A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
التنظيم السليم لامتصاص الجلوكوز في العضلات مهم للحفاظ على توازن الجلوكوز في الجسم كله. يقدم هذا البروتوكول تقييما لامتصاص الجلوكوز المحفز بالأنسولين والانكماش في العضلات الهيكلية الناضجة المعزولة والمحتضنة عند تحديد تأثير التدخلات الفسيولوجية المختلفة على استقلاب الجلوكوز في الجسم كله.
العضلات الهيكلية هي نسيج مستجيب للأنسولين وعادة ما تستهلك معظم الجلوكوز الذي يدخل الدم بعد الوجبة. علاوة على ذلك ، فقد أفيد أن العضلات الهيكلية قد تزيد من استخراج الجلوكوز من الدم بنسبة تصل إلى 50 ضعفا أثناء التمرين مقارنة بظروف الراحة. تعتمد الزيادة في امتصاص الجلوكوز في العضلات أثناء التمرين وتحفيز الأنسولين على نقل ناقل الجلوكوز 4 (GLUT4) من المقصورات داخل الخلايا إلى غشاء سطح الخلية العضلية ، وكذلك فسفرة الجلوكوز إلى الجلوكوز 6-فوسفات بواسطة هيكسوكيناز II. عزل وحضانة عضلات الفئران مثل m. soleus و m . extensor digitorum longus (EDL) هو نموذج مناسب خارج الجسم الحي لدراسة آثار الأنسولين والانكماش الناجم عن الكهرباء (نموذج للممارسة) على امتصاص الجلوكوز في العضلات الهيكلية الناضجة. وبالتالي ، فإن نموذج خارج الجسم الحي يسمح بتقييم حساسية الأنسولين العضلية ويجعل من الممكن مطابقة إنتاج قوة العضلات أثناء الانقباض مما يضمن التوظيف الموحد لألياف العضلات أثناء قياسات امتصاص الجلوكوز في العضلات. علاوة على ذلك ، فإن النموذج الموصوف مناسب لاختبار المركبات الدوائية التي قد يكون لها تأثير على حساسية الأنسولين في العضلات أو قد تكون مفيدة عند محاولة تحديد التعقيد التنظيمي لامتصاص الجلوكوز في العضلات الهيكلية.
هنا نصف ونقدم بروتوكولا مفصلا حول كيفية قياس امتصاص الجلوكوز المحفز بالأنسولين والانكماش في المستحضرات المعزولة والمحتضنة للعضلات EDL من الفئران باستخدام الملصقات الإشعاعية [3H] 2-deoxy-D-glucose و [14C] مانيتول كعلامة خارج الخلية. هذا يسمح بإجراء تقييم دقيق لامتصاص الجلوكوز في العضلات الهيكلية الناضجة في غياب العوامل المربكة التي قد تتداخل مع النموذج الحيواني السليم. بالإضافة إلى ذلك ، نقدم معلومات حول الجدوى الأيضية للعضلات الهيكلية للفئران المحتضنة مما يشير إلى أن الطريقة المطبقة تمتلك بعض المحاذير في ظل ظروف معينة عند دراسة استقلاب طاقة العضلات.
تمتلك العضلات الهيكلية القدرة على استخراج كميات كبيرة من الجلوكوز من الفضاء خارج الخلية استجابة للأنسولين وممارسة الرياضة. هذا يساعد على الحفاظ على توازن الجلوكوز في الجسم كله ويؤمن إمدادات الجلوكوز خلال أوقات ارتفاع الطلب على الطاقة. نظرا لأن التنظيم السليم لامتصاص الجلوكوز في العضلات الهيكلية قد ثبت أنه مهم للصحة العامة والأداء البدني 1,2 ، فقد حظيت قياسات امتصاص الجلوكوز في العضلات خلال ظروف مختلفة بالكثير من الاهتمام. في البشر والحيوانات ، تم استخدام المشبك مفرط الأنسولين وسكر الدم كتقنية قياسية ذهبية لتقييم حساسية الأنسولين في الجسم الحي 3,4. على النقيض من النتائج التي تم الحصول عليها من اختبار تحمل الجلوكوز عن طريق الفم ، فإن تقنية المشبك المفرط في الأنسولين وسكر الدم لا تتطلب وظيفة الجهاز الهضمي سليمة أو إفراز الأنسولين من البنكرياس ، وبالتالي تسمح بمقارنة استجابات الأنسولين بين الأشخاص الذين يظهرون اختلافات في وظيفة المعدة والأمعاء و / أو البنكرياس. تم إجراء قياسات امتصاص الجلوكوز في العضلات في الجسم الحي أثناء التمرين في البشر بشكل متكرر منذ 1960s5. أولا باستخدام تقنيات التوازن الشرياني الوريدي6 وبعد ذلك باستخدام التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) بالاشتراك مع البوزيترون الذي ينبعث منه الجلوكوز التناظري على سبيل المثال 18F-Fluoro-deoxy-glucose7. في القوارض ، عادة ما يتم امتصاص الجلوكوز في العضلات المحفزة للتمرين في الجسم الحي عن طريق استخدام نظائرها المشعة أو المستقرة من الجلوكوز المسمى بالنظائر8،9،10.
طريقة مكملة لقياسات امتصاص الجلوكوز في العضلات في الجسم الحي ، هي عزل واحتضان العضلات الصغيرة من القوارض وبالتالي قياس امتصاص الجلوكوز باستخدام نظائرها المشعة أو المستقرة من نظائر الجلوكوز11،12،13. تسمح هذه الطريقة بتحديد كمي دقيق وموثوق به لمعدلات امتصاص الجلوكوز في العضلات الهيكلية الناضجة ويمكن إجراؤها في وجود تركيزات الأنسولين المختلفة وأثناء الانقباض الناجم عن التحفيز الكهربائي. الأهم من ذلك ، أن قياسات امتصاص الجلوكوز في العضلات الهيكلية المعزولة والمحتضنة ذات أهمية عند التحقيق في النمط الظاهري الأيضي للعضلات للفئران التي خضعت لتدخلات مختلفة (مثل التغذية والنشاط البدني والعدوى والعلاجات). نموذج العضلات الهيكلية المعزولة هو أيضا أداة مناسبة لاختبار المركبات الدوائية التي قد تؤثر على امتصاص الجلوكوز في حد ذاته و / أو تعديل حساسية الأنسولين12,14. وبهذه الطريقة ، يمكن اختبار وتقييم فعالية المركبات المصممة لتنظيم استقلاب الجلوكوز في العضلات في بيئة عالية التحكم قبل الاختبار اللاحق في الجسم الحي في النماذج الحيوانية قبل السريرية.
في ظل بعض الظروف ، قد تشكل الجدوى الأيضية تحديا في نظام نموذج العضلات الهيكلية المعزولة والمحتضنة. في الواقع ، فإن عدم وجود نظام الدورة الدموية في العضلات المحتضنة يستلزم أن تسليم الركائز (مثل الأكسجين والمواد المغذية) يعتمد بشكل كامل على الانتشار البسيط بين ألياف العضلات والبيئة المحيطة. فيما يتعلق بذلك ، من المهم أن تكون العضلات المحتضنة صغيرة ورقيقة ، وبالتالي ، تمثل حاجزا أقل أمام انتشار الأكسجين أثناء الحضانة15. خاصة أثناء الحضانة المطولة لعدة ساعات ، قد تتطور حالات نقص الأكسجين بسبب عدم كفاية إمدادات الأكسجين مما يؤدي إلى استنفاد طاقة العضلات15. على الرغم من أنه تم الإبلاغ سابقا عن علامات مختلفة للصلاحية الأيضية في عضلات الفئران المحتضنة إلى جانب تحديد المتغيرات المهمة التي تساعد على الحفاظ على صلاحية عضلات الفئران15 ، إلا أنه لا يزال هناك ما يبرر إجراء تقييم شامل للصلاحية الأيضية في عضلات الفئران الصغيرة المحتضنة. وبالتالي ، في الوقت الحاضر ، تم استخدام محتوى الجليكوجين بشكل رئيسي كعلامة على الجدوى الأيضية في العضلات الهيكلية للفأر المحتضن16,17.
هنا نصف بروتوكولا مفصلا لقياس امتصاص الجلوكوز القاعدي والأنسولين والانكماش في النعل المعزول والمحتضن وعضلات EDL من الفئران باستخدام [3H] 2-deoxy-D-glucose و [14C] مانيتول كعلامة خارج الخلية. في هذه الدراسة ، تم قياس امتصاص الجلوكوز خلال فترة 10 دقائق ويتم تقديم الطريقة باستخدام تركيزات الأنسولين دون الحد الأقصى والحد الأقصى من الفعالية بالإضافة إلى بروتوكول انكماش واحد. ومع ذلك ، يمكن بسهولة تعديل البروتوكولات الموضحة هنا فيما يتعلق بوقت الحضانة وجرعة الأنسولين وبروتوكول التحفيز الكهربائي. علاوة على ذلك ، نقدم توصيفا شاملا لعلامات مختلفة من الجدوى الأيضية في النعل المحتضن وعضلة الفأر EDL. تشير النتائج إلى أن مكملات الجلوكوز في مخزن الحضانة العازل ضرورية للحفاظ على الجدوى الأيضية للعضلات المحتضنة لمدة 1 ساعة.
وينبغي تنفيذ الإجراءات المتعلقة بحيوانات البحث وفقا للمبادئ التوجيهية ذات الصلة والتشريعات المحلية. وتمتثل جميع التجارب على الحيوانات المستخدمة في هذه الدراسة للاتفاقية الأوروبية لحماية الحيوانات الفقارية المستخدمة لأغراض تجريبية وأغراض علمية أخرى، ووافقت عليها مفتشية التجارب الحيوانية الدانمركية.
1. إعداد الجهاز التجريبي وحلقات الخياطة
ملاحظة: في هذه الدراسة ، استخدم نظام myograph متكامل لشريط العضلات مع خطافات حضانة مخصصة لاحتضان عضلات الهيكل العظمي للفئران المعزولة (الشكل 1). يسمح هذا النظام للعضلات بالاستحمام في محلول فسيولوجي مع الأوكسجين المستمر (95٪ O 2 و 5٪ CO2) وعند درجة حرارة ثابتة. يقترن حمام الأنسجة العضلية بمحول قوة لقياس إنتاج قوة العضلات أثناء الانقباض. لاستخلاص وتسجيل الاستجابات الميكانيكية العضلية أثناء الانكماش ، استخدم محفز نبض كهربائي وبرنامج لجمع البيانات ، على التوالي. تحفيز العضلات المحتضنة على الانقباض بواسطة أقطاب البلاتين الموضوعة مركزيا وعلى جانبي العضلات.
2. إعداد الحلول ووسائط الحضانة
3. الحيوانات وتشريح وحيد الفأر وعضلة EDL للحضانة
ملاحظة: ينبغي تنفيذ الإجراءات المتعلقة بحيوانات البحث وفقا للمبادئ التوجيهية ذات الصلة والتشريعات المحلية. يمكن استخدام الإجراء الموصوف مع الفئران الذكور والإناث المرباة داخليا أو المتاحة تجاريا من مختلف السلالات والخلفيات الوراثية. يتم توفير الإجراء التالي لإناث الفئران C57Bl/6J التي تم إطعامها. في المتوسط ، كان عمر الفئران 19 أسبوعا ووزنها 25 جم. تم الحفاظ على الفئران في دورة الضوء والظلام 12:12 ساعة مع حرية الوصول إلى تشاو القوارض القياسية والماء. بدأت التجارب على الحيوانات في حوالي الساعة 9:00 صباحا بالتوقيت المحلي وتم التضحية بجميع الحيوانات في غضون 2 ساعة.
4. امتصاص الجلوكوز المحفز بالأنسولين في العضلات الهيكلية للفأر المعزول
5. امتصاص الجلوكوز المحفز بالانقباض في العضلات الهيكلية للفأر المعزول
ملاحظة: للحث على تقلص العضلات الهيكلية للفأر المعزول ، استخدم البروتوكول التالي: 1 قطار / 15 ثانية ، كل قطار طوله 1 ثانية يتكون من نبضات 0.2 مللي ثانية يتم تسليمها عند 100 هرتز. ومع ذلك ، من المرجح أن تعمل بروتوكولات أخرى مماثلة تثير تقلص العضلات الهيكلية للفأر المعزول أيضا. الأهم من ذلك ، يجب ضبط الجهد لتوليد أقصى تطور للقوة للعضلة المحتضنة ، والتي تعتمد على الإعداد التجريبي. إذا لم يتم ضمان ذلك ، فقد تخاطر بعدم تقلص جميع ألياف العضلات. وهذا بدوره قد يؤدي إلى التحيز في مجموعة البيانات.
6. تجانس العضلات الهيكلية ومعالجتها
ملاحظة: الإجراء الوارد أدناه لتجانس العضلات يجعل من الممكن تحديد كل من امتصاص الجلوكوز وإشارات الخلايا العضلية عن طريق النشاف الغربي في نفس المجموعة من عينات العضلات.
7. تحديد 2-ديوكسي جلوكوز ومانيتول
8. حساب معدلات امتصاص الجلوكوز في العضلات
9. SDS-PAGE وتحليلات اللطخة الغربية
10. الجليكوجين العضلي ، النيوكليوتيدات ، اللاكتات ، الكرياتين ، والفوسفوكرياتين
11. الإحصائيات
كما هو موضح في الشكل 2 ، كانت معدلات امتصاص الجلوكوز القاعدي متشابهة بين النعل المعزول وعضلة EDL من الفئران الإناث. وقد تم الإبلاغ عن هذا أيضا عدة مرات قبل12،13،19،20. زاد امتصاص الجلوكوز بم?...
التنظيم السليم لامتصاص الجلوكوز في العضلات الهيكلية مهم للحفاظ على الصحة العامة1. وبالتالي ، فإن التحقيق في امتصاص الجلوكوز في العضلات غالبا ما يكون بمثابة قراءة أولية عند تقييم مختلف التدخلات التي تغير الصحة. هنا نصف طريقة خارج الجسم الحي لقياس امتصاص الجلوكوز في النعل المع...
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه
تم دعم هذا العمل من خلال منح من المجلس الدنماركي للبحوث المستقلة - العلوم الطبية (FSS8020-00288B) ومؤسسة نوفو نورديسك (NNF160C0023046). تم دعم هذا العمل أيضا من خلال منحة بحثية إلى راسموس كيوبستيد من الأكاديمية الدنماركية للسكري ، والتي تمولها مؤسسة نوفو نورديسك ، رقم المنحة NNF17SA0031406. يود المؤلفون أن يشكروا كارينا أولسن وبيتينا بولمغرين وإيرين بيش نيلسن (قسم التغذية والتمارين الرياضية والرياضة ، كلية العلوم ، جامعة كوبنهاغن) على مساعدتهم التقنية الماهرة.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
[14C]D-mannitol | American Radiolabeled Chemicals, Inc. | ARC 0127 | |
[3H]2-deoxy-D-glucose | American Radiolabeled Chemicals, Inc. | ART 0103A | |
2-Deoxy-D-glucose | Sigma | D8375 | |
4-0 USP non-sterile surgical nylon suture | Harvard Apparatus | 51-7698 | |
Streptavidin/HRP (Conjugate) | DAKO | P0397 | Used to detect ACC protein |
Akt2 antibody | Cell Signaling | 3063 | |
AMPKα2 antibody | Santa Cruz | SC-19131 | |
aprotinin | Sigma | A1153 | |
benzamidine | Sigma | B6505 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
CaCl2 | Merck | 1020831000 | |
Calibration kit (force) | Danish Myo Technology A/S | 300041 | |
Chemiluminescence | Millipore | WBLUF0500 | |
D-Glucose | Merck | 1084180100 | |
D-Mannitol | Sigma | M4125 | |
Data collection program | National Instruments | LabVIEW software version 7.1 | |
Dialysis tubing | Visking | DTV.12000.09 Size No.9 | |
Digital imaging system | BioRad | ChemiDoc MP | |
EDTA | Sigma EDS | E9884 | |
EGTA | Sigma | E4378 | |
Electrical Pulse Stimulator | Digitimer | D330 MultiStim System | |
Glycerol | Sigma | G7757 | |
HEPES | Sigma | H7637 | |
IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
Insulin | Novo Nordisk | Actrapid, 100 IE/mL | |
KCl | Merck | 1049361000 | |
KH2PO4 | Merck | 104873025 | |
leupeptin | Sigma | L2884 | |
MgSO4 | Merck | 1058860500 | |
Muscle Strip Myograph System | Danish Myo Technology A/S | Model 820MS | |
Na-Orthovanadate | Sigma | S6508 | |
Na-Pyrophosphate | Sigma | 221368 | |
Na-Pyruvate | Sigma | P2256 | |
NaCl | Merck | 106041000 | |
NaF | Sigma | S1504 | |
NaHCO3 | VWR | 27778260 | |
pACC Ser212 antibody | Cell Signaling | 3661 | |
pAkt Thr308 antibody | Cell Signaling | 9275 | |
pAMPK Thr172 antibody | Cell Signaling | 2531 | |
phenylmethylsulfonylfluoride | Sigma | P7626 | |
Platinum electrodes | Danish Myo Technology A/S | 300145 | |
pTBC1D4 Ser588 antibody | Cell Signaling | 8730 | |
Scintillation counter | Perkin Elmer | Tri-Carb-2910TR | |
Scintillation fluid | Perkin Elmer | 6013329 | |
Statistical analyses software | Systat | SigmaPlot version 14 | |
TBC1D4 antibody | Abcam | ab189890 | |
TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
Ultrapure water | Merck | Milli-Q Reference A+ System | |
β-glycerophosphate | Sigma | G9422 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved