Минимизация гипоксии в гиппокампе ломтики от взрослых и старения мышей

Резюме

Это протокол для острого приготовления ломтик от взрослых и старения мыши гиппокампа, который использует транскардиальной перфузии и ломтик резки с холодной льдий NMDG-ACSF для уменьшения гипоксического повреждения ткани. Полученные ломтики остаются здоровыми в течение многих часов, и подходят для долгосрочного патч-зажима и полевых записей.

Аннотация

Острые ломтики гиппокампа позволили поколениям нейробиологов исследовать синаптические, нейронные и схемные свойства в деталях и с высокой точностью. Изучение механизмов LTP и LTD, одно нейрон дендритных вычислений и опытозависимых изменений в схеме было бы невозможно без этой классической подготовки. Тем не менее, за некоторыми исключениями, большинство фундаментальных исследований с использованием острых ломтиков гиппокампа была выполнена с использованием ломтиков от грызунов относительно молодого возраста, P20-P40, хотя синаптические и внутренние механизмы возбудимости имеют длинный хвост развития, который достигает прошлого P60. Основной привлекательностью использования молодых ломтиков гиппокампа является сохранение нейронов здоровья, которому способствует более высокая толерантность к гипоксическим повреждениям. Тем не менее, необходимо понимать функции нейронов на более зрелых стадиях развития, что еще больше усугубляется развитием различных животных моделей нейродегенеративных заболеваний, которые требуют старения мозга подготовки. Здесь мы описываем модификацию острого препарата гиппокампа ломтик, который надежно обеспечивает здоровые ломтики от взрослых и старения мыши гиппокампа. Критическими шагами протокола являются транскардиальная перфузия и резка с ледяной натрия без NMDG-ASCF. Вместе эти шаги смягчают гипоксию индуцированной капли в АТФ при обезглавливании, а также цитотоксический отек, вызванный пассивными потоками натрия. Мы демонстрируем, как сократить поперечные ломтики гиппокампа плюс кора с помощью вибрирующих микротомов. Острые гиппокампа ломтики, полученные таким образом, надежно здоровы в течение многих часов записи, и подходят как для полевых записей и целевых патч-зажим записей, в том числе ориентации флуоресцентно помечены нейронов.

Введение

Появление млекопитающих острых препаратов кусок мозга способствовали эксперименты на клеточном и синаптическом уровне, которые ранее были возможны только в беспозвоночных препаратов, как Аплизия¹. Особое значение имеет развитие острых ломтиков гиппокампа, так как это структура, отвечающая за рабочую память и контекстообразование, и имеет специализированную трехсинаптическую схему, которая поддается легкой физиологической манипуляции. Тем не менее, подавляющее большинство острых ломтиков мозга по-прежнему готовятся из относительно молодых мышей и крыс, так как легче сохранить здоровые нейроны и схемы, и ломтики остаются жизнеспособными в течение более длительных периодов^{времени 2,3,4}. Здесь мы вводим изменения в стандартные протоколы нарезки, которые приводят к повышению жизнеспособности острых ломтиков гиппокампа от взрослых и стареющих мышей.

Основным препятствием для долгосрочной ex vivo жизнеспособности млекопитающих мозга parenchyma является первоначальный гипоксический ущерб, который происходит быстро, как только поток крови к мозгу останавливается после обезглавливания. Потеря кислорода приводит к быстрому метаболическому потреблению основных энергетических ресурсов в головном мозге с потерей фосфо-креатина (P-креатина) является наиболее быстрым, а затем глюкозы, аденозинтрифосфата (АТФ), и гликоген⁴. Сохранение АТФ имеет особое значение для долгосрочного здоровья ломтиков мозга, так как АТФ необходим для поддержания мембранного потенциала через Na-K ATPase, и, следовательно, нейронной активности^5,6. Уровень АТФ в мозге взрослого грызуна составляет 2,5 мМ, и он резко падает в пределах 20 с обезглавливания, чтобы достичь базального устойчивого состояния (0,5 мМ) на уровне около 1 мин после обезглавливания^4,7,8. У молодых животных, это занимает больше времени, чтобы наблюдать то же падение в АТФ (2 мин); с фенобарбитальной анестезией он далее замедлился до 4 мин⁴. Эти соображения показывают, что предотвращение потери АТФ и других энергетических ресурсов является необходимой стратегией для предотвращения гипоксического повреждения мозга и, в свою очередь, для поддержания здоровья ломтиков мозга в течение более длительных периодов времени, особенно у взрослых животных.

Низкие температуры замедляют обмен веществ. Следовательно, было продемонстрировано, что скромное переохлаждение защищает запасы энергии мозга: у молодых животных, снижая температуру тела на шесть градусов, с 37 градусов до 31 градусов по Цельсию, сохраняет уровни АТФ примерно до 80% от нормального уровня более 4 ч контролируемой гипоксии⁹. Уровни P-креатина также сохранены, также, как общий потенциал фосфорилирования^9. Это говорит о том, что снижение температуры тела до обезглавливания может быть нейропротекторным, так как почти нормальные уровни АТФ могут поддерживаться через ломтик резки и ломтик периодов восстановления.

В той степени, что падение АТФ не может быть полностью предотвращено при обезглавливании, ожидается частично нарушенная функция Na-K ATPase, за которой последует деполяризация через пассивный приток натрия. Как пассивный приток натрия сопровождается водой вступления в клетки, он вызывает цитотоксический отек и в конечном итоге пикноз. У взрослых крыс, замена ионов Na' с сахарозой в срез-резки решений была успешная стратегия, чтобы облегчить бремя цитотоксического отека^10,11. Совсем недавно, метилированные органические катиции, которые уменьшают проницаемость канала натрия¹² показали, чтобы предложить более эффективную защиту, чем сахароза, особенно в ломтики от взрослых мышей, с N-метил-D-глюкамин (NMDG) наиболее широко применимы в разных возрастов и мозговых регионах^13,14,15,16.

Многочисленные протоколы нарезки мозга включают использование холодных температур только во время срезающего шага, иногда в сочетании со стратегией замены иона Na^{й 16,17}. У молодых животных, эти протоколы, как представляется, предлагают достаточно нейрозащиты, так как мозг может быть извлечен быстро после обезглавливания, потому что череп все еще тонкий и легко удалить³. Тем не менее, эта стратегия не производит здоровые ломтики от взрослых животных. Со временем в ряде лабораторий, изучающих взрослых грызунов, введена транскардиальная перфузия с ледяным раствором для снижения температуры тела животного и, следовательно, гипоксического повреждения мозга до обезглавливания. Эта процедура была успешно применена для производства мозжечковых ломтиков^18,ломтики среднего мозга¹⁹, неокортиковые ломтики^11,20, периринальной коры²¹, крыса гиппокампа^10,22,^23,обонятельная луковица²⁴, вентральная стриятная тум²⁵, визуальная кора²⁶.

Несмотря на преимущества, предлагаемые транскардиальной перфузии и Na^ион замены в подготовке ломтиков от крысы и в некоторых областях мозга у мышей, мышь гиппокампа остается одним из самых сложных областей для защиты от гипоксии^13,20. На сегодняшний день, один из наиболее распространенных подходов к нарезке гиппокампа от старения мышей и мыши модели нейродегенерации включает в себя классические быстро нарезки изолированных гиппокампа²⁷. В протоколе, описанном здесь, мы минимизируем потерю АТФ во взрослом мозгу, вводя переохлаждение до обезглавливания путем транскардиальной перфузии животного с ледяной^Na- свободной NMDG основе искусственной спинномозговой жидкости (NMDG-aCSF). Ломтики затем вырезать в ледяной Na^{--бесплатно}NMDG-aCSF. С помощью этого расширенного протокола мы получаем острые ломтики гиппокампа от взрослых и стареющих мышей, которые здоровы до 10 ч после нарезки и подходят для долгосрочных полевых записей и патч-зажим исследований.

протокол

Протокол проводится в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения и одобрен Комитетом по уходу и использованию животных Стэнфордского университета. Методы также в соответствии с политикой Общества неврологии по использованию животных и людей в неврологии исследований.

ПРИМЕЧАНИЕ: Все мыши были сохранены в патогенной среде. Здесь использовались мыши дикого типа на смешанном генетическом фоне C57Bl/ 6 x SV/ 129J, если не указано иное.

1. Настройка

1. Подготовка 1 L из 1x aCSF (в мММ): 125 NaCl, 26 NaHCO₃, 2,3 KCl, 1,26 KH₂PO₄, 1,3 Mg₂SO₄7H₂O, 2.5 CaCl₂, 25 глюкозы (Таблица 1). Используйте это решение для камеры восстановления и последующих записей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Храните aCSF как 10x стоковое решение, которое содержит NaCl, NaHCO_3,KCl и KH₂PO₄. Храните Mg₂SO₄No7H₂O и CaCl₂ в качестве 1 M фондовых решений. Подготовьте рабочий раствор в день эксперимента из вышеуказанных фондовых растворов и добавьте глюкозу перед регулировкой конечного объема с 18 MΩ водой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от области мозга или мыши деформации, охлажденный aCSF также может быть использован для транскардиальной перфузии с успехом^11,15,26.
2. Подготовка 300 м л NMDG-aCSF (в мММ): 135 NMDG, 1 KCl, 1.2 KH₂PO₄, 1.5 MgCl₂, 0.5 CaCl₂, 20 хололин бикарбонат, 10 глюкозы (Таблица 1). Такого объема NMDG-aCSF достаточно как для транскардиальной перфузии, так и для резки шагов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Храните NMDG-aCSF в качестве 3x раствора запаса при 4 градусах Цельсия. Подготовка рабочего решения в день эксперимента; добавить холин бикарбонат и глюкозы до корректировки окончательного объема с 18 MΩ воды. Пузырь раствор с 95%O₂/5%CO_2, чтобы буфер его, и насытить кислородом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: NMDG запас начинается как высоко щелочной, и требует концентрированной соляной кислоты (HCl) для регулировки рН до 7,4 евро. Добавление соляной кислоты должно быть медленным, как только ниже рН 8, так как это легко подкислить раствор для PH 3 с избытком HCl. Эта корректировка должна быть сделана до добавления divalent катинов. Этот рецепт NMDG-aCSF не содержит натрия. Ранее опубликованные рецепты NMDG используют 30 mM NaHCO₃ для буферизации, что приводит к 30 мМ натрия присутствует в NMDG-aCSF^13,20.
3. Установите вибрирующий микротом резки лоток и монтаж диска до -20 градусов по Цельсию.
4. Подготовьте камеру восстановления.
   1. Заполните камеру восстановления, чтобы чуть выше среза-держа сетки, держать его на скамейке при комнатной температуре, и пузырь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Камера восстановления ломтика, используемая здесь, очень похожа на классические камеры, описанные ранее Эдвардсом и Коннертом³. aCSF хранится в стеклянном стакане (400 мЛ), который держит круглую акриловую раму с черной нейлоновой сеткой, приклеенной ко дну. Акриловая рама подвешена в середине стакана через акриловый крюк, лежащий над краем стакана. Стеклянный пузырька вставляется на дно. Конструкция позволяет оксигенации обеих сторон ломтиков. Bubbling также обеспечивает постоянное смешивание aCSF в камере восстановления. Черная сетка обеспечивает высокий контраст с белыми ломтиками, которые затем легче увидеть.
5. Подготовьте транскардиальный перфузионный и режущий раствор.
   1. Охладите все 300 мЛ NMDG-aCSF в морозильной камере, пока кристаллы льда не начнут образовываться на поверхности и стенках бутылки. НЕ чрезмерной заморозки!
   2. Поместите бутылку с охлажденным NMDG-aCSF на лед и пузырь. Решение должно быть между 0'u20122 C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Slushy NMDG-aCSF подразумевает, что большая часть раствора в качестве жидкости, в то время как небольшая часть слякотной лед настоящее будет держать раствор вблизи 0 градусов по Цельсию во время перфузии и резки. Следует проявлять осторожность, чтобы держаться подальше кристаллы льда от мозга во время резки.
6. Подготовьте тканевой диск.
   1. Возьмите диск из морозильной камеры, протрите его сухим, если это необходимо.
   2. Вырежьте блок 5% агара из ранее подготовленной агар-пластины и приклеите его в центре диска с помощью тонкого слоя цианоакрилатного клея. Кусок агара должен быть размером с мозг мыши. Поместите диск с клееным агаром на лед и накройте бумажными полотенцами, пока он не будет готов к использованию.
      1. Для 5% агар пластины, растворить 5 г агара в 100 мл 18 MΩ воды с помощью микроволновой воды, и вылить в чистую чашку Петри. Держите на уровне 4 градусов по Цельсию.
7. Возьмите режущий лоток из морозильной камеры, поместите его в микротом, окружите его льдом и загрузите лезвие.

2. Транскардиальная перфузия и извлечения мозга

1. Передозировка мышей через интраперитонеальную инъекцию обезболивающего коктейля. Проверьте глубину анестезии, проверяя болевой рефлекс (щепотка ног); мышь не должна проявлять рефлекс, как только она достигает глубокой анестезии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рецепт коктейля по анестезии грызунов: Кетамин HCl (66 мг/мЛ), ксилазин HCl (6,6 мг/мл), ацепромазин малеат (0,1 мг/мл), 18 MΩ воды до конечного объема. Доза: 0,4 мг/г массы тела, 0,04 мг/г массы тела, 6 х 10^-4 мг/г массы тела для кетамина, ксилазина и ацепромазина, соответственно.
2. Настройка перистальтического насоса для транскардиальной перфузии. Вставьте одну сторону насоса трубки в бутылку со льдом NMDG-aCSF. Fit другой стороне трубки с 27 G иглы, которые будут вставлены в левый желудочек.
3. Установите скорость насоса примерно на 3,5 м/мин. При такой скорости отток NMDG-aCSF является быстрым капельным, а не непрерывным потоком.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перфузия гравитацией является хорошей заменой перистальтического перфузии насоса, до тех пор, как же приблизительный поток скорость может быть достигнуто. Перфузия при высокой скорости потока приведет к разрыву кровеносных сосудов в головном мозге. Явным признаком чрезмерно быстрого перфузии и повышенного давления в кровеносных сосудах является раствор, выходящих из носа животного.
4. Перфузии
   1. Поместите правильно анестезируемую мышь на спину на подгузник. Используя бумажную ленту, лентой вниз его передние и задние ноги, так что грудь и живот подвергаются.
   2. Вырежьте большой участок кожи на груди, идя от ниже грудины к горлу; это должно обеспечить большую рабочую зону. Захватите грудину с щипцами, поднимите осторожно, и начать резки через грудную клетку с обеих сторон, пока грудная полость подвергается.
   3. Прорежьте диафрагму для того, чтобы разоблачить грудную полость. Заслонка грудной клетки должна быть оставлена прикрепленным через тонкий кусок мышцы. Это должно быть возможно, чтобы установить его на стороне, не имея его падать обратно на открытые грудной полости. Убедитесь, что сердце все еще бьется. Убедитесь, что большая часть печени видна.
   4. Вставьте 27 G иглы в левый желудочек; левый желудочек мыши выглядит светлее по цвету, чем справа. Найдите темное правое предсердие красного цвета. Прорежьте правый предсердий маленькими ножницами; кровь должна начать вытекать.
   5. Запустите насос, который был задан к правильной скорости потока. Если все было сделано правильно, печень должна начать менять цвет с красного на коричневый вскоре после начала перфузии. Мониторинг цвета печени, чтобы определить длину перфузии; печень должна стать бледно-коричневой.
   6. Выполнить насос в течение нескольких минут. При использовании ректального термометра температура тела должна опуститься до 28х20229 градусов по Цельсию, а нос животного должен быть холодным на ощупь.
5. Извлечение мозга.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого шага, есть следующие инструменты вскрытия готовы: ножницы обезглавливания, маленькие ножницы с прямым или угловым лезвием, скальпель и #10 лезвие, однослойное лезвие, #3 щипцы, шпатель с одной стороны согнуты до 90 ", шпатель, "60" инструмент (Рисунок 1A,B), и небольшая мягкая кисть.
   1. Обезглавливать мышь большими ножницами обезглавливания. Используя скальпель с #10 лезвием, разрезать кожу на верхней части черепа. С небольшими угловыми ножницами, вырезать череп на средней линии. Далее, используя #3 щипцы, подглядывать правой и левой половины черепа, стараясь взять dura прочь с ним. Мозг должен быть разоблачен сейчас.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если dura отделяется от черепа, он будет оставаться над мозгом и должен быть удален отдельно. Края оставшейся дюры могут затянуть и нарезать глубоко через мозг, потенциально повреждая область мозга, представляющих интерес.
   2. Удалите мозг, зачерпнув его с небольшой шпателем. Бросьте мозг в раствор NMDG-aCSF, помещенный в отдельный маленький стакан на льду. Оставьте его там на минуту.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В дополнение к переохлаждению, воздействие ледяного солевого раствора фирмы вверх по мозгу, что необходимо для даже резки. Вся процедура от обезглавливания до извлечения мозга должна быть в возрасте до 30 с.

3. Нарезка

1. Возьмите мозг из NMDG-aCSF и поместите его на листе фильтровальной бумаги.
2. Вырезать и удалить 60 "клин из рострального конца предтеко с помощью инструмента "60" по центру на средней линии. Вырезать поверхности будут использоваться для монтажа для достижения надлежащего угла для поперечного гиппокампа ломтиками, как говорилось ниже(Рисунок 1A,B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Два односхейных лезвия, удерживаемые вместе через самодельный держатель сделать простой в использовании инструмент для принятия 60 "вырезать (Рисунок 1A).
3. Отдельные полушария вниз по средней линии со скальпелем.
4. Клей полушарий на монтаж диска следующим образом. Возьмите монтаж диск, который был на льду до сих пор. При необходимости протрите его высушить снова. Клей каждое полушарие перед блоком агара, вырезать сторону вниз.
5. Убедитесь, что вентральная сторона каждого полушария касается блока агара. Блок агара обеспечивает дополнительную поддержку во время резки и необходим даже для ломтиков. Спинные стороны каждого полушария должны быть обращены к лезвию. При приклеивания на стороне разреза, каждое полушарие ориентировано по отношению к лезвию таким образом, что приводит к поперечными ломтиками спинной гиппокампа на месте (Рисунок 1B).
6. Погрузите диск со полушариями в режущую камеру, содержащую ледяной карбогенированный NMDG-aCSF.
7. Вырезать 400 мкм разделов. Резка должна быть сделана менее чем за 10 мин. Различные микротомы потребуют различных настроек для достижения этого времени. В общей сложности 8'u201210 ломтиков из спинной области гиппокампа будут получены.

4. Восстановление

1. Передача ломтиков в камеру восстановления, содержащую карбогенированный aCSF при комнатной температуре, используя одноразовые трубки передачи с отрезанными наконечниками(Рисунок 1C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется укрепить восстановительную камеру-ASCF с 5 мМ На-аскорбатом и 3 мМ На-пирувате. Pyruvate является энергетический субстрат показано, чтобы увеличить производство АТФ в ломтики²⁸, в то время как Na-ascorbate является свободно-радикальным quencher²⁹.
2. Инкубировать при комнатной температуре (22х20 х 24 градусов) примерно за 2 ч до записи (до 4 ч).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Более длительная инкубация при комнатной температуре приводит к более здоровым ломтикам в течение более длительных периодов времени, по сравнению со стандартной инкубацией при 37 градусах в течение 30 минут с последующим инкубацией комнатной температуры. Потепление при 37 градусов по Цельсию может ввести цитотоксический отек¹³.

Результаты

Мы применили вышеуказанный протокол для генерации ломтиков гиппокампа от CamKIIa-Cre'; WT мышей на смешанном генетическом фоне C57Bl / 6 х SV / 129J, на P Большое количество пирамидальных клеток в поле CA1(Рисунок 2A) и subiculum(Рисунок 2B) появляются в низком контрасте, когда ?...

Обсуждение

Протокол, описанный здесь, показывает, что гиппокампе ломтики, полученные от взрослых и стареющих мышей может оставаться здоровым и жизнеспособным в течение многих часов после резки. Срезы, подготовленные с использованием этого протокола, подходят для записи патч-зажима, а также длите?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
“60 degree” tool	made in-house
#10 scalpel blade	Bard-Parker (Aspen Surgical)	371110
1M CaCl2	Fluka Analytical	21114
95%O2/5%CO2	Praxiar or another local supplier
Acepromazine maleate (AceproJect)	Henry Schein	5700850
Agar	Fisher	BP1423-500
Beakers, measuring cylinders, reagent bottles
Brushes size 00-2	Ted Pella		Crafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella.
CCD camera	Olympus	XM10
Choline bicarbonate	Pfalz & Bauer	C21240
Cyanoacrilate glue	Krazy glue		Singles
Decapitation scissors	FST	14130-17
Feather blades	Feather	FA-10
Filter paper #2	Whatman		Either rounds or pieces cut from a bigger sheet work well.
Forceps	A. Dumont & Fils	Inox 3c
Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) - porosity 3	Robuglas.com	18103 or 18113	Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time.
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
HCl	Fisher	A144SI-212
Ice buckets
KCl	Sigma-Aldrich	P4504
Ketamine HCl (KetaVed)	VEDCO	NDC 50989-996-06
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662
Leica Tissue slicer VT1000S			The cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2
Magnetic stirrers and stir bars
Mg2SO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	230391
MgCl2	Sigma-Aldrich	M9272
MilliQ water machine	Millipore		Source for 18 Mohm water
Na-ascorbate	Sigma-Aldrich	A4035
Na-pyruvate	Sigma-Aldrich	P8574
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
NaHCO3	EMD	SX0320-1
Needle 27G1/2
NMDG	Sigma-Aldrich	M2004
Paper tape
Peristaltic pump	Cole-Parmer	#7553-70
Peristaltic pump head	Cole-Parmer	Masterflex #7518-00
Personna blades		Personna double edge	Amazon
pH meter
Recovery chamber	in-house made
Scalpel blade handle size 3	Bard-Parker (Aspen Surgical)	371030
Scissors angled blade	FST	14081-09
Single edge industrial razor blade #9	VWR	55411
Spatulas
Transfer pipettes	Samco Scientific	225
Upright microscope	Olympus BX51WI
Xylazine HCl (XylaMed)	VetOne	510650