Minimizando a hipóxia em fatias hipocampais de camundongos adultos e envelhecidos

Resumo

Este é um protocolo para preparação aguda de fatias de hipocampi de camundongos adultos e envelhecidos que se aproveita da perfusão transcárrica e corte de fatias com NMDG-aCSF gelado para reduzir danos hipóxicos ao tecido. As fatias resultantes permanecem saudáveis durante muitas horas, e são adequadas para grampos de remendo de longo prazo e gravações de campo.

Resumo

As fatias agudas de hipocampal permitiram que gerações de neurocientistas explorassem propriedades sinápticas, neuronais e circuitos em detalhes e com alta fidelidade. A exploração de mecanismos LTP e LTD, a computação dendrítica de neurônio único e as mudanças dependentes da experiência nos circuitos não teriam sido possíveis sem esta preparação clássica. No entanto, com algumas exceções, a pesquisa mais básica usando fatias de hipocampal agudas tem sido realizada usando fatias de roedores de idades relativamente jovens, ~P20-P40, embora mecanismos de excitabilidade sináptica e intrínseca tenham uma longa cauda de desenvolvimento que ultrapassa p60. O principal apelo do uso de jovens fatias hipocampais é a preservação da saúde neuronal auxiliada pela maior tolerância aos danos hipóxicos. No entanto, é preciso entender a função neuronal em estágios mais maduros de desenvolvimento, ainda mais acentuados pelo desenvolvimento de vários modelos animais de doenças neurodegenerativas que requerem uma preparação cerebral envelhecida. Aqui descrevemos uma modificação em uma preparação aguda de fatia hipocampal que fornece fatias saudáveis de hipocampi de camundongos adultos e envelhecidos. Os passos críticos do protocolo são a perfusão transcárdica e o corte com NMDG-aSCF sem sódio frio. Juntos, essas etapas atenuam a queda induzida pela hipóxia no ATP após a decapitação, bem como o edema citotóxico causado por fluxos passivos de sódio. Demonstramos como cortar fatias transversais de hipocampo mais córtex usando um microtoma vibrante. As fatias hipocampais agudas obtidas desta forma são confiáveis e saudáveis ao longo de muitas horas de gravação, e são apropriadas tanto para gravações de campo quanto para gravações direcionadas de grampos de remendo, incluindo o alvo de neurônios fluorescentes rotulados.

Introdução

O advento das preparações de fatias cerebrais agudas de mamíferos facilitou experimentos no nível celular e sináptico que antes eram possíveis apenas em preparações de invertebrados como a Aplysia¹. O desenvolvimento de fatias hipocampais agudas foi de particular significado, pois é uma estrutura responsável pela formação da memória e do contexto, e possui um circuito tri-sináptico especializado que é amenable à fácil manipulação fisiológica. No entanto, a grande maioria das fatias cerebrais agudas ainda são preparadas a partir de camundongos e ratos relativamente jovens, pois é mais fácil preservar neurônios e circuitos saudáveis, e as fatias permanecem viáveis por períodos mais longos de tempo^2,3,4. Aqui, introduzimos modificações nos protocolos de corte padrão que resultam em maior viabilidade de fatias hipocampais agudas de camundongos adultos e envelhecidos.

O principal impedimento para a viabilidade ex vivo a longo prazo do parenchyma cerebral mamífero é o dano hipóxico inicial que ocorre rapidamente quando o fluxo sanguíneo para o cérebro pára após a decapitação. A perda de oxigênio resulta no rápido consumo metabólico dos principais recursos energéticos do cérebro, sendo a perda de fosfo-creatina (P-creatina) a mais rápida, seguida por glicose, adenosina triptofato (ATP) e glicógeno⁴. A preservação da ATP é de particular importância para a saúde a longo prazo das fatias cerebrais, pois a ATP é necessária para manter o potencial de membrana através do ATPase Na-K e, consequentemente, da atividade neural^5,,6. O nível ATP no cérebro de roedor adulto é de ~2,5 mM, e cai vertiginosamente dentro de 20 s de decapitação para alcançar um estado basal estável (~0,5 mM) em torno de 1 min pós-decapitação^4,,7,,8. Em animais jovens, leva mais tempo para observar a mesma queda em ATP (~2 min); com anestesia fenobarbital é ainda mais retardada para 4 min⁴. Essas considerações mostram que prevenir a perda de ATP e outros recursos energéticos é uma estratégia necessária para evitar danos hipóxicos ao cérebro e, por sua vez, manter a saúde das fatias cerebrais por períodos mais longos de tempo, especialmente em animais adultos.

Baixas temperaturas atrasam o metabolismo. Consequentemente, foi demonstrado que a hipotermia modesta protege as reservas de energia cerebral: em animais jovens, reduzindo a temperatura corporal em seis graus, de 37 °C para 31 °C, preserva os níveis de ATP para cerca de 80% dos níveis normais acima de 4h de hipóxia controlada⁹. Os níveis de p-creatina são igualmente preservados, bem como o potencial global de fosforilação⁹. Isso sugere que a redução da temperatura corporal antes da decapitação pode ser neuroprotetora, uma vez que os níveis quase normais de ATP poderiam ser mantidos através dos períodos de corte de fatias e recuperação de fatias.

Na medida em que uma queda de ATP não pode ser completamente impedida após a decapitação, espera-se uma função parcialmente prejudicada do ATPase Na-K, seguida de despolarização via influxo passivo de sódio. Como o fluxo passivo de sódio é seguido pela entrada de água nas células, causa edema citotóxico e, eventualmente, pyknose. Em ratos adultos, substituir íons Na+ por sacarose em soluções de corte de fatias tem sido uma estratégia bem sucedida para aliviar a carga do edema citotóxico^10,11. Mais recentemente, as cáras orgânicas metiladas que diminuem a permeabilidade do canal de sódio¹² têm mostrado oferecer proteção mais eficaz do que a sacarose, especialmente em fatias de camundongos adultos, com n-metil-D-glucamine (NMDG) sendo mais amplamente aplicável em diferentes idades e regiões cerebrais^{13,,14,,15,,16}.

Numerosos protocolos de corte cerebral envolvem o uso de temperaturas frias apenas durante a etapa de corte de fatias, às vezes em combinação com a estratégia de substituição de íons Na^{+ 16,17}. Em animais jovens, esses protocolos parecem oferecer neuroproteção suficiente, uma vez que os cérebros podem ser extraídos rapidamente após a decapitação porque o crânio ainda é fino e fácil de remover³. No entanto, essa estratégia não produz fatias saudáveis de animais adultos. Com o tempo, vários laboratórios que estudam roedores adultos introduziram perfusão transcárrica com uma solução gelada para diminuir a temperatura corporal do animal e, portanto, danos hipóxicos ao cérebro, antes da decapitação. Este procedimento foi aplicado com sucesso para produzir fatias cerebelares¹⁸, fatias de cérebro médio¹⁹, fatias neocorticais^11,20, córtex perirhinal²¹, hipocampo de rato^10,22,23, bulbo olfativo²⁴, estriado ventral²⁵, córtex visual²⁶.

Apesar das vantagens oferecidas pela perfusão transcárdia e substituição^de íons na preparação de fatias de ratos e em algumas regiões cerebrais em camundongos, o hipocampo de camundongos continua sendo uma das áreas mais desafiadoras para proteger da hipóxia^13,20. Até o momento, uma das abordagens mais comuns para cortar hipocampo de camundongos envelhecidos e modelos de camundongos de neurodegeneração envolve o corte rápido clássico do hipocampo isolado²⁷. No protocolo aqui descrito, minimizamos a perda de ATP no cérebro adulto introduzindo hipotermia antes da decapitação, perfumando transcardialmente o animal com Na⁺- fluido cerebrospinal artificial à base de NMDG (NMDG-aCSF). As fatias são então cortadas em Na⁺-free NMDG-aCSF. Com este protocolo aprimorado, obtemos fatias hipocampais agudas de camundongos adultos e envelhecidos que são saudáveis por até 10 h após o corte e são apropriados para gravações de campo de longo prazo e estudos de grampo de remendo.

Protocolo

O protocolo é realizado de acordo com o Guia de Cuidado e Uso de Animais laboratoriais dos Institutos Nacionais de Saúde e aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Stanford. Os métodos também estão de acordo com as Políticas da Sociedade para a Neurociência sobre o Uso de Animais e Humanos na Pesquisa em Neurociência.

NOTA: Todos os camundongos foram mantidos em um ambiente livre de patógenos. Ratos do tipo selvagem em c57Bl/ 6 x SV/ 129J de fundo genético foram usados aqui, a menos que observados de outra forma.

1. Configuração

1. Prepare 1 L de 1x aCSF (em mM): 125 NaCl, 26 NaHCO₃, 2.3 KCl, 1.26 KH₂PO₄, 1.3 Mg₂SO₄·7H₂O, 2.5 CaCl₂, 25 glicose(Tabela 1). Use esta solução para a câmara de recuperação e gravações subsequentes.
   NOTA: Armazene aCSF como uma solução de estoque de 10x que contenha NaCl, NaHCO₃, KCl e KH₂PO₄. Armazene Mg₂SO₄·7H₂O e CaCl₂ como soluções de estoque de 1 M. Prepare a solução de trabalho no dia do experimento a partir das soluções de estoque acima, e adicione glicose antes de ajustar o volume final com 18 MΩ de água.
   NOTA: Dependendo da região cerebral ou da cepa do camundongo, a ACSF refrigerado também pode ser usado para perfusão transcárdia com sucesso^11,,15,26.
2. Prepare 300 mL de NMDG-aCSF (em mM): 135 NMDG, 1 KCl, 1.2 KH₂PO₄, 1,5 MgCl₂, 0,5 CaCl_2,20 bicarbonato de colina, 10 glicose(Tabela 1). Este volume de NMDG-aCSF é suficiente tanto para perfusão transcárvia quanto para etapas de corte.
   NOTA: Armazene o NMDG-aCSF como uma solução de estoque de 3x a 4 °C. Preparar solução de trabalho no dia do experimento; adicionar bicarbonato de colina e glicose antes de ajustar o volume final com 18 MΩ de água. Bolha a solução com 95%O₂/5%CO₂ para tamponá-la, e saturar com oxigênio.
   NOTA: O estoque de NMDG começa como altamente alcalino, e requer ácido clorídrico concentrado (HCl) para ajustar o pH para ~7,4. A adição de ácido clorídrico deve ser lenta uma vez abaixo do pH 8, pois é fácil acidificar a solução para ~pH 3 com excesso de HCl. Este ajuste deve ser feito antes de adicionar cations divalent. Esta receita NMDG-aCSF é livre de sódio. As receitas NMDG publicadas anteriormente usam 30 mM NaHCO₃ para tamponamento, o que resulta em 30 mM de sódio presente no NMDG-aCSF^13,20.
3. Ajuste a bandeja de corte de microtóme vibratório e o disco de montagem para -20 °C.
4. Prepare a câmara de recuperação.
   1. Encha a câmara de recuperação um pouco acima da malha de corte, mantenha-a no banco à temperatura ambiente e bolha.
      NOTA: A câmara de recuperação de fatias usada aqui é muito semelhante às câmaras clássicas descritas anteriormente por Edwards e Konnerth³. aCSF é mantido em um copo de vidro (400 mL) que contém uma moldura acrílica redonda com malha de nylon preto colada na parte inferior. O quadro acrílico está suspenso no meio do béquer através de um gancho de acrílico apoiado sobre a borda do béquer. O bolha de vidro é inserido até o fundo. O projeto permite a oxigenação de ambos os lados das fatias. Borbulhar também fornece mistura constante de aCSF na câmara de recuperação. A malha preta fornece um alto contraste contra as fatias off-white, que são então mais fáceis de ver.
5. Prepare a solução de perfusão transcárvia e corte.
   1. Esfrie os 300 mL inteiros de NMDG-aCSF em um congelador, até que os cristais de gelo comecem a se formar na superfície e nas paredes da garrafa. NÃO congele demais!
   2. Coloque a garrafa com NMDG-aCSF refrigerado no gelo e na bolha. A solução deve ser entre 0\u20122 °C.
      NOTA: Slushy NMDG- aCSF implica ter a maior parte da solução como líquido, enquanto uma pequena fração de gelo slushy presente manterá a solução perto de 0 °C durante toda a perfusão e corte. Deve-se tomar cuidado para afastar cristais de gelo do cérebro durante o corte.
6. Prepare o disco de montagem de tecido.
   1. Tire o disco do congelador, limpe-o se necessário.
   2. Corte um bloco de 5% de ágar da placa de ágar previamente preparada, e cole-o no centro do disco usando uma fina camada de cola cianoacrilato. A peça de ágar deve ser do tamanho de um cérebro de rato. Coloque o disco com ágar colado no gelo e cubra com toalhas de papel até que esteja pronto para usar.
      1. Para 5% de placa de ágar, dissolva 5 g de ágar em 100 mL de água de 18 MΩ por microwaving, e despeje em uma placa de petri limpa. Mantenha a 4 °C.
7. Tire a bandeja de corte do congelador, coloque-a no microtome, cerque-a com gelo e carregue a lâmina.

2. Perfusão transcárvia e extração cerebral

1. Ratos de overdose através de uma injeção intraperitoneal de coquetel anestésico. Verifique a profundidade da anestesia verificando o reflexo da dor (beliscão do dedo do pé); um rato não deve exibir o reflexo uma vez que atinge anestesia profunda.
   NOTA: Receita de coquetel de anestesia de roedores: Cetamina HCl (66 mg/mL), xylazine HCl (6,6 mg/mL), acepromazina maleate (0,1 mg/mL), 18 MΩ de água para o volume final. Dose: 0,4 mg/g peso corporal, 0,04 mg/g peso corporal, 6 x 10^-4 mg/g peso corporal para cetamina, xilazina e acepromazina, respectivamente.
2. Configure a bomba peristáltica para perfusão transcárlica. Insira um lado da tubulação da bomba na garrafa com NMDG-aCSF gelado. Coloque o outro lado da tubulação com a agulha de 27 G que será inserida no ventrículo esquerdo.
3. Coloque a velocidade da bomba em aproximadamente 3,5 mL/min. Nesta velocidade, o fluxo de saída do NMDG-aCSF é um fluxo rápido, não contínuo.
   NOTA: A perfusão por gravidade é um bom substituto para a perfusão da bomba peristáltica, desde que a mesma taxa de fluxo aproximada possa ser alcançada. Uma perfusão a alta vazão resultará em ruptura de vasos sanguíneos no cérebro. Um sinal de uma perfusão excessivamente rápida e aumento da pressão nos vasos sanguíneos é uma solução saindo do nariz do animal.
4. Perfusão
   1. Coloque o mouse anestesiado corretamente em suas costas em uma fralda. Usando fita adesiva, fita para baixo suas pernas dianteiras e traseiras para que o peito e o abdômen sejam expostos.
   2. Corte um grande pedaço da pele no topo do peito, indo de baixo do esterno até a garganta; isso deve fornecer uma grande área de trabalho. Pegue o esterno com fórceps, levante suavemente e comece a cortar a caixa torácica em ambos os lados até que a cavidade torácica seja exposta.
   3. Corte o diafragma para expor a cavidade torácica. O retalho da caixa torácica deve ser deixado preso através de um fino pedaço de músculo. Deve ser possível colocá-lo em um lado sem tê-lo cair de volta sobre a cavidade torácica exposta. Verifique se o coração ainda está batendo. Certifique-se de que a maior parte do fígado é visível.
   4. Inserir a agulha de 27 G no ventrículo esquerdo; o ventrículo esquerdo do mouse parece mais leve em cores do que a direita. Localize o átrio direito de cor vermelha escura. Corte pelo átrio direito com uma tesoura pequena; o sangue deve começar a fluir para fora.
   5. Inicie a bomba que foi predefinida para a velocidade de fluxo correta. Se tudo foi feito corretamente, o fígado deve começar a mudar de cor de vermelho para marrom logo após o início da perfusão. Monitorar a cor hepática para determinar o comprimento da perfusão; o fígado deve ficar marrom pálido.
   6. Execute a bomba por mais alguns minutos. Se usar o termômetro retal, a temperatura corporal deve cair para 28\u201229 °C, e o nariz do animal deve estar frio ao toque.
5. Extração cerebral.
   NOTA: Para esta etapa, tenha as seguintes ferramentas de dissecção prontas: tesoura de decapitação, tesoura pequena com lâmina reta ou angular, bisturi e #10 lâmina, lâmina de borda única, fórceps #3, espátula com um lado dobrado a 90°, uma espátula, uma ferramenta "60°"(Figura 1A,B),e uma pequena escova macia.
   1. Decapitar o rato com uma grande tesoura de decapitação. Usando um bisturi com #10 lâmina, abra a pele em cima do crânio. Com uma tesoura pequena em ângulo, corte o crânio na linha média. Em seguida, usando o #3 fórceps, retire as metades direita e esquerda do crânio, tomando cuidado para levar a dura com ele. O cérebro deve ser exposto agora.
      NOTA: Se a dura se desprender do crânio, ela permanecerá sobre o cérebro e terá que ser removida separadamente. As bordas da dura restante podem apertar e cortar profundamente através do cérebro, potencialmente danificando a região do cérebro de interesse.
   2. Remova o cérebro recolhendo-o com uma pequena espátula. Jogue o cérebro na solução NMDG-aCSF colocada em um pequeno béquer separado no gelo. Deixe lá por até um minuto.
      NOTA: Além da hipotermia, a exposição ao soro fisiológico gelado firma o cérebro, o que é necessário até mesmo para cortar. Todo o procedimento, desde a decapitação até a extração cerebral, deve ser inferior a 30 anos.

3. Fatiamento

1. Tire o cérebro do NMDG-aCSF e coloque-o em um pedaço de papel filtro.
2. Corte e remova uma cunha de 60° da extremidade rostral do cérebro do cérebro usando uma ferramenta "60°" centrada na linha média. As superfícies cortadas serão usadas para montagem para alcançar o ângulo adequado para fatias hipocampais transversais conforme discutido abaixo (Figura 1A,B).
   NOTA: Duas lâminas de borda única mantidas juntas através de um suporte caseiro fazem uma ferramenta fácil de usar para fazer o corte de 60°(Figura 1A).
3. Separe hemisférios abaixo da linha média com o bisturi.
4. Cole os hemisférios no disco de montagem da seguinte forma. Pegue o disco de montagem que esteve no gelo até agora. Se necessário, limpe-o novamente. Cole cada hemisfério na frente do bloco de ágar, corte o lado para baixo.
5. Certifique-se de que o lado ventral de cada hemisfério está tocando o bloco de ágar. O bloco de ágar fornece suporte adicional durante o corte e é essencial para fatias uniformes. Os lados dorsais de cada hemisfério devem estar voltados para a lâmina. Quando colado no lado do corte, cada hemisfério é orientado em relação à lâmina de uma forma que resulta em fatias transversais de hipocampo dorsal in situ(Figura 1B).
6. Submergir o disco com hemisférios em uma câmara de corte contendo NMDG-aCSF caricaturado a frio do gelo.
7. Corte seções de 400 μm. O corte deve ser feito em menos de 10 minutos. Diferentes microtomes exigirão diferentes configurações para alcançar este tempo. Um total de 8\u201210 fatias da região do hipocampo dorsal serão obtidas.

4. Recuperação

1. Transfira fatias para uma câmara de recuperação contendo aCSF carbogenado à temperatura ambiente usando pipetas de transferência descartáveis com pontas de corte(Figura 1C).
   NOTA: É altamente recomendável fortificar a câmara de recuperação-aSCF com 5 mM Na-ascorbate e 3 mM Na-pyruate. Piruvato é um substrato de energia mostrado para impulsionar a produção de ATP em fatias²⁸, enquanto Na-ascorbate é um quencher de radicais livres²⁹.
2. Incubar à temperatura ambiente (22\u201224 °C) por aproximadamente 2 h antes de gravar (até 4h).
   NOTA: Uma maior incubação à temperatura ambiente resulta em fatias mais saudáveis por períodos mais longos de tempo, em relação à incubação padrão a 37 °C por 30 minutos seguidos de incubação da temperatura ambiente. O reaquecimento a 37 °C pode introduzir edema citotóxico¹³.

Resultados

Aplicamos o protocolo acima para gerar fatias de hipocampo da CamKIIa-Cre+; Camundongos WT em um fundo genético misto C57Bl/ 6 x SV/ 129J, em P > 120. Um grande número de células piramidas no campo CA1 (Figura 2A) e subículo (Figura 2B) aparecem em baixo contraste quando observadas sob microscopia de contraste diferencial infravermelho (IR-DIC), uma marca registrada de células saudáveis em uma preparação de fatias. Com esta preparação, uma alta taxa de...

Discussão

O protocolo descrito aqui demonstra que as fatias hipocampais obtidas de camundongos adultos e envelhecidos podem permanecer saudáveis e viáveis por muitas horas após o corte. As fatias preparadas usando este protocolo são apropriadas para gravações de grampos de remendo, bem como gravações de campo de longa duração nas regiões ca1.

Há dois passos críticos neste protocolo. O primeiro passo é o passo de perfusão transcárvia com uma solução gelada. A liberação rápida do sang...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
“60 degree” tool	made in-house
#10 scalpel blade	Bard-Parker (Aspen Surgical)	371110
1M CaCl2	Fluka Analytical	21114
95%O2/5%CO2	Praxiar or another local supplier
Acepromazine maleate (AceproJect)	Henry Schein	5700850
Agar	Fisher	BP1423-500
Beakers, measuring cylinders, reagent bottles
Brushes size 00-2	Ted Pella		Crafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella.
CCD camera	Olympus	XM10
Choline bicarbonate	Pfalz & Bauer	C21240
Cyanoacrilate glue	Krazy glue		Singles
Decapitation scissors	FST	14130-17
Feather blades	Feather	FA-10
Filter paper #2	Whatman		Either rounds or pieces cut from a bigger sheet work well.
Forceps	A. Dumont & Fils	Inox 3c
Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) - porosity 3	Robuglas.com	18103 or 18113	Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time.
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
HCl	Fisher	A144SI-212
Ice buckets
KCl	Sigma-Aldrich	P4504
Ketamine HCl (KetaVed)	VEDCO	NDC 50989-996-06
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662
Leica Tissue slicer VT1000S			The cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2
Magnetic stirrers and stir bars
Mg2SO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	230391
MgCl2	Sigma-Aldrich	M9272
MilliQ water machine	Millipore		Source for 18 Mohm water
Na-ascorbate	Sigma-Aldrich	A4035
Na-pyruvate	Sigma-Aldrich	P8574
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
NaHCO3	EMD	SX0320-1
Needle 27G1/2
NMDG	Sigma-Aldrich	M2004
Paper tape
Peristaltic pump	Cole-Parmer	#7553-70
Peristaltic pump head	Cole-Parmer	Masterflex #7518-00
Personna blades		Personna double edge	Amazon
pH meter
Recovery chamber	in-house made
Scalpel blade handle size 3	Bard-Parker (Aspen Surgical)	371030
Scissors angled blade	FST	14081-09
Single edge industrial razor blade #9	VWR	55411
Spatulas
Transfer pipettes	Samco Scientific	225
Upright microscope	Olympus BX51WI
Xylazine HCl (XylaMed)	VetOne	510650