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要約

これは、経心面灌流と氷冷NMDG-aCSFによるスライス切断を利用して組織への低酸素損傷を軽減する、成体および老化マウス海馬からの急性スライス調製のためのプロトコルである。結果のスライスは、長時間にわたって健康を維持し、長期的なパッチクランプやフィールド記録に適しています。

要約

急性海馬スライスは、神経科学者の世代がシナプス、神経細胞、および回路特性を詳細かつ高忠実に探求することを可能にしました。LTPとLTDのメカニズムの探査、単一ニューロン樹状計算、回路の経験依存的変化は、この古典的な準備なしには不可能でした。しかし、いくつかの例外を除いて、シナプスおよび本質的な興奮性メカニズムがP60を過ぎて到達する長い発達尾を有するにもかかわらず、急性海馬スライスを使用してほとんどの基礎研究は、比較的若い年齢のげっ歯類からのスライスを使用して行われてきた〜P20-P40。若い海馬スライスを使用する主な魅力は、低酸素損傷に対する耐性の高い助けとなる神経細胞の健康の維持です。しかし、発達のより成熟した段階での神経機能を理解する必要があり、加齢脳準備を必要とする神経変性疾患の様々な動物モデルの開発によってさらに強調される。ここでは、成人および老化したマウス海馬から健康的なスライスを確実に送達する急性海馬スライス調製物の変更について説明する。プロトコルの重要なステップは、経心面灌流と氷冷ナトリウムフリーNMDG-aSCFによる切断です。これらのステップは、切断時のATPにおける低酸素低下と、受動ナトリウムフラックスによって引き起こされる細胞傷害性浮腫を減衰させる。振動マイクロトームを用いて海馬と皮質の横切りスライスをカットする方法を実演します。この方法で得られた急性海馬スライスは、記録の多くの時間にわたって確実に健康であり、蛍光標識ニューロンのターゲティングを含むフィールドレコーディングとターゲットパッチクランプ記録の両方に適しています。

概要

哺乳動物急性脳スライス製剤の出現は、以前はAplysia1のような無脊椎動物製剤でのみ可能であった細胞およびシナプスレベルでの実験を促進した。急性海馬スライスの開発は、ワーキングメモリとコンテキスト形成を担当する構造であり、容易な生理学的操作に適した特殊なトライシナプス回路を有するため、特に重要であった。しかし、急性脳スライスの大部分は、健康なニューロンおよび回路を維持する方が容易であり、スライスは22、3、43,4の長い期間生存可能なままであるため、比較的若いマウスおよびラットからまだ調製される。ここでは、成体および老化マウスからの急性海馬スライスの生存率を高める標準的なスライスプロトコルの変更を紹介する。

哺乳類の脳実質の長期的なex vivo生存率への主要な障害は、切断後に脳への血流が止まると急速に起こる最初の低酸素損傷である。酸素の損失は、ホスホクレアチン(P-クレアチン)の損失が最も急速である脳内の主要なエネルギー資源の速い代謝消費をもたらし、次いでグルコース、アデノシン三リン酸(ATP)、およびグリコーゲン4が続く。ATPの保存は、脳スライスの長期的な健康にとって特に重要であり、NA-K ATPaseを介して膜電位を維持するためにATPが必要であり、その結果、神経活動55、6。6成人げっ歯類脳のATPレベルは〜2.5mMであり、約1分の切断後4,4、7、8,8で基底定常状態(約0.5mM)に達するために切断の20s以内に急激に低下する。若い動物では、ATPの同じ低下を観察するのに時間がかかります(〜2分)。フェノバルビタール麻酔では4分4までさらに遅くなる。これらの考慮事項は、ATPおよび他のエネルギー資源の損失を防ぐことは、脳への低酸素損傷を防ぎ、特に成虫動物においてより長い期間にわたって脳スライスの健康を維持するために必要な戦略であることを示している。

低温は代謝を遅くする。その結果、控えめな低体温は脳エネルギー埋蔵量を保護することが実証されている:若い動物では、体温を6度下げ、37°Cから31°Cに、制御された低酸素の4時間にわたって正常レベルの約80%にATPレベルを維持する9。Pクレアチンレベルも同様に保存され、全体的なリン酸化電位9.これは、切断前の体温を下げることは、スライス切断およびスライス回復期間を通じてATPのほぼ正常レベルを維持することができるので、神経保護であり得ることを示唆している。

切断時にATP低下を完全に防止できない程度に、Na-K ATPaseの部分的に障害のある機能が期待され、続いて受動ナトリウム流入による脱分極化が予想される。受動的なナトリウム流入が続いて細胞への水の侵入が続くにつれて、細胞毒性の浮腫と最終的にピクノーシスを引き起こす。成虫ラットでは、スライス切断液中でNa+イオンをスクロースに置き換えることは、細胞傷害性浮腫10,11,11の負担を軽減する戦略として成功している。最近では、ナトリウムチャネル透過率,12を減少させるメチル化有機カチオンは、特に成体マウスからのスライスにおいて、特に成人マウスからのスライスにおいて、N-メチル-D-グルカミン(NMDG)が13、14、15、16の異なる13,14,15年齢および脳領域にわたって最も広く適用可能である、スクロースよりも効果的な保護を提供することが示されている。16

多くの脳スライスプロトコルは、スライス切断ステップ中にのみ冷たい温度を使用することを含み、時にはNa+イオン置換戦略16、17,17と組み合わせて。若い動物では、頭蓋骨はまだ薄く、取り除きが簡単なので、脳は切断後に迅速に抽出することができるので、これらのプロトコルは十分な神経保護を提供するように見える。しかし、この戦略は、成虫の動物から健康的なスライスを生成しません。時間が経つにつれて、成虫のげっ歯類を研究する多くの研究室は、動物の体温を低下させ、したがって切断前に脳に低酸素損傷を与えるために氷冷溶液で経心輸を導入してきた。この手順は、小脳スライス18、中脳スライス19、新皮質スライス11、20、20海中11皮質21、ラット海馬10、22、23、22,23嗅球10球24、腹側線条体25、視覚皮質26を生成するために正常に適用された。

ラットおよびマウスのいくつかの脳領域でのスライスを調製する術後灌流およびNa+イオン置換によって提供される利点にもかかわらず、マウス海馬は低酸素13、20,20から保護する最も困難な領域の1つである。現在までに、老化したマウスおよび神経変性のマウスモデルから海馬をスライスする最も一般的なアプローチの1つは、孤立した海馬27の古典的な高速スライスを伴う。ここで説明するプロトコルでは、動物に氷冷Na+-無料のNMDGベースの人工脳脊髄液(NMDG-aCSF)を経線的に浸透させることによって、切断前に低体温症を導入することにより、成人脳におけるATPの損失を最小限に抑える。スライスは、氷冷Na+-free NMDG-aCSFでカットされます。この強化されたプロトコルにより、スライス後最大10時間健康で、長期的なフィールドレコーディングやパッチクランプ研究に適した成体および老化マウスから急性海馬スライスを取得します。

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プロトコル

このプロトコルは、国立衛生研究所の実験動物のケアと使用のためのガイドに従って行われ、スタンフォード大学の施設動物ケアと使用委員会によって承認されています。方法は、神経科学研究における動物と人間の使用に関する神経科学学会の方針にも従っています。

注:すべてのマウスは病原体のない環境で維持された。C57Bl/6 x SV/129J遺伝的背景を組み合わせた野生型マウスが、特に記載されていない限り、ここで使用された。

1. セットアップ

  1. 1x aCSF(mM)の1 Lを準備する:125 NaCl、26 NaHCO 3、2.3 KCl、1.26 KH2PO4、1.3Mg32SO4·7H2O、2.5 CaCl2、25グルコース(表1)このソリューションは、回復チャンバーとその後の記録に使用します。
    注: NaCl、NaHCO 3、KCl、およびKH2PO34を含む10xストックソリューションとしてaCSFを保管してください。1 MストックソリューションとしてMg2SO4·7H2OとCaCl2を保存します。上記のストック溶液から実験日に作業ソリューションを準備し、18 MΩ水で最終容積を調整する前にグルコースを追加します。
    注:脳領域やマウス株に応じて、冷やされたaCSFは、成功11、15、2615,26との心筋灌流にも使用することができます。11
  2. 300 mL の NMDG-aCSF (mM で): 135 NMDG, 1 KCl, 1.2 KH2PO4,1.5 MgCl2,0.5 CaCl2,20 コリン重炭酸塩, 10 グルコース (表 1) 。NMDG-aCSFのこの容積は、心筋灌流および切断の両方のステップのために十分である。
    注:NMDG-aCSFを3倍のストックソリューションとして4°Cに保存してください。 実験の日に作業ソリューションを準備します。18 MΩ水で最終容積を調整する前に、コリン重炭酸塩とグルコースを追加します。溶液を95%O2/5%CO2で2泡立て、それを緩衝し、酸素で飽和させる。
    注:NMDGストックはアルカリ性が高く、pHを〜7.4に調整するには濃縮塩酸(HCl)が必要です。塩酸の添加は、過剰なHClで〜pH3に溶液を酸性化することが容易であるため、pH8以下に一度遅くすべきである。この調整は、2価のカチの追加前に行う必要があります。このNMDG-aCSFレシピはナトリウムフリーです。以前に公開されたNMDGレシピは、バッファリングに30 mM NaHCO3を使用し、NMDG-aCSF13,20,20に存在する30 mMナトリウムをもたらす。
  3. 振動マイクロトーム切断トレイと取り付けディスクを-20°Cに設定します。
  4. 回復室を準備します。
    1. スライス保持メッシュのすぐ上に回復チャンバーを充填し、室温でベンチに保管し、気泡を入れます。
      注:ここで使用されるスライス回収チャンバーは、エドワーズとコナート3によって以前に説明した古典的なチャンバーに非常によく似ています。aCSFは、底部に接着された黒いナイロンメッシュと丸いアクリルフレームを保持するガラスビーカー(400 mL)に保持されています。アクリルフレームは、ビーカーの端に置いてアクリルフックを介してビーカーの真ん中に吊り下げ.ガラスのバブラーは底までずっと挿入される。設計はスライスの両側の酸素化を可能にする。バブリングはまた回復室のaCSFの一定の混合を提供する。黒いメッシュは、オフホワイトのスライスに対して高コントラストを提供し、その後見やすくなります。
  5. 心筋灌流および切断液を準備します。
    1. 氷の結晶が表面とボトルの壁に形成され始めるまで、冷凍庫でNMDG-aCSFの全体の300 mLを冷やします。凍結し過ぎないでください!
    2. 冷やしたNMDG-aCSFを入れたボトルを氷と泡の上に置きます。このソリューションは 0\u20122 °C の間にする必要があります。
      注:Slushy NMDG- aCSFは溶液の大部分を液体として持つことを意味し、存在するスラッシーアイスのごく一部は、灌流および切断を通じて0°C近くに溶液を維持します。切断中に脳から氷の結晶を遠ざけるように注意する必要があります。
  6. ティッシュ取り付けディスクを準備します。
    1. ディスクを冷凍庫から取り出し、必要に応じて拭き取ります。
    2. 以前に用意した寒天板から5%寒天のブロックを切り取り、シアノアクリル酸接着剤の薄い層を使用してディスクの中央に接着します。寒天の部分は、マウスの脳ほどの大きさでなければなりません。氷の上に接着した寒天でディスクを置き、それが使用する準備が整うまでペーパータオルで覆います。
      1. 5%寒天プレートの場合、マイクロウェーブで18MΩ水の100mLに5gの寒天を溶解し、きれいなシャーレに注ぎます。4 °Cに保ちます。
  7. カッティングトレイを冷凍庫から取り出し、ミクロトームに入れ、氷で囲んでブレードを積みます。

2. 心筋透析と脳の抽出

  1. 麻酔カクテルの腹腔内注射による過剰摂取マウス。痛みの反射(つま先ピンチ)をチェックすることによって麻酔の深さをチェックしてください。マウスは、深部麻酔に達した後、反射を示すべきではありません.
    げっ歯類麻酔カクテルのレシピ:ケタミンHCl(66 mg/mL)、キシラジンHCl(6.6 mg/mL)、アセプロマジンマレイン酸(0.1mg/mL)、18 MΩ水から最終体積。投与量: 0.4 mg/g体重, 0.04 mg/g体重, 6 x 10-4 mg/g体重ケタミン, キシラジン, アセプロマジン, それぞれ.
  2. 経心面灌流用の蠕動ポンプを設置します。ポンプチューブの片側を、アイスNMDG-aCSFでボトルに挿入します。左心室に挿入される27G針でチューブの反対側を合わせます。
  3. ポンプ速度を約3.5mL/分に設定します。この速度では、NMDG-aCSFの流出は速いドリップであり、連続的な流れではありません。
    注:重力による灌流は、同じ近似流速が達成できる限り、蠕動性ポンプ灌流の代わりに優れています。高い流量での灌流は、脳内の破裂血管をもたらす。過度に速い灌流と血管の圧力の増加の物語の兆候は、動物の鼻から出てくる溶液です。
  4. 灌 流
    1. 適切に麻酔をしたマウスを背面におむつに置きます。紙テープを使用して、胸部と腹部が露出するように前足と後ろ足をテープダウンします。
    2. 胸の上の皮膚の大きなパッチを切り取ります, 胸骨の下から喉に行きます;これは、大きな作業領域を提供する必要があります。胸骨を鉗子でつかみ、そっと持ち上げ、胸腔が露出するまで両側のリブケージを切り抜け始めます。
    3. 胸腔を露出させるためにダイヤフラムを切り抜ける。リブケージのフラップは、筋肉の薄い部分を介して取り付けられたままにする必要があります。露出した胸腔にフォールバックすることなく、側面に置くことも可能です。心臓がまだ鼓動していることを確認してください。肝臓の大部分が見えるようにしてください。
    4. 左心室に27G針を挿入します。マウスの左心室は右よりも明るく見えます。暗い赤い色の右心房を見つけます。小さいはさみで右心房を切り抜ける。血液が流れ出し始めるはずです。
    5. 正しい流速にプリセットされたポンプを起動します。すべてが正しく行われた場合、肝臓は、灌流の開始後すぐに赤から茶色に色を変更し始める必要があります。肝臓の色を監視して、灌流の長さを決定します。肝臓は淡い茶色に変わるはずです。
    6. ポンプを数分間実行します。直腸温度計を使用する場合、体温は28\u201229°Cに下がり、動物の鼻は触れるに冷たいはずです。
  5. 脳抽出.
    注:このステップでは、切断ハサミ、まっすぐまたは斜めの刃を備えた小さなはさみ、メスと#10ブレード、単一エッジブレード、#3鉗子、片側を90°に曲げたへら、スパチュラ、「60°」ツール(図1A,B)、小さな柔らかいブラシを用意しています。
    1. 大きな切断ハサミでマウスの首を切ります。刃が付いたメス#10使用して、頭蓋骨の上に皮膚を切り開きます。小さな斜められたはさみで、真中線で頭蓋骨を切ります。次に、#3鉗子を使用して、頭蓋骨の左右の半分を詮索し、それでデュラを取り除くように注意してください。脳は今露出する必要があります。
      注:硬膜が頭蓋骨から切り離された場合、それは脳の上にとどまり、別々に取り除かなければなりません。残りの硬膜の縁は、脳を深く引き締めてスライスすることができ、関心のある脳領域に損傷を与える可能性があります。
    2. 小さなへらでそれをすくうことによって脳を取り除く。氷の上の別の小さなビーカーに入れたNMDG-aCSF溶液に脳を落とす。そこには1分間放置してください。
      注:低体温症に加えて、氷冷食食症への暴露は、切断に必要な脳を上に作り上げています。切断から脳の抽出までの手順全体は、30 s以下でなければなりません。

3. スライス

  1. NMDG-aCSFから脳を取り出し、フィルターペーパーの上に置きます。
  2. 正中線を中心とした「60°」ツールを使用して、前脳のロストラル端から60°くさびを切って取り除きます。切断面は、後述するように、海馬横断スライスの適切な角度を達成するために取り付けに使用されます(図1A,B)。
    注:自家製ホルダーを介して一緒に保持された2つの片刃の刃は60°カットを作るための使いやすい用具を作る(図1A)。
  3. メスで中線の下の半球を分離します。
  4. 半球を取り付けディスクに次のように接着します。今まで氷の上にあった取り付けディスクを取ります。必要に応じて、もう一度拭き取ります。寒天ブロックの前に各半球を接着し、側面を切り取ります。
  5. 各半球の腹側が寒天ブロックに触れていることを確認します。寒天ブロックは切断の間に付加的なサポートを提供し、スライスでさえ必要である。各半球の裏側はブレードに面している必要があります。カット側に接着すると、各半球は、その場で裏海馬の横切りスライスをもたらすように、ブレードに対して相対的に向けられます(図1B)。
  6. 氷冷カルボゲン化されたNMDG-aCSFを含む切断室に半球でディスクを浸します。
  7. 400 μmのセクションをカットします。切断は10分以内に行う必要があります。異なるミクロトームは、この時間を達成するために異なる設定を必要とします。海馬後ろ海馬領域から合計8\u201210スライスが得られます。

4. 回復

  1. カットオフチップ付きの使い捨て転送ピペットを使用して、室温でカルボゲン化されたaCSFを含む回復チャンバーにスライスを移す(図1C)。
    注:5 mM Na-アスコルビン酸と3 mM Na-ピルビン酸を備えた回収チャンバーaSCFを強化することを強くお勧めします。ピルビン酸は、スライス28におけるATPの生産を促進するために示されるエネルギー基質であり、Na-アスコルビン酸はフリーラジカルクエンチャー29である。
  2. 記録前に室温(22\u201224°C)で約2時間(最大4時間)インキュベートします。
    注:室温でのインキュベーションが長いほど、37°Cでの標準インキュベーションに比べて、より長い期間、より健康的なスライスが生じ、その後室温インキュベーションが続きます。37°Cでの再暖めは、細胞毒性浮腫13を導入することができる。

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結果

上記のプロトコルを適用して、CamKIIa-Cre+から海馬スライスを生成しました。混合遺伝的背景C57Bl/ 6 x SV / 129J上のWTマウス、P > 120で。CA1フィールド(図2A)およびsubiculum(図2B)の多数の錐体細胞は、薄いコントラストで観察すると低コントラストで現れる(IR-DIC)、スライス調製における健康な細胞の特徴である。この準備により、ギガオームシールの高率(...

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ディスカッション

ここで説明するプロトコルは、成体および老化マウスから得られた海馬スライスが切断後何時間も健康で生存可能であり続けることができることを示している。このプロトコルを使用して作成されたスライスは、パッチクランプの記録だけでなく、CA1リージョンでの長時間のフィールド記録に適しています。

このプロトコルには 2 つの重要な手順があります。最初のス?...

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開示事項

著者は開示するものは何もない。

謝辞

カーラ・J・シャッツ博士の助言と支援、バーバラ・K・ブロット博士、ミシェル・K・ドリューズ博士の原稿を批判的に読んでくださったことに感謝します。この作品はNIH EY02858とマザーズ慈善財団がCJSに助成金を提供しています。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
“60 degree” toolmade in-house
#10 scalpel bladeBard-Parker (Aspen Surgical)371110
1M CaCl2Fluka Analytical21114
95%O2/5%CO2Praxiar or another local supplier
Acepromazine maleate (AceproJect)Henry Schein5700850
AgarFisherBP1423-500
Beakers, measuring cylinders, reagent bottles
Brushes size 00-2Ted PellaCrafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella.
CCD cameraOlympusXM10
Choline bicarbonatePfalz & BauerC21240
Cyanoacrilate glueKrazy glueSingles
Decapitation scissorsFST14130-17
Feather bladesFeatherFA-10
Filter paper #2WhatmanEither rounds or pieces cut from a bigger sheet work well.
ForcepsA. Dumont & FilsInox 3c
Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) - porosity 3Robuglas.com18103 or 18113Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time.
GlucoseSigma-AldrichG8270
HClFisherA144SI-212
Ice buckets
KClSigma-AldrichP4504
Ketamine HCl (KetaVed)VEDCONDC 50989-996-06
KH2PO4Sigma-AldrichP0662
Leica Tissue slicer VT1000SThe cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2
Magnetic stirrers and stir bars
Mg2SO4 x 7H2OSigma-Aldrich230391
MgCl2Sigma-AldrichM9272
MilliQ water machineMilliporeSource for 18 Mohm water
Na-ascorbateSigma-AldrichA4035
Na-pyruvateSigma-AldrichP8574
NaClSigma-AldrichS3014
NaHCO3EMDSX0320-1
Needle 27G1/2
NMDGSigma-AldrichM2004
Paper tape
Peristaltic pumpCole-Parmer#7553-70
Peristaltic pump headCole-ParmerMasterflex #7518-00
Personna bladesPersonna double edgeAmazon
pH meter
Recovery chamberin-house made
Scalpel blade handle size 3Bard-Parker (Aspen Surgical)371030
Scissors angled bladeFST14081-09
Single edge industrial razor blade #9VWR55411
Spatulas
Transfer pipettesSamco Scientific225
Upright microscopeOlympus BX51WI
Xylazine HCl (XylaMed)VetOne510650

参考文献

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