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2
Magnetic stirrers and stir bars
Mg2SO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	230391
MgCl2	Sigma-Aldrich	M9272
MilliQ water machine	Millipore		Source for 18 Mohm water
Na-ascorbate	Sigma-Aldrich	A4035
Na-pyruvate	Sigma-Aldrich	P8574
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
NaHCO3	EMD	SX0320-1
Needle 27G1/2
NMDG	Sigma-Aldrich	M2004
Paper tape
Peristaltic pump	Cole-Parmer	#7553-70
Peristaltic pump head	Cole-Parmer	Masterflex #7518-00
Personna blades		Personna double edge	Amazon
pH meter
Recovery chamber	in-house made
Scalpel blade handle size 3	Bard-Parker (Aspen Surgical)	371030
Scissors angled blade	FST	14081-09
Single edge industrial razor blade #9	VWR	55411
Spatulas
Transfer pipettes	Samco Scientific	225
Upright microscope	Olympus BX51WI
Xylazine HCl (XylaMed)	VetOne	510650