Yetişkin ve Yaşlanan Farelerden Hipokampal Dilimlerde Hipoksinin En Aza Indirilmesi

Özet

Bu doku hipoksik hasarı azaltmak için buz gibi NMDG-aCSF ile transkardiyal perfüzyon ve dilim kesme yararlanır yetişkin ve yaşlanma fare hipokampi akut dilim hazırlanması için bir protokoldür. Elde edilen dilimler saatlerce sağlıklı kalır ve uzun süreli yama kıskaçları ve alan kayıtları için uygundur.

Özet

Akut hipokampal dilimler nörolognesiller sinaptik keşfetmek için sağlamıştır, nöronal, ve ayrıntılı olarak devre özellikleri ve yüksek sadakat ile. LTP ve LTD mekanizmalarının araştırılması, tek nöron dendritik hesaplaması ve devrelerde deneyime bağlı değişiklikler, bu klasik hazırlık olmadan mümkün olamazdı. Ancak, birkaç istisna dışında, akut hipokampal dilimleri kullanarak en temel araştırma nispeten genç yaşlarda kemirgenler dilimleri kullanılarak yapılmıştır, ~ P20-P40, sinaptik ve içsel uyarılabilirlik mekanizmaları geçmiş P60 ulaşan uzun bir gelişimsel kuyruk olmasına rağmen. Genç hipokampal dilimleri kullanarak ana itiraz hipoksik hasara daha yüksek tolerans tarafından desteklenen nöronal sağlık korunmasıdır. Ancak, gelişmenin daha olgun aşamalarında nöronal fonksiyonu anlamak için bir ihtiyaç vardır, daha da yaşlanan bir beyin hazırlık gerektiren nörodejeneratif hastalıkların çeşitli hayvan modellerinin geliştirilmesi ile vurgulanan. Burada güvenilir yetişkin ve yaşlanma fare hipokampi sağlıklı dilimler sunar akut hipokampal dilim hazırlanması için bir değişiklik açıklar. Protokolün kritik adımları transkardiyal perfüzyon ve buz gibi sodyumiçermeyen NMDG-aSCF ile kesimdir. Birlikte, bu adımlar decapitation üzerine ATP hipoksilen damla zayıflatmak, yanı sıra pasif sodyum akılarının neden olduğu sitotoksik ödem. Titreşen bir mikrotom kullanarak hipokampus artı korteksin transversal dilimlerinin nasıl kesilen yolu göstereceğiz. Bu şekilde elde edilen akut hipokampal dilimler, saatlerce kayıt ta güvenilir bir şekilde sağlıklıdır ve floresan etiketli nöronların hedefalınması da dahil olmak üzere hem alan kayıtları hem de hedeflenen yama-kıskaç kayıtları için uygundur.

Giriş

Memeli akut beyin dilimi preparatları gelişiyle daha önce Aplysia gibi omurgasız preparatlar sadece mümkün olan hücresel ve sinaptik düzeyde deneyler kolaylaştırdı¹. Akut hipokampal dilimlerin gelişimi özellikle önem taşıyordu, çünkü çalışan hafıza ve bağlam oluşumundan sorumlu bir yapıdır ve kolay fizyolojik manipülasyona uygun özel bir tri-sinaptik devreye sahiptir. Ancak, akut beyin dilimleri büyük çoğunluğu hala nispeten genç fare ve sıçanlar hazırlanır, sağlıklı nöronlar ve devreleri korumak daha kolay olduğu gibi, ve dilimleri uzun süre canlı kalır^2,3,4. Burada, yetişkin ve yaşlanan farelerden akut hipokampal dilimlerin daha canlı olması yla sonuçlanan standart dilimleme protokollerinde değişiklikler sıyoruz.

Memeli beyin parankim uzun vadeli ex vivo canlılık için büyük engel beyin kan akışını n için decapitation aşağıdaki durur kez hızla meydana gelen ilk hipoksik hasardır. Oksijen kaybı fosfo-kreatin kaybı ile beyinde büyük enerji kaynaklarının hızlı metabolik tüketimi sonuçları (P-kreatin) en hızlı olmak, glikoz takip, adenozin trifosfat (ATP), ve glikojen⁴. ATP korunması beyin dilimlerinin uzun vadeli sağlığı için özel önem taşımaktadır, ATP Na-K ATPase ile membran potansiyelini korumak için gerekli olduğu gibi, ve sonuç olarak nöral aktivite^5,6. Yetişkin kemirgen beyinDE ATP seviyesi ~ 2.5 mM, ve bir bazal sabit durumuna ulaşmak için 20 s içinde hızla düşer (~ 0.5 mM) etrafında 1 dk post-decapitation^4,7,8. Genç hayvanlarda, ATP aynı damla gözlemlemek için daha uzun sürer (~ 2 dk); fenobarbital anestezi ile 4 dk^4'edaha da yavaşlar. Bu hususlar ATP ve diğer enerji kaynaklarının kaybını önlemek için gerekli bir strateji beyin hipoksik hasarı önlemek ve sırayla uzun süreler boyunca beyin dilimlerinin sağlığını korumak için gerekli bir strateji olduğunu göstermektedir, özellikle yetişkin hayvanlarda.

Düşük sıcaklıklar metabolizmayı yavaşlatır. Sonuç olarak, mütevazı hipotermi beyin enerji rezervlerini korur gösterilmiştir: genç hayvanlarda, altı derece vücut ısısını düşüren, 37 °C'den 31 °C'ye, KONTROLLÜ hipoksi nin 4 saat üzerindeki normal seviyelerin yaklaşık %80'ine kadar ATP seviyelerini korur⁹. P-kreatin düzeyleri benzer şekilde korunur, yanı sıra genel fosforilasyon potansiyeli⁹. Bu, kafa kesmeden önce vücut ısısını düşürmenin nöroprotektif olabileceğini düşündürmektedir, çünkü normale yakın ATP seviyeleri dilim kesme ve dilim geri kazanım dönemlerinde korunabilir.

Bir ATP düşüştamamen decapitation üzerine önlenemez ölçüde, Na-K ATPase kısmen bozulmuş fonksiyonu bekleniyor, pasif sodyum akını ile depolarizasyon takip. Pasif sodyum akını hücrelere su girişi takip gibi, sitotoksik ödem ve sonunda pyknoz neden olur. Yetişkin sıçanlarda, dilim kesme çözeltilerinde Na+ iyonlarının sakaroz la değiştirilmesi sitotoksik ödemin yükünü hafifletmek için başarılı bir strateji olmuştur^10,11. Daha yakın zamanda, sodyum kanal geçirgenliği azaltmak metillenmiş organik katyonlar¹² sakaroz daha etkili koruma sunmak için göstermiştir, özellikle yetişkin farelerden dilimleri, N-metil-D-glukagon ile (NMDG) en yaygın farklı yaş ve beyin bölgeleri arasında uygulanabilir olan^13,14,15,16.

Çok sayıda beyin dilimleme protokolleri sadece dilim kesme adımı sırasında soğuk sıcaklıklar kullanarak içerir, bazen Na⁺ iyon değiştirme stratejisi ile birlikte^16,17. Genç hayvanlarda, beyinler kafa kesme den sonra hızlı bir şekilde ayıklanabilir çünkü kafatası hala ince ve kaldırmak kolay olduğu için yeterli nörokoruma sunmak için görünür³. Ancak, bu strateji yetişkin hayvanlardan sağlıklı dilimler üretmez. Zamanla, yetişkin kemirgenler inceleyen laboratuvarların bir dizi hayvanın vücut ısısını azaltmak için buz gibi bir çözelti ile transkardiyal perfüzyon tanıttı, ve bu nedenle beyne hipoksik hasar, önce decapitation. Bu işlem başarıyla serebellar dilimleri üretmek için uygulandı¹⁸, orta beyin dilimleri¹⁹, neokortikal dilimler^11,20, perirhinal korteks²¹, sıçan hipokampus^10,22,23, koku ampul²⁴, ventral striatum²⁵, görme korteks²⁶.

Sıçan ve farelerde bazı beyin bölgelerinde dilimleri hazırlanmasında transkardiyal perfüzyon ve Na⁺ iyon replasmanı tarafından sunulan avantajlara rağmen, fare hipokampus hipoksi korumak için en zorlu alanlardan biri olmaya devam etmektedir^13,20. Bugüne kadar, nörodejenerasyon yaşlanma fareler ve fare modelleri hipokampus dilimleme için en yaygın yaklaşımlardan biri izole hipokampi klasik hızlı dilimleme içerir²⁷. Burada açıklanan protokolde, hayvana çapraz olarak buz gibi Na⁺- serbest NMDG tabanlı yapay beyin-omurilik sıvısı (NMDG-aCSF) ile transkardi olarak nüfuz ederek beyin kesiti uygulayarak yetişkin beyindeki ATP kaybını en aza indiriyoruz. Dilimler daha sonra buz gibi Na⁺-free NMDG-aCSF olarak kesilir. Bu gelişmiş protokol ile dilimleme den sonra 10 saate kadar sağlıklı ve uzun süreli alan kayıtları ve yama-kıskaç çalışmaları için uygun olan yetişkin ve yaşlanan farelerden akut hipokampal dilimler elde ediyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Protokol, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak yürütülür ve Stanford Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanır. Yöntemler aynı zamanda Nörobilim Araştırmalarında Hayvan ve İnsanların Kullanımına Ilişkin Nörobilim Derneği'nin politikalarına da uygun olarak kullanılmaktadır.

NOT: Tüm fareler patojensiz bir ortamda muhafaza edildi. Karışık C57Bl/ 6 x SV/ 129J genetik arka plan üzerinde yabani tip fareler, aksi belirtilmedikçe burada kullanılmıştır.

1. Kurulum

1. Hazırlamak 1 L 1x aCSF (mM): 125 NaCl, 26 NaHCO₃, 2.3 KCl, 1.26 KH₂PO₄, 1.3 Mg₂SO₄·7H₂O, 2.5 CaCl₂, 25 glikoz(Tablo 1). Kurtarma odası ve sonraki kayıtlar için bu çözümü kullanın.
   NOT: ACSF'yi NaCl, NaHCO_3,KCl ve KH₂PO₄içeren 10 x stok çözümü olarak saklayın. Mg₂SO₄·7H₂O ve CaCl_2'yi 1 M stok çözeltisi olarak saklayın. Yukarıdaki stok çözeltilerinden deney gününde çalışma çözümlerini hazırlayın ve son hacmi 18 MΩ su yla ayarlamadan önce glikoz ekleyin.
   NOT: Beyin bölgesi ne de fare zorlanmabağlı olarak, soğutulmuş aCSF de başarı ile transkardiyal perfüzyon için kullanılabilir^11,15,26.
2. Hazırlamak 300 mL NMDG-aCSF (mM): 135 NMDG, 1 KCl, 1.2 KH₂PO₄, 1.5 MgCl₂, 0.5 CaCl₂, 20 kolin bikarbonat, 10 glikoz(Tablo 1). NMDG-aCSF'nin bu hacmi hem transkardiyal perfüzyon hem de kesme adımları için yeterlidir.
   NOT: NMDG-aCSF'yi 4 °C'de 3x stok çözeltisi olarak saklayın. Deney gününde çalışma çözümü hazırlayın; 18 MΩ su ile son hacmi ayarlamadan önce kolin bikarbonat ve glikoz ekleyin. Tampon lamak için çözeltiyi %95 O₂/5%2 ile kabarcıklayın ve oksijenle doygunlayın.₂
   NOT: NMDG stoku yüksek alkali olarak başlar ve pH'ı ~7.4'e ayarlamak için konsantre hidroklorik asit (HCl) gerektirir. Hidroklorik asit ilavesi pH 8'in altında bir kez yavaş olmalıdır, çünkü çözeltiyi aşırı HCl ile ~pH 3'e asitlemek kolaydır. Bu ayarlama, yaygın katyonlar eklemeden önce yapılmalıdır. Bu NMDG-aCSF tarifi sodyum içermez. Daha önce yayınlanan NMDG tarifleri tamponlama için 30 mM NaHCO₃ kullanın, hangi NMDG-aCSF^13,mevcut 30 mM sodyum mevcut,²⁰.
3. Titreşen mikrotom kesme tepsisini ve montaj diskini -20 °C'ye ayarlayın.
4. Kurtarma odasını hazırlayın.
   1. Geri kazanım odasını dilim tutan kafesin hemen üstüne doldurun, oda sıcaklığında tezgahta tutun ve kabarcık.
      NOT: Burada kullanılan dilim geri kazanım odası edwards ve Konnerth³tarafından daha önce açıklanan klasik odaları çok benzer. aCSF, alta yapıştırılmış siyah naylon örgülü yuvarlak akrilik çerçeve tutan cam bir kabın (400 mL) içinde tutulur. Akrilik çerçeve kabın kenarına istirahat bir akrilik kanca ile kabın ortasında askıya alınır. Cam kabarcıkçı dibe kadar yerleştirilir. Tasarım dilimlerin her iki tarafında oksijenleme sağlar. Köpürme de kurtarma odasında aCSF sürekli karıştırma sağlar. Siyah örgü, beyaz olmayan dilimlere karşı yüksek kontrast sağlar ve bu da daha sonra daha kolay görebilirsiniz.
5. Transkardiyal perfüzyon ve kesme çözeltisini hazırlayın.
   1. Buz kristalleri yüzey ve şişe duvarları oluşmaya başlayana kadar, bir dondurucuda NMDG-aCSF tüm 300 mL chill. Aşırı donma YAPMAYIN!
   2. Buz ve kabarcık üzerine soğutulmuş NMDG-aCSF ile şişe yerleştirin. Çözelti 0\u20122 °C arasında olmalıdır.
      NOT: Slushy NMDG- aCSF çözeltinin çoğunun sıvı olarak sahip olduğunu ima ederken, çamurlu buz mevcut küçük bir kısmı perfüzyon ve kesim boyunca çözeltiyi 0 °C'ye yakın tutar. Kesme sırasında beyindeki buz kristallerini uzak tutmaya özen yapılmalıdır.
6. Doku montaj diskini hazırlayın.
   1. Diski dondurucudan çıkar, gerekirse kurutun.
   2. Daha önce hazırlanmış agar plaka% 5 agar bir blok kesip ve siyanoakrilat tutkal ince bir tabaka kullanarak diskin merkezinde tutkal. Agar parçası fare beyni büyüklüğünde olmalı. Buz üzerine yapıştırılmış agar ile disk yerleştirin ve kullanıma hazır olana kadar kağıt havlu ile kaplayın.
      1. %5 agar plaka için, 18 MΩ suyun 100 mL'lik 5 g'ını mikro dalgaile eritin ve temiz bir petri kabına dökün. 4 °C'de tutun.
7. Kesme tepsisini dondurucudan çıkarın, mikrotome yerleştirin, buzla çevreleyin ve bıçağı yükleyin.

2. Transkardiyal perfüzyon ve beyin çekimi

1. Anestezik kokteyl intraperitoneal enjeksiyon yoluyla aşırı doz fareler. Ağrı refleksini kontrol ederek anestezi derinliğini kontrol edin (ayak ucutu); bir fare derin anestezi ulaştığında refleks sergilememelidir.
   NOT: Kemirgen anestezi kokteyli tarifi: Ketamin HCl (66 mg/mL), ksilazin HCl (6.6 mg/mL), asetpromazin maleat (0.1 mg/mL), 18 MΩ su son hacmi. Doz: 0.4 mg /g vücut ağırlığı, 0.04 mg/g vücut ağırlığı, ketamin için 6 x 10^-4 mg/g vücut ağırlığı, ksilazin, ve asetpromazin, sırasıyla.
2. Transkardiyal perfüzyon için peristaltik pompayı ayarlayın. Buzlu NMDG-aCSF ile şişeiçine pompa boru bir tarafı yerleştirin. Tüpün diğer tarafına sol ventriküle yerverilecek 27 G iğne ile takın.
3. Pompa hızını yaklaşık 3,5 mL/dk olarak ayarlayın. Bu hızda, NMDG-aCSF çıkışı hızlı bir damla değil, sürekli akış.
   NOT: Yerçekimi ile perfüzyon peristaltik pompa perfüzyonu için iyi bir yedek, sürece aynı yaklaşık akış hızı elde edilebilir. Yüksek akış hızında bir perfüzyon beyinde patlama kan damarları neden olacaktır. Aşırı hızlı perfüzyon ve kan damarlarında artan basınç bir telltale işareti hayvanın burun gelen çözümdür.
4. Perfüzyon
   1. Düzgün bir şekilde anestezi edilmiş fareyi sırtına bir bez üzerine yerleştirin. Kağıt bant kullanarak, göğüs ve karın maruz böylece ön ve arka bacaklar aşağı bant.
   2. Göğüs üstüne deri büyük bir yama kesip, boğaz ait sternum altından gidiyor; bu geniş bir çalışma alanı sağlamalıdır. Göğüs kafesini forsepsle alın, hafifçe kaldırın ve göğüs boşluğu açığa çıkana kadar her iki taraftaki göğüs kafesini kesmeye başlayın.
   3. Göğüs boşluğunu ortaya çıkarmak için diyaframı kesin. Göğüs kafesinin kapağı ince bir kas parçası ile bağlı bırakılmalıdır. Bu maruz göğüs boşluğuna geri düşmeden bir tarafa ayarlamak mümkün olmalıdır. Kalbin hala atıyor mu kontrol et. Karaciğerin çoğunun görünür olduğundan emin olun.
   4. 27 G iğneyi sol ventriküle takın; farenin sol ventrikül sağ dan daha açık renk görünüyor. Koyu kırmızı renkli sağ atriyum bulun. Küçük makas ile sağ atriyum ile kesin; Kan akmaya başlamalı.
   5. Doğru akış hızına önceden ayarlanmış pompayı çalıştırın. Her şey doğru yapıldıysa, karaciğer perfüzyon başladıktan kısa bir süre sonra kırmızıdan kahverengiye renk değiştirmeye başlamalıdır. Perfüzyon uzunluğunu belirlemek için karaciğer rengini izleyin; karaciğer soluk kahverengi ye dönüşmelidir.
   6. Pompayı birkaç dakika daha çalıştırın. Rektal termometre kullanıyorsanız vücut ısısı 28\u201229 °C'ye düşmeli ve hayvanın burnu dokunmak için soğuk olmalıdır.
5. Beyin çekimi.
   NOT: Bu adım için aşağıdaki diseksiyon araçları hazır: decapitation makas, düz veya açılı bıçak, neşter ve #10 bıçak, tek kenar bıçak, #3 forseps, bir tarafı 90 ° bükülmüş spatula ile küçük bir makas, bir spatula, bir "60 ° " aracı(Şekil 1A,B), ve küçük bir yumuşak fırça.
   1. Farenin kafasını büyük decapitation makasla decapitate. #10 bıçak ile bir neşter kullanarak, kafatası nın üstündeki deri açık kesti. Küçük açılı makas ile, orta hatta kafatası kesti. Daha sonra, #3 forceps kullanarak, kafatasının sağ ve sol yarısı uzak gözetlemek, onunla dura götürmek için dikkatli olmak. Beyin şimdi açığa çıktı.
      NOT: Dura kafatasından ayrılırsa, beynin üzerinde kalır ve ayrı olarak çıkarılması gerekir. Kalan dura kenarları sıkın ve beyin yoluyla derin dilim, potansiyel ilgi beyin bölgesizarar.
   2. Küçük bir spatula ile dışarı kepçe tarafından beyin çıkarın. NMDG-aCSF çözeltisi içine buz üzerinde ayrı bir küçük kabın yerleştirilen içine beyin bırakın. Bir dakika kadar orada bırakın.
      NOT: Hipotermiye ek olarak, hatta kesmek için gerekli olan beyin, kadar buz gibi tuzlu firmalara maruz kalma. Beyin çekimine kadar tüm prosedür 30 s altında olmalıdır.

3. Dilimleme

1. Beyni NMDG-aCSF'den çıkar ve bir filtre kağıdına yerleştirin.
2. Orta hatta ortalanmış bir "60°" aleti kullanarak ön beynin rostral ucundan 60° bir kama kesin ve çıkarın. Kesme yüzeyleri aşağıda anlatıldığı gibi transversal hipokampal dilimler için uygun açıyı elde etmek için montaj için kullanılacaktır (Şekil 1A,B).
   NOT: Ev yapımı bir tutucu aracılığıyla bir arada tutulan iki tek kenarlı bıçak, 60° kesim yapmak için kullanımı kolay bir araç tır (Şekil 1A).
3. Neşterle orta hattan ayrı yarıküreler.
4. Aşağıdaki gibi montaj diski üzerine hemisfer tutkal. Şu ana kadar buz üzerinde olan montaj diskini alın. Gerekirse tekrar kurutun. Tutkal agar blok önünde her yarımkürede, yan aşağı kesti.
5. Her yarımkürenin ventral tarafının agar bloğuna dokunduğundan emin olun. Agar blok kesme sırasında ek destek sağlar ve hatta dilimler için gereklidir. Her yarımkürenin dorsal kenarları bıçak karşı karşıya olmalıdır. Kesilen tarafa yapıştırıldığında, her yarımküre bıçakla göreceli olarak, dorsal hipokampusun enine dilimlerini yerinde olacak şekilde yönlendirilir (Şekil 1B).
6. Diski yarımkürelerle birlikte buz gibi karbogenated NMDG-aCSF içeren bir kesme odasına batırın.
7. 400 μm'lik kesitler kesin. Kesme en az 10 dakika içinde yapılmalıdır. Farklı mikrotomlar bu süreyi elde etmek için farklı ayarlar gerektirir. Dorsal hipokampus bölgesinden toplam 8\u201210 dilim elde edilecektir.

4. Kurtarma

1. Kesme uçlu tek kullanımlık transfer pipetleri kullanarak oda sıcaklığında karbogenated aCSF içeren bir kurtarma odasına dilimaktarma(Şekil 1C).
   NOT: 5 mM Na-askorbat ve 3 mM Na-pirüvat ile geri kazanım odası-aSCF'yi fortife etmek tavsiye edilir. Pyruvate bir enerji substrat dilimleri ATP üretimini artırmak için gösterilen²⁸, Na-askorbat ise serbest radikal quencher²⁹.
2. Kayıt öncesi oda sıcaklığında (22\u201224 °C) yaklaşık 2 saat kuluçka (en fazla 4 saat).
   NOT: Oda sıcaklığında daha uzun bir kuluçka, 37 °C'de standart kuluçkaya göre 30 dk ve ardından oda sıcaklığında kuluçka daha uzun süre daha sağlıklı dilimler sağlar. 37 °C'de Yeniden ısınma sitotoksik ödem^13'eneden olabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

CamKIIa-Cre+'dan hipokampus dilimleri oluşturmak için yukarıdaki protokolü uyguladık; WT fareler karışık genetik arka plan C57Bl / 6 x SV / 129J, P > 120. Ca1 alanında çok sayıda piramidal hücre(Şekil 2A)ve subikülum(Şekil 2B)bir dilim hazırlama sağlıklı hücrelerin bir özelliği olan kızılötesi diferansiyel kontrast mikroskopisi (IR-DIC) altında gözlendiğinde düşük kontrast görünür. Bu hazırlık la birlikte yüksek oranda giga-o...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Burada açıklanan protokol, yetişkin ve yaşlanan farelerden elde edilen hipokampal dilimlerin kesimden sonra saatlerce sağlıklı ve canlı kalabildiğini göstermektedir. Bu protokol kullanılarak hazırlanan dilimler, yama kelepçesi kayıtlarının yanı sıra CA1 bölgelerindeuzun ömürlü alan kayıtları için uygundur.

Bu protokolde iki kritik adım vardır. İlk adım buz gibi bir çözelti ile transkardiyal perfüzyon adımıdır. Kan hızlı açıklık karaciğer renginin hızl?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
“60 degree” tool	made in-house
#10 scalpel blade	Bard-Parker (Aspen Surgical)	371110
1M CaCl2	Fluka Analytical	21114
95%O2/5%CO2	Praxiar or another local supplier
Acepromazine maleate (AceproJect)	Henry Schein	5700850
Agar	Fisher	BP1423-500
Beakers, measuring cylinders, reagent bottles
Brushes size 00-2	Ted Pella		Crafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella.
CCD camera	Olympus	XM10
Choline bicarbonate	Pfalz & Bauer	C21240
Cyanoacrilate glue	Krazy glue		Singles
Decapitation scissors	FST	14130-17
Feather blades	Feather	FA-10
Filter paper #2	Whatman		Either rounds or pieces cut from a bigger sheet work well.
Forceps	A. Dumont & Fils	Inox 3c
Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) - porosity 3	Robuglas.com	18103 or 18113	Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time.
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
HCl	Fisher	A144SI-212
Ice buckets
KCl	Sigma-Aldrich	P4504
Ketamine HCl (KetaVed)	VEDCO	NDC 50989-996-06
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662
Leica Tissue slicer VT1000S			The cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2
Magnetic stirrers and stir bars
Mg2SO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	230391
MgCl2	Sigma-Aldrich	M9272
MilliQ water machine	Millipore		Source for 18 Mohm water
Na-ascorbate	Sigma-Aldrich	A4035
Na-pyruvate	Sigma-Aldrich	P8574
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
NaHCO3	EMD	SX0320-1
Needle 27G1/2
NMDG	Sigma-Aldrich	M2004
Paper tape
Peristaltic pump	Cole-Parmer	#7553-70
Peristaltic pump head	Cole-Parmer	Masterflex #7518-00
Personna blades		Personna double edge	Amazon
pH meter
Recovery chamber	in-house made
Scalpel blade handle size 3	Bard-Parker (Aspen Surgical)	371030
Scissors angled blade	FST	14081-09
Single edge industrial razor blade #9	VWR	55411
Spatulas
Transfer pipettes	Samco Scientific	225
Upright microscope	Olympus BX51WI
Xylazine HCl (XylaMed)	VetOne	510650