JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

التنظيم السليم لامتصاص الجلوكوز في العضلات مهم للحفاظ على توازن الجلوكوز في الجسم كله. يقدم هذا البروتوكول تقييما لامتصاص الجلوكوز المحفز بالأنسولين والانكماش في العضلات الهيكلية الناضجة المعزولة والمحتضنة عند تحديد تأثير التدخلات الفسيولوجية المختلفة على استقلاب الجلوكوز في الجسم كله.

Abstract

العضلات الهيكلية هي نسيج مستجيب للأنسولين وعادة ما تستهلك معظم الجلوكوز الذي يدخل الدم بعد الوجبة. علاوة على ذلك ، فقد أفيد أن العضلات الهيكلية قد تزيد من استخراج الجلوكوز من الدم بنسبة تصل إلى 50 ضعفا أثناء التمرين مقارنة بظروف الراحة. تعتمد الزيادة في امتصاص الجلوكوز في العضلات أثناء التمرين وتحفيز الأنسولين على نقل ناقل الجلوكوز 4 (GLUT4) من المقصورات داخل الخلايا إلى غشاء سطح الخلية العضلية ، وكذلك فسفرة الجلوكوز إلى الجلوكوز 6-فوسفات بواسطة هيكسوكيناز II. عزل وحضانة عضلات الفئران مثل m. soleus و m . extensor digitorum longus (EDL) هو نموذج مناسب خارج الجسم الحي لدراسة آثار الأنسولين والانكماش الناجم عن الكهرباء (نموذج للممارسة) على امتصاص الجلوكوز في العضلات الهيكلية الناضجة. وبالتالي ، فإن نموذج خارج الجسم الحي يسمح بتقييم حساسية الأنسولين العضلية ويجعل من الممكن مطابقة إنتاج قوة العضلات أثناء الانقباض مما يضمن التوظيف الموحد لألياف العضلات أثناء قياسات امتصاص الجلوكوز في العضلات. علاوة على ذلك ، فإن النموذج الموصوف مناسب لاختبار المركبات الدوائية التي قد يكون لها تأثير على حساسية الأنسولين في العضلات أو قد تكون مفيدة عند محاولة تحديد التعقيد التنظيمي لامتصاص الجلوكوز في العضلات الهيكلية.

هنا نصف ونقدم بروتوكولا مفصلا حول كيفية قياس امتصاص الجلوكوز المحفز بالأنسولين والانكماش في المستحضرات المعزولة والمحتضنة للعضلات EDL من الفئران باستخدام الملصقات الإشعاعية [3H] 2-deoxy-D-glucose و [14C] مانيتول كعلامة خارج الخلية. هذا يسمح بإجراء تقييم دقيق لامتصاص الجلوكوز في العضلات الهيكلية الناضجة في غياب العوامل المربكة التي قد تتداخل مع النموذج الحيواني السليم. بالإضافة إلى ذلك ، نقدم معلومات حول الجدوى الأيضية للعضلات الهيكلية للفئران المحتضنة مما يشير إلى أن الطريقة المطبقة تمتلك بعض المحاذير في ظل ظروف معينة عند دراسة استقلاب طاقة العضلات.

Introduction

تمتلك العضلات الهيكلية القدرة على استخراج كميات كبيرة من الجلوكوز من الفضاء خارج الخلية استجابة للأنسولين وممارسة الرياضة. هذا يساعد على الحفاظ على توازن الجلوكوز في الجسم كله ويؤمن إمدادات الجلوكوز خلال أوقات ارتفاع الطلب على الطاقة. نظرا لأن التنظيم السليم لامتصاص الجلوكوز في العضلات الهيكلية قد ثبت أنه مهم للصحة العامة والأداء البدني 1,2 ، فقد حظيت قياسات امتصاص الجلوكوز في العضلات خلال ظروف مختلفة بالكثير من الاهتمام. في البشر والحيوانات ، تم استخدام المشبك مفرط الأنسولين وسكر الدم كتقنية قياسية ذهبية لتقييم حساسية الأنسولين في الجسم الحي 3,4. على النقيض من النتائج التي تم الحصول عليها من اختبار تحمل الجلوكوز عن طريق الفم ، فإن تقنية المشبك المفرط في الأنسولين وسكر الدم لا تتطلب وظيفة الجهاز الهضمي سليمة أو إفراز الأنسولين من البنكرياس ، وبالتالي تسمح بمقارنة استجابات الأنسولين بين الأشخاص الذين يظهرون اختلافات في وظيفة المعدة والأمعاء و / أو البنكرياس. تم إجراء قياسات امتصاص الجلوكوز في العضلات في الجسم الحي أثناء التمرين في البشر بشكل متكرر منذ 1960s5. أولا باستخدام تقنيات التوازن الشرياني الوريدي6 وبعد ذلك باستخدام التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) بالاشتراك مع البوزيترون الذي ينبعث منه الجلوكوز التناظري على سبيل المثال 18F-Fluoro-deoxy-glucose7. في القوارض ، عادة ما يتم امتصاص الجلوكوز في العضلات المحفزة للتمرين في الجسم الحي عن طريق استخدام نظائرها المشعة أو المستقرة من الجلوكوز المسمى بالنظائر8،9،10.

طريقة مكملة لقياسات امتصاص الجلوكوز في العضلات في الجسم الحي ، هي عزل واحتضان العضلات الصغيرة من القوارض وبالتالي قياس امتصاص الجلوكوز باستخدام نظائرها المشعة أو المستقرة من نظائر الجلوكوز11،12،13. تسمح هذه الطريقة بتحديد كمي دقيق وموثوق به لمعدلات امتصاص الجلوكوز في العضلات الهيكلية الناضجة ويمكن إجراؤها في وجود تركيزات الأنسولين المختلفة وأثناء الانقباض الناجم عن التحفيز الكهربائي. الأهم من ذلك ، أن قياسات امتصاص الجلوكوز في العضلات الهيكلية المعزولة والمحتضنة ذات أهمية عند التحقيق في النمط الظاهري الأيضي للعضلات للفئران التي خضعت لتدخلات مختلفة (مثل التغذية والنشاط البدني والعدوى والعلاجات). نموذج العضلات الهيكلية المعزولة هو أيضا أداة مناسبة لاختبار المركبات الدوائية التي قد تؤثر على امتصاص الجلوكوز في حد ذاته و / أو تعديل حساسية الأنسولين12,14. وبهذه الطريقة ، يمكن اختبار وتقييم فعالية المركبات المصممة لتنظيم استقلاب الجلوكوز في العضلات في بيئة عالية التحكم قبل الاختبار اللاحق في الجسم الحي في النماذج الحيوانية قبل السريرية.

في ظل بعض الظروف ، قد تشكل الجدوى الأيضية تحديا في نظام نموذج العضلات الهيكلية المعزولة والمحتضنة. في الواقع ، فإن عدم وجود نظام الدورة الدموية في العضلات المحتضنة يستلزم أن تسليم الركائز (مثل الأكسجين والمواد المغذية) يعتمد بشكل كامل على الانتشار البسيط بين ألياف العضلات والبيئة المحيطة. فيما يتعلق بذلك ، من المهم أن تكون العضلات المحتضنة صغيرة ورقيقة ، وبالتالي ، تمثل حاجزا أقل أمام انتشار الأكسجين أثناء الحضانة15. خاصة أثناء الحضانة المطولة لعدة ساعات ، قد تتطور حالات نقص الأكسجين بسبب عدم كفاية إمدادات الأكسجين مما يؤدي إلى استنفاد طاقة العضلات15. على الرغم من أنه تم الإبلاغ سابقا عن علامات مختلفة للصلاحية الأيضية في عضلات الفئران المحتضنة إلى جانب تحديد المتغيرات المهمة التي تساعد على الحفاظ على صلاحية عضلات الفئران15 ، إلا أنه لا يزال هناك ما يبرر إجراء تقييم شامل للصلاحية الأيضية في عضلات الفئران الصغيرة المحتضنة. وبالتالي ، في الوقت الحاضر ، تم استخدام محتوى الجليكوجين بشكل رئيسي كعلامة على الجدوى الأيضية في العضلات الهيكلية للفأر المحتضن16,17.

هنا نصف بروتوكولا مفصلا لقياس امتصاص الجلوكوز القاعدي والأنسولين والانكماش في النعل المعزول والمحتضن وعضلات EDL من الفئران باستخدام [3H] 2-deoxy-D-glucose و [14C] مانيتول كعلامة خارج الخلية. في هذه الدراسة ، تم قياس امتصاص الجلوكوز خلال فترة 10 دقائق ويتم تقديم الطريقة باستخدام تركيزات الأنسولين دون الحد الأقصى والحد الأقصى من الفعالية بالإضافة إلى بروتوكول انكماش واحد. ومع ذلك ، يمكن بسهولة تعديل البروتوكولات الموضحة هنا فيما يتعلق بوقت الحضانة وجرعة الأنسولين وبروتوكول التحفيز الكهربائي. علاوة على ذلك ، نقدم توصيفا شاملا لعلامات مختلفة من الجدوى الأيضية في النعل المحتضن وعضلة الفأر EDL. تشير النتائج إلى أن مكملات الجلوكوز في مخزن الحضانة العازل ضرورية للحفاظ على الجدوى الأيضية للعضلات المحتضنة لمدة 1 ساعة.

Protocol

وينبغي تنفيذ الإجراءات المتعلقة بحيوانات البحث وفقا للمبادئ التوجيهية ذات الصلة والتشريعات المحلية. وتمتثل جميع التجارب على الحيوانات المستخدمة في هذه الدراسة للاتفاقية الأوروبية لحماية الحيوانات الفقارية المستخدمة لأغراض تجريبية وأغراض علمية أخرى، ووافقت عليها مفتشية التجارب الحيوانية الدانمركية.

1. إعداد الجهاز التجريبي وحلقات الخياطة

ملاحظة: في هذه الدراسة ، استخدم نظام myograph متكامل لشريط العضلات مع خطافات حضانة مخصصة لاحتضان عضلات الهيكل العظمي للفئران المعزولة (الشكل 1). يسمح هذا النظام للعضلات بالاستحمام في محلول فسيولوجي مع الأوكسجين المستمر (95٪ O 2 و 5٪ CO2) وعند درجة حرارة ثابتة. يقترن حمام الأنسجة العضلية بمحول قوة لقياس إنتاج قوة العضلات أثناء الانقباض. لاستخلاص وتسجيل الاستجابات الميكانيكية العضلية أثناء الانكماش ، استخدم محفز نبض كهربائي وبرنامج لجمع البيانات ، على التوالي. تحفيز العضلات المحتضنة على الانقباض بواسطة أقطاب البلاتين الموضوعة مركزيا وعلى جانبي العضلات.

  1. قم بتشغيل نظام myograph والغرف الدافئة إلى 30 درجة مئوية. برنامج مفتوح لجمع البيانات متوافق مع نظام myograph ومعايرة محولات القوة لضمان قابلية المقارنة بين مجموعات البيانات.
  2. ابدأ بقطع خيوط ~ 16 سم من خياطة النايلون الجراحية غير القابلة للامتصاص. استخدم الملقط لإنشاء حلقة قطرها حوالي 0.4 سم من خيط واحد. كرر ذلك حتى يتم إنتاج ما يكفي من الحلقات. تحتاج كل عضلة إلى حلقتين - واحدة للوتر القريب والأخرى للوتر البعيد.

2. إعداد الحلول ووسائط الحضانة

  1. إعداد وسائط الحضانة القاعدية
    1. تحضير حلول المخزون التالية: 2.5 م كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم ، 250 مل) ، 0.5 م بيكربونات الصوديوم (ناهكو3 ، 250 مل) ، 0.5 م كلوريد البوتاسيوم (KCl ، 50 مل) ، 0.25 م كلوريد الكالسيوم (كاكل 2 ، 50 مل) ، 0.25 م فوسفات ثنائي هيدروجين البوتاسيوم (KH2 PO 4 ، 50 مل) ، 0.25 م كبريتات المغنيسيوم (MgSO4 ، 50 مل) ، 110 م بيروفات الصوديوم (Na-Pyruvate ، 100 مل)، 500 ملليمتر D-مانيتول (100 مل)، 1 م 2-ديوكسي-د-جلوكوز (4 مل)، محلول 15٪ من ألبومين مصل البقر (BSA) منزوع ضد المخزن المؤقت Krebs-Ringer-Henseleit (KRH) (الموضح أدناه في الخطوة 4) (100 مل).
      ملاحظة: هناك حاجة إلى حلين لقياس امتصاص الجلوكوز أثناء الراحة والانكماش. علاوة على ذلك ، يتطلب كل تركيز أنسولين واحد يستخدم لتقييم امتصاص الجلوكوز المحفز بالأنسولين حلين. وبالتالي ، في المجموع ، هناك حاجة إلى ستة حلول مختلفة لقياس امتصاص الجلوكوز القاعدي ، والأنسولين دون الحد الأقصى ، والأنسولين الأقصى ، وامتصاص الجلوكوز المحفز بالانقباض في العضلات الهيكلية للفأر المعزولة. في ما يلي ، تشير "وسائط الحضانة القاعدية" إلى الوسائط التي لا تحتوي على الأنسولين أو المقتفيات الإشعاعية. تشير "وسائط الحضانة" إلى الوسائط التي تحتوي على الأنسولين. تشير "وسائط حضانة امتصاص الجلوكوز" إلى الوسائط التي تحتوي على 2-deoxy-D-glucose والمقتفيات المشعة بالإضافة إلى الأنسولين بتركيز مماثل لتلك المستخدمة في "وسائط الحضانة".
    2. قم بإعداد مخزن مؤقت KRH عن طريق استكمال الماء فائق النقاء (ddH 2 O) مع كلوريد الصوديوم (117 ملليمتر) ، NaHCO3 (24.6 ملليمتر) ، KCl (4.7 ملليمتر) ، CaCl 2 (2.5 ملليمتر) ، KH 2 PO 4 (1.2 ملليمتر) ، و MgSO4 (1.2ملليمتر). في وقت لاحق ، قم بالغاز في المخزن المؤقت KRH مع 95٪ O 2 و 5٪ CO2 لمدة 10 دقائق على الأقل. يجب أن يكون الرقم الهيدروجيني المطلوب للمخزن المؤقت KRH بين 7.35-7.45 عند 30 درجة مئوية. إذا تم إجراء تعديل الرقم الهيدروجيني في درجة حرارة الغرفة ، فيجب أن يكون الرقم الهيدروجيني للمخزن المؤقت KRH بين 7.25-7.35.
    3. أضف BSA (0.1٪) و Na-Pyruvate (2 mM) و D-mannitol (8 mM) إلى المخزن المؤقت KRH المعدل بالغاز والرقم الهيدروجيني لإكمال وسائط الحضانة القاعدية. قم بتخزين وسائط الحضانة القاعدية في حاوية مغلقة لتقليل إزالة الغاز من O 2 و CO2 ووضع الوسائط عند 30 درجة مئوية.
      ملاحظة: عادة ، يتم الحفاظ على الأسمولية لمكملات KRH (أي Na-Pyruvate و D-Mannitol و D-glucose) ثابتة عبر تجربة كاملة لتجنب انكماش أو توسع خلايا العضلات. يستخدم البروتوكول الموصوف هنا تناضحا قدره 10 mM لمكملات KRH. إذا كانت هناك حاجة إلى مخزن مؤقت يحتوي على الجلوكوز ، فاستبدل مكملات KRH لتلبية الاحتياجات ، على سبيل المثال 5 mM D-glucose و 5 mM D-mannitol.
    4. لتجنب الملوثات المحتملة المرتبطة ب BSA في المخزن المؤقت للحضانة ، قم بتحويل BSA ضد KRH.
      1. لصنع محلول مخزون BSA بنسبة 15٪ منزوع ضد مخزن KRH المؤقت ، ابدأ بإذابة 300 غرام من BSA الخالي من الدهون من الدرجة التحليلية في 900 مل من المخزن المؤقت KRH. بعد ذلك ، قم بغلي أنبوب غسيل الكلى في ماء معاد تقطيره حتى يصبح الأنبوب ناعما.
      2. املأ الأنابيب بمحلول BSA-KRH وقم بتأمين نهايات الأنابيب. ضع الأنبوب مع BSA-KRH في 5 لتر من المخزن المؤقت KRH واتركه طوال الليل عند 4 درجات مئوية. في اليوم التالي ، استبدل المخزن المؤقت KRH واترك الأنابيب مع BSA-KRH في المخزن المؤقت KRH بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
      3. أخيرا ، اجمع محلول BSA-KRH من الأنابيب وأضف المخزن المؤقت KRH إلى حجم نهائي قدره 2 لتر (أي محلول مخزون BSA-KRH بنسبة 15٪). قسم محلول مخزون BSA-KRH بنسبة 15٪ إلى أليكوتس وخزنه في الفريزر عند ~-20 درجة مئوية.
  2. إعداد وسائط الحضانة التي تحتوي على الأنسولين
    1. بالنسبة لوسائط الحضانة التي تحتوي على تركيز أنسولين فعال إلى أقصى حد ، أضف 1 ميكرولتر من محلول مخزون الأنسولين 100 mU / mL لكل مل من وسائط الحضانة القاعدية (100 μU / mL الأنسولين).
    2. بالنسبة لوسائط الحضانة التي تحتوي على تركيز الأنسولين الفعال إلى أقصى حد ، أضف 1 ميكرولتر من محلول مخزون الأنسولين 10 U / mL لكل مل من وسائط الحضانة القاعدية (10 mU / mL الأنسولين).
  3. إعداد وسائط حضانة امتصاص الجلوكوز
    تنبيه: لا يسمح بمناولة المواد المشعة إلا في منطقة مقيدة وخاضعة للرقابة من قبل الموظفين المأذون لهم، وقد تشترط بعض الجامعات ومؤسسات البحوث والشركات الحصول على "تصريح استخدام النشاط الإشعاعي". يجب التعامل مع المواد والنفايات وفقا للإجراءات والمبادئ التوجيهية والتشريعات المحلية المناسبة.
    1. اتبع نفس الإجراء كما هو موضح في القسم 2.1.2.
    2. أضف BSA (0.1٪) و Na-Pyruvate (2 mM) و D-mannitol (7 mM) و 2-deoxy-D-glucose (1 mM) إلى المخزن المؤقت KRH المعدل بالغاز والرقم الهيدروجيني.
    3. أضف [3H]2-deoxy-D-glucose (0.028 MBq/mL) و [14C] مانيتول (0.0083 MBq/mL) إلى مخزن KRH المخزن المؤقت المكمل لإكمال وسائط حضانة امتصاص الجلوكوز. يخزن على درجة حرارة 30 درجة مئوية. إذا تم إذابة [3H] 2-deoxy-D-glucose و [14C] مانيتول في الإيثانول ، فقم بإزالة الإيثانول عن طريق التبخر بوساطة N2 قبل الاستخدام.
    4. بالنسبة لوسائط حضانة امتصاص الجلوكوز التي تحتوي على تركيز أنسولين فعال دون الحد الأقصى ، أضف 1 ميكرولتر من محلول مخزون الأنسولين 100 mU / mL لكل مل من وسائط حضانة امتصاص الجلوكوز (100 μU / mL الأنسولين).
    5. بالنسبة لوسائط حضانة امتصاص الجلوكوز التي تحتوي على تركيز أنسولين فعال إلى أقصى حد ، أضف 1 ميكرولتر من محلول مخزون الأنسولين 10 U / mL لكل مل من وسائط حضانة امتصاص الجلوكوز (10 mU / mL الأنسولين).

3. الحيوانات وتشريح وحيد الفأر وعضلة EDL للحضانة

ملاحظة: ينبغي تنفيذ الإجراءات المتعلقة بحيوانات البحث وفقا للمبادئ التوجيهية ذات الصلة والتشريعات المحلية. يمكن استخدام الإجراء الموصوف مع الفئران الذكور والإناث المرباة داخليا أو المتاحة تجاريا من مختلف السلالات والخلفيات الوراثية. يتم توفير الإجراء التالي لإناث الفئران C57Bl/6J التي تم إطعامها. في المتوسط ، كان عمر الفئران 19 أسبوعا ووزنها 25 جم. تم الحفاظ على الفئران في دورة الضوء والظلام 12:12 ساعة مع حرية الوصول إلى تشاو القوارض القياسية والماء. بدأت التجارب على الحيوانات في حوالي الساعة 9:00 صباحا بالتوقيت المحلي وتم التضحية بجميع الحيوانات في غضون 2 ساعة.

  1. أضف 4 مل من وسائط الحضانة القاعدية المسخنة مسبقا (30 درجة مئوية) إلى كل غرفة حضانة وتأكد من أكسجة وسائط الحضانة القاعدية باستمرار مع 95٪ O 2 و 5٪ CO2.
  2. تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من البنتوباربيتال (10 ملغ / 100 غرام من وزن الجسم) أو غيرها من التخدير المتاحة (مثل ثلاثي برومو إيثانول).
    ملاحظة: كن على علم بأنه في بعض البلدان قد تكون هناك حاجة إلى ترخيص للتعامل مع البنتوباربيتال وأدوية التخدير الأخرى. قبل البدء في تشريح العضلات ، يجب تحفيز تخدير كل بشكل صحيح. لضمان ذلك ، يتم اختبار ردود فعل الذيل والساق. للحصول على أفضل النتائج ، يجب ممارسة التشريح جيدا لتجنب إتلاف العضلات أثناء الإزالة.
  3. ضع الفئران المخدرة المعرضة للتخدير على صينية تشريح (مثل غطاء الستايروفوم) وقم بتثبيت الكفوف الأمامية والخلفية ، حسب الضرورة ، باستخدام إبرة.
  4. قم بإزالة الجلد من أسفل الساق وتأكد من أن كل من وتر العرقوب ومفصل الركبة مرئيان.
    1. لتشريح العضلة الوحيدة، ابدأ بربط حلقة خياطة واحدة بوتر أخيل. قم بتثبيت ملقط البازلاء على وتر أخيل بعيدا عن حلقة الخياطة وقطعه لإطلاق عضلات النعل والمعدة من المخلب. حرك ملقط البازلاء بعناية عبر الماوس وبالتالي كشف العضلة الوحيدة.
    2. ثبت ملقط البازلاء وضع حلقة خياطة ثانية حول الوتر القريب من العضلة الوحيدة. بعد ذلك ، قم بقطع الوتر القريب وتشريح النعل (بما في ذلك حلقتا الخياطة المرفقتان) خالية من عضلة المعدة والأوعية الدموية. ضع العضلة الوحيدة بسرعة في غرفة الحضانة عن طريق ربط كل حلقة خياطة بالخطافات المعنية.
  5. قم بإزالة اللفافة التي تغطي M. tibialis الأمامي (TA) باستخدام الملقط. إذا تم القيام به بشكل صحيح ، يجب أن تكون الأوتار البعيدة لعضلات TA و EDL بيضاء واضحة ومرئية ؛ وفصلها عن بعضها البعض.
  6. قطع الوتر البعيد لعضلة TA وتشريح العضلات لتحليلها لاحقا (مثل التنميط الجيني). باستخدام الملقط ، حرر عضلة EDL بلطف من الأنسجة المحيطة ولكن اترك العضلات سليمة ولا تقطع الأوتار. ضع حلقة خياطة واحدة حول الوتر البعيد وحلقة خياطة ثانية حول الوتر القريب من EDL.
  7. بعد ذلك ، قم بقطع الأوتار التي تطلق عضلة EDL بحلقتي خياطة متصلتين ووضع العضلة بسرعة في غرفة الحضانة عن طريق ربط كل حلقة خياطة بالخطافات المعنية. من أجل عدم فقدان التوتر أثناء الحضانة وخاصة أثناء الانكماش الناجم عن الكهرباء لعضلات النعل و EDL ، من الأهمية بمكان إصلاح حلقات الخياطة حول الأوتار ذات العقد الضيقة.
  8. وأخيرا ، القتل الرحيم للحيوان عن طريق خلع عنق الرحم على سبيل المثال.
  9. عندما يتم تشريح العضلات ووضعها في غرف الحضانة ، اضبط توتر الراحة لكل عضلة إلى ~ 5 mN وقم باحتضان العضلات مسبقا لمدة 10 دقائق على الأقل قبل بدء البروتوكول التجريبي.

4. امتصاص الجلوكوز المحفز بالأنسولين في العضلات الهيكلية للفأر المعزول

  1. بعد الخطوة 3.9 ، استبدل وسائط الحضانة القاعدية بوسائط حضانة لا تحتوي على أنسولين (وسائط حضانة قاعدية) ، أو تركيز أنسولين فعال إلى أقصى حد أو تركيز أنسولين فعال إلى أقصى حد ويترك في غرف الحضانة لمدة 20 دقيقة. قم بفصل كل غرفة حضانة بمقدار 1 دقيقة ، مما يوفر الوقت للحصاد اللاحق للعضلات.
  2. في نهاية فترة التحفيز التي تبلغ 20 دقيقة ، استبدل وسائط الحضانة بوسائط حضانة امتصاص الجلوكوز التي تحتوي على تركيز مماثل من الأنسولين واتركها في غرف الحضانة لمدة 10 دقائق ، مرة أخرى مع تباعد 1 دقيقة بين كل غرفة حضانة.
  3. بعد 10 دقائق من الحضانة في وسائط حضانة امتصاص الجلوكوز ، قم بإزالة العضلات بلطف من غرف الحضانة واغسلها في وسائط حضانة قاعدية باردة مثلجة. بعد ذلك ، قم بتجفيف العضلات بسرعة على ورق الترشيح قبل إزالة حلقات الخياطة وتجميد العضلات في النيتروجين السائل. من الضروري أن يتم حصاد العضلات المحتضنة بسرعة إذا كان المرء يرغب أيضا في التحقيق في مختلف المستقلبات داخل الخلايا وإشارات البروتين بالإضافة إلى امتصاص الجلوكوز.
  4. جمع 100 ميكرولتر من وسائط حضانة امتصاص الجلوكوز من كل غرفة حضانة وتخزينها في -20 درجة مئوية. سيتم تضمين كمية النشاط الإشعاعي في هذه العينات في حساب امتصاص الجلوكوز في العضلات.

5. امتصاص الجلوكوز المحفز بالانقباض في العضلات الهيكلية للفأر المعزول

ملاحظة: للحث على تقلص العضلات الهيكلية للفأر المعزول ، استخدم البروتوكول التالي: 1 قطار / 15 ثانية ، كل قطار طوله 1 ثانية يتكون من نبضات 0.2 مللي ثانية يتم تسليمها عند 100 هرتز. ومع ذلك ، من المرجح أن تعمل بروتوكولات أخرى مماثلة تثير تقلص العضلات الهيكلية للفأر المعزول أيضا. الأهم من ذلك ، يجب ضبط الجهد لتوليد أقصى تطور للقوة للعضلة المحتضنة ، والتي تعتمد على الإعداد التجريبي. إذا لم يتم ضمان ذلك ، فقد تخاطر بعدم تقلص جميع ألياف العضلات. وهذا بدوره قد يؤدي إلى التحيز في مجموعة البيانات.

  1. بعد الخطوة 3.9 ، ضع أقطاب البلاتين مركزيا وعلى جانبي العضلات. بدء تقلص العضلات مباشرة بعد استبدال وسائط الحضانة القاعدية بوسائط حضانة امتصاص الجلوكوز. إذا كان ذلك ممكنا ، قم بفصل كل غرفة حضانة بمقدار 1 دقيقة ، مما يوفر الوقت للحصاد اللاحق للعضلات. تذكر تسجيل إنتاج القوة من كل عضلة محتضنة.
  2. بعد 10 دقائق من الانقباض في وسائط حضانة امتصاص الجلوكوز ، قم بإزالة أقطاب البلاتين ، وجمع العضلات بلطف من غرف الحضانة وغسلها في وسائط حضانة القاعدية الباردة على الجليد. بعد ذلك ، قم بتجفيف العضلات بسرعة على ورق الترشيح قبل إزالة حلقات الخياطة وتجميد العضلات في النيتروجين السائل. يجب إجراء عملية حصاد العضلات بأكملها في أسرع وقت ممكن.
  3. جمع 100 ميكرولتر من وسائط حضانة امتصاص الجلوكوز من كل غرفة حضانة وتخزينها في -20 درجة مئوية. سيتم تضمين كمية النشاط الإشعاعي في هذه العينات في حساب امتصاص الجلوكوز في العضلات.

6. تجانس العضلات الهيكلية ومعالجتها

ملاحظة: الإجراء الوارد أدناه لتجانس العضلات يجعل من الممكن تحديد كل من امتصاص الجلوكوز وإشارات الخلايا العضلية عن طريق النشاف الغربي في نفس المجموعة من عينات العضلات.

  1. تجانس كل عضلة في 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت البارد مع درجة الحموضة 7.5 التي تحتوي على 10٪ من الجلسرين ، 20 ملم الصوديوم بيروفوسفات ، 1٪ IGEPAL CA-630 (NP-40) ، 2 ملليمتر فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد (المذاب في الأيزوبروبانول) ، 150 ملم كلوريد الصوديوم ، 50 ملم كلوريد الصوديوم ، 50 ملم من هيبس ، 20 ملليمتر β جليسيروفوسفات ، فلوريد الصوديوم 10 ملليمتر (NaF) ، 1 ملم حمض الإيثيلين ديامين تتراسيتيك (EDTA) ، 1 ملليمتر جليكول ديامين تتراسيتيك حمض (EGTA) ، 10 ميكروغرام / مل من البروتينين ، 10 ميكروغرام/مل ليوبيبتين، 3 ملم بنزاميدين، و2 مللي متر صوديوم-أورثوفانادات باستخدام حبات فولاذية ومحلل أنسجة (2 × 45 ثانية عند 30 هرتز). قم بتدوير جميع المتجانسات من طرف إلى طرف لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية وبعد ذلك يتم طردها مركزيا عند 16000 × g لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. جمع الليزات (supernatant) الذي يستخدم لتحديد امتصاص الجلوكوز في العضلات.

7. تحديد 2-ديوكسي جلوكوز ومانيتول

  1. أضف 150 ميكرولتر من كل محللة عضلية و 25 ميكرولتر من وسائط حضانة امتصاص الجلوكوز من كل غرفة حضانة لفصل قوارير عد التلألؤ السائل التي تحتوي على 2 مل من سائل التلألؤ السائل. علاوة على ذلك ، قم بإعداد قارورتي تحكم عمياء تحتويان فقط على 3 مل من سائل التلألؤ السائل. أغلق جميع القوارير واخلطها جيدا عن طريق دوامة كل قارورة لمدة 5 ثوان تقريبا.
  2. ضع القوارير في عداد تلألؤ سائل وقم بقياس النشاط الإشعاعي ل [3H]2-deoxy-D-glucose و [14C] مانيتول وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. سجل DPM (التفكك في الدقيقة) لكل قارورة تلألؤ سائلة.

8. حساب معدلات امتصاص الجلوكوز في العضلات

  1. استخدم الليزات من الخطوة 6.1 لقياس تركيز البروتين الكلي في كل عينة عضلية باستخدام طرق قياس كمية البروتين القياسية (على سبيل المثال ، حمض Bicinchoninic أو مقايسات برادفورد). احسب كمية البروتين (ملغ) المضافة إلى كل قارورة تلألؤ.
    ملاحظة: يتم حساب معدل امتصاص الجلوكوز لكل عينة عضلية عن طريق طرح كمية [3 H]2-deoxy-D-glucose الموجودة في الفضاء خارج الخلية من إجمالي كمية [3H]2-deoxy-D-glucose في عينة العضلات باستخدام [14C] مانيتول كعلامة خارج الخلية. من المفترض أن [3H] 2-deoxy-D-glucose و [14C] مانيتول يظهران خصائص انتشار مماثلة داخل الأنسجة العضلية أثناء الحضانة. قم بإجراء العمليات الحسابية التالية:
  2. ابدأ بطرح [3H] و [14C] DPM لعينات التحكم العمياء من جميع عينات العضلات والوسائط.
  3. تحديد الفضاء خارج الخلية العضلية في ميكرولتر (μL-ECS):
    [14ج] DPM العضلات / ([14C] DPMوسائل الإعلام / Mالمجلد)
  4. احسب مقدار [3 H] DPM في الفضاء خارج الخلية العضلي ([3H]DPMECS):
    μL-ECS × ([3H]وسائط DPM / Mvol)
  5. احسب مقدار [3 H] DPM في الفضاء داخل الخلايا العضلية ([3H]DPMICS):
    [3ح] DPM العضلات − [3ساعة] DMMECS
  6. حساب معدل امتصاص الجلوكوز في العضلات (ميكرومول / غرام من البروتين / ساعة):
    [3ح] DPMICS / ([3H] DPMMedia / Mvol) / [2-deoxy-D-glucose])) / mg protein) / Th
    ملاحظة: بالنسبة لجميع المعادلات أعلاه،
    [14ج] عضلة DPM هي كمية النشاط الإشعاعي [14C] مانيتول في عينة العضلات.
    [14ج] وسائط DPM هي كمية النشاط الإشعاعي [14C] مانيتول في عينة من الوسائط.
    [3ح] عضلة DPM هي كمية [3H] 2-deoxy-D-glucose radioactivity في عينة العضلات.
    [3ح] وسائطDPM هي كمية النشاط الإشعاعي [3H]2-deoxy-D-glucose في عينة من الوسائط.
    [3ح] DPMECS هو مقدار [3H] 2-deoxy-D-glucose الإشعاعي في الفضاء خارج الخلية العضلي.
    [3ح] DPMICS هو مقدار [3H] 2-deoxy-D-glucose الإشعاعي في الفضاء داخل الخلايا العضلية.
    μL-ECS هو الفضاء خارج الخلية العضلية في μL.
    Mvol هو حجم (μL) من وسائط الحضانة المستخدمة في عد التلألؤ (على سبيل المثال "25" كما هو مذكور أعلاه) ؛
    Th هو عامل الوقت المستخدم لحساب معدلات الامتصاص في الساعة (أي "1/6" عند احتضان العضلات ذات وسائط امتصاص الجلوكوز لمدة 10 دقائق)
  7. ضع في اعتبارك حساب هذا المثال. تم طرح [3H] و [14C] DPM لعينات التحكم العمياء (17 و 6 ، على التوالي) من قيم DPM المذكورة أدناه.
    [14ج] عضلة DPM: 343
    [14ج] وسائط DPM: 11846
    [3ح] عضلة DPM: 4467
    [3ح] وسائط DPM: 39814
    مالمجلد : 25
    ملغ البروتين: 0.396 (في 150 ميكرولتر بروتين العضلات lysate)
    [2-ديوكسي-D-الجلوكوز]: 1 (ملليمتر)
    ر ح: 1/6 (ح)
    μL-ECS = 343 DPM / (11846 DPM / 25 μL) = 0.724 μL
    [3ح] DPMECS: 0.724 ميكرولتر × (39814 DPM / 25 ميكرولتر) = 1153 DPM
    [3ح] DPMICS: 4467 DPM - 1153 DPM = 3314 DPM
    امتصاص الجلوكوز: ((3314 DPM / (39814 DPM / 25 ميكرولتر) / 1 مليمول / لتر) / 0.396 ملغ بروتين) / (1/6 ساعة) = 31.53 ميكرومول / غرام بروتين / ساعة

9. SDS-PAGE وتحليلات اللطخة الغربية

  1. تحضير سوليوس و EDL العضلات محللات في المخزن المؤقت Laemmli وتسخينه لمدة 5 دقائق عند 96 درجة مئوية.
  2. افصل كميات متساوية من بروتين العضلات بواسطة SDS-PAGE على المواد الهلامية ذاتية الصب ونقل البروتينات إلى أغشية فلوريد البولي فينيلدين عن طريق النشاف شبه الجاف.
  3. في وقت لاحق ، تحتضن الأغشية في محلول ملحي مخزن مؤقتا يحتوي على 0.05٪ Tween 20 و 2٪ حليب خالي الدسم وأغشية التحقيق مع الأجسام المضادة الأولية والثانوية ذات الصلة.
  4. الكشف عن البروتينات مع التلألؤ الكيميائي وتصورها بواسطة نظام التصوير الرقمي.

10. الجليكوجين العضلي ، النيوكليوتيدات ، اللاكتات ، الكرياتين ، والفوسفوكرياتين

  1. استخدم حمض البيركلوريك لاستخراج عينات EDL والعضلات المنفردة.
  2. بعد ذلك ، تحييد العينات وتحليلها للاكتات والكرياتين والفوسفوكرياتين كما هو موضح سابقا18.
  3. تحليل محتوى النيوكليوتيدات في EDL والعضلات المنفردة عن طريق HPLC في المرحلة العكسية بعد الاستخراج في حمض البيركلوريك.
  4. تحديد محتوى الجليكوجين العضلي في تجانس العضلات بالكامل كوحدات جليكوزيل بعد التحلل المائي الحمضي بطريقة فلورومترية كما هو موضح سابقا18.

11. الإحصائيات

  1. إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام برنامج التحليلات الإحصائية.
  2. استخدم اختبار التحليل ثنائي الاتجاه للتباين (ANOVA) لتقييم الفروق الإحصائية بين القيم المعروضة في الجدول 1.
  3. استخدم اختبارات t للطلاب غير المقترنة لتقييم الاختلافات الإحصائية في امتصاص الجلوكوز بين EDL و soleus داخل كل مجموعة معروضة في الشكل 2. تقديم البيانات كوسيلة ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM). P < 0.05 يعتبر ذا دلالة إحصائية.

النتائج

كما هو موضح في الشكل 2 ، كانت معدلات امتصاص الجلوكوز القاعدي متشابهة بين النعل المعزول وعضلة EDL من الفئران الإناث. وقد تم الإبلاغ عن هذا أيضا عدة مرات قبل12،13،19،20. زاد امتصاص الجلوكوز بم?...

Discussion

التنظيم السليم لامتصاص الجلوكوز في العضلات الهيكلية مهم للحفاظ على الصحة العامة1. وبالتالي ، فإن التحقيق في امتصاص الجلوكوز في العضلات غالبا ما يكون بمثابة قراءة أولية عند تقييم مختلف التدخلات التي تغير الصحة. هنا نصف طريقة خارج الجسم الحي لقياس امتصاص الجلوكوز في النعل المع...

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من خلال منح من المجلس الدنماركي للبحوث المستقلة - العلوم الطبية (FSS8020-00288B) ومؤسسة نوفو نورديسك (NNF160C0023046). تم دعم هذا العمل أيضا من خلال منحة بحثية إلى راسموس كيوبستيد من الأكاديمية الدنماركية للسكري ، والتي تمولها مؤسسة نوفو نورديسك ، رقم المنحة NNF17SA0031406. يود المؤلفون أن يشكروا كارينا أولسن وبيتينا بولمغرين وإيرين بيش نيلسن (قسم التغذية والتمارين الرياضية والرياضة ، كلية العلوم ، جامعة كوبنهاغن) على مساعدتهم التقنية الماهرة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
[14C]D-mannitolAmerican Radiolabeled Chemicals, Inc.ARC 0127
[3H]2-deoxy-D-glucose American Radiolabeled Chemicals, Inc.ART 0103A
2-Deoxy-D-glucoseSigmaD8375
4-0 USP non-sterile surgical nylon sutureHarvard Apparatus51-7698
Streptavidin/HRP (Conjugate)DAKOP0397Used to detect ACC protein
Akt2 antibodyCell Signaling3063
AMPKα2 antibodySanta CruzSC-19131
aprotininSigmaA1153
benzamidineSigmaB6505
Bovine serum albumin (BSA)SigmaA7030
CaCl2Merck1020831000
Calibration kit (force)Danish Myo Technology A/S300041
ChemiluminescenceMilliporeWBLUF0500
D-GlucoseMerck1084180100
D-MannitolSigmaM4125
Data collection programNational InstrumentsLabVIEW software version 7.1
Dialysis tubingViskingDTV.12000.09 Size No.9
Digital imaging systemBioRadChemiDoc MP
EDTASigma EDSE9884
EGTASigmaE4378
Electrical Pulse StimulatorDigitimerD330 MultiStim System
GlycerolSigmaG7757
HEPESSigmaH7637
IGEPAL CA-630 SigmaI8896
InsulinNovo NordiskActrapid, 100 IE/mL
KClMerck1049361000
KH2PO4Merck104873025
leupeptinSigmaL2884
MgSO4Merck1058860500
Muscle Strip Myograph SystemDanish Myo Technology A/SModel 820MS
Na-OrthovanadateSigmaS6508
Na-PyrophosphateSigma221368
Na-PyruvateSigmaP2256
NaClMerck106041000
NaFSigmaS1504
NaHCO3VWR27778260
pACC Ser212 antibodyCell Signaling3661
pAkt Thr308 antibodyCell Signaling9275
pAMPK Thr172 antibodyCell Signaling2531
phenylmethylsulfonylfluorideSigmaP7626
Platinum electrodesDanish Myo Technology A/S300145
pTBC1D4 Ser588 antibodyCell Signaling8730
Scintillation counterPerkin ElmerTri-Carb-2910TR
Scintillation fluid Perkin Elmer6013329
Statistical analyses softwareSystatSigmaPlot version 14
TBC1D4 antibodyAbcamab189890
TissueLyser II Qiagen85300
Ultrapure waterMerckMilli-Q Reference A+ System
β-glycerophosphateSigmaG9422

References

  1. DeFronzo, R., Tripathy, D. Skeletal muscle insulin resistance is the primary defect in type 2 diabetes. Diabetes Care. 32, 157-163 (2009).
  2. Coyle, E. F., et al. Carbohydrate feeding during prolonged strenuous exercise can delay fatigue. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 55 (1), 230-235 (1983).
  3. Kim, J. K. Hyperinsulinemic-euglycemic clamp to assess insulin sensitivity in vivo. Methods in Molecular Biology. 560, 221-238 (2009).
  4. Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55 (2), 390-397 (2006).
  5. Richter, E. A., Hargreaves, M. Exercise, GLUT4, and skeletal muscle glucose uptake. Physiological Reviews. 93 (3), 993-1017 (2013).
  6. Sanders, C. A., Levinson, G. E., Abelmann, W. H., Freinkel, N. Effect of exercise on the peripheral utilization of glucose in man. The New England Journal of Medicine. 271, 220-225 (1964).
  7. Barrington, S. F., Maisey, M. N. Skeletal muscle uptake of fluorine-18-FDG: effect of oral diazepam. Journal of Nuclear Medicine Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 37 (7), 1127-1129 (1996).
  8. Fentz, J., et al. AMPKα is critical for enhancing skeletal muscle fatty acid utilization during in vivo exercise in mice. FASEB Journal. 29 (5), 1725-1738 (2015).
  9. Maarbjerg, S. J., et al. Genetic impairment of AMPKalpha2 signaling does not reduce muscle glucose uptake during treadmill exercise in mice. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 297 (4), 924-934 (2009).
  10. Stöckli, J., et al. The RabGAP TBC1D1 plays a central role in exercise-regulated glucose metabolism in skeletal muscle. Diabetes. 64 (6), 1914-1922 (2015).
  11. Jørgensen, S. B., et al. Knockout of the alpha2 but not alpha1 5'-AMP-activated protein kinase isoform abolishes 5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-beta-4-ribofuranosidebut not contraction-induced glucose uptake in skeletal muscle. The Journal of Biological Chemistry. 279 (2), (2004).
  12. Kjøbsted, R., et al. Prior AICAR stimulation increases insulin sensitivity in mouse skeletal muscle in an AMPK-dependent manner. Diabetes. 64 (6), 2042-2055 (2015).
  13. Lantier, L., et al. AMPK controls exercise endurance, mitochondrial oxidative capacity, and skeletal muscle integrity. FASEB Journal. 28 (7), 3211-3224 (2014).
  14. Cokorinos, E. C., et al. Activation of skeletal muscle AMPK promotes glucose disposal and glucose lowering in non-human primates and mice. Cell Metabolism. 25 (5), 1147-1159 (2017).
  15. Bonen, A., Clark, M. G., Henriksen, E. J. Experimental approaches in muscle metabolism: hindlimb perfusion and isolated muscle incubations. The American Journal of Physiology. 266, 1-16 (1994).
  16. van Breda, E., Keizer, H. A., Glatz, J. F., Geurten, P. Use of the intact mouse skeletal-muscle preparation for metabolic studies. Evaluation of the model. The Biochemical Journal. 267 (1), 257-260 (1990).
  17. Sogaard, P., et al. Effects of fibre type and diffusion distance on mouse skeletal muscle glycogen content in vitro. Journal of Cellular Biochemistry. 107 (6), 1189-1197 (2009).
  18. Lowry, O. H., Passonneau, J. V. Typical fluorometric procedures for metabolite assays. A Flexible System of Enzymatic Analysis. , 68-92 (1972).
  19. Jensen, T. E., et al. Contraction-stimulated glucose transport in muscle is controlled by AMPK and mechanical stress but not sarcoplasmatic reticulum Ca(2+) release. Molecular Metabolism. 3 (7), 742-753 (2014).
  20. Kristensen, J. M., Treebak, J. T., Schjerling, P., Goodyear, L., Wojtaszewski, J. F. P. Two weeks of metformin treatment induces AMPK-dependent enhancement of insulin-stimulated glucose uptake in mouse soleus muscle. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 306 (10), 1099-1109 (2014).
  21. Szekeres, F., et al. The Rab-GTPase-activating protein TBC1D1 regulates skeletal muscle glucose metabolism. AJP: Endocrinology and Metabolism. 303 (4), 524-533 (2012).
  22. Pehmøller, C., et al. Genetic disruption of AMPK signaling abolishes both contraction- and insulin-stimulated TBC1D1 phosphorylation and 14-3-3 binding in mouse skeletal muscle. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297 (3), 665-675 (2009).
  23. Ryder, J. W., Bassel-Duby, R., Olson, E. N., Zierath, J. R. Skeletal muscle reprogramming by activation of calcineurin improves insulin action on metabolic pathways. The Journal of Biological Chemistry. 278 (45), 44298-44304 (2003).
  24. Long, Y. C., Glund, S., Garcia-Roves, P. M., Zierath, J. R. Calcineurin regulates skeletal muscle metabolism via coordinated changes in gene expression. The Journal of Biological Chemistry. 282 (3), 1607-1614 (2007).
  25. Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PloS One. 7 (4), 35273 (2012).
  26. Roche, S. M., Gumucio, J. P., Brooks, S. V., Mendias, C. L., Claflin, D. R. Measurement of maximum isometric force generated by permeabilized skeletal muscle fibers. Journal of Visualized Experiments. (100), e52695 (2015).
  27. Park, K. H., et al. Ex vivo assessment of contractility, fatigability and alternans in isolated skeletal muscles. Journal of Visualized Experiments. (69), e4198 (2012).
  28. Tullson, P. C., Terjung, R. L. Adenine nucleotide metabolism in contracting skeletal muscle. Exercise and Sport Sciences Reviews. 19, 507-537 (1991).
  29. Wojtaszewski, J. F., Jakobsen, A. B., Ploug, T., Richter, E. A. Perfused rat hindlimb is suitable for skeletal muscle glucose transport measurements. The American Journal of Physiology. 274 (1), 184-191 (1998).
  30. Hansen, P. A., Gulve, E. A., Holloszy, J. O. Suitability of 2-deoxyglucose for in vitro measurement of glucose transport activity in skeletal muscle. Journal of AppliedPhysiology. 76 (2), 979-985 (1994).
  31. Watson-Wright, W. M., Tan, M. H., Bonen, A. Insulin binding and 2-deoxy-D-glucose uptake in fast- and slow-twitch mouse skeletal muscle at 18 and 37 degrees C. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 62 (12), 1460-1465 (1984).
  32. Hansen, P. A., Marshall, B. A., Chen, M., Holloszy, J. O., Mueckler, M. Transgenic overexpression of hexokinase II in skeletal muscle does not increase glucose disposal in wild-type or Glut1-overexpressing mice. The Journal of Biological Chemistry. 275 (29), (2000).
  33. Virkamäki, A., Rissanen, E., Hämäläinen, S., Utriainen, T., Yki-Järvinen, H. Incorporation of [3-3H]glucose and 2-[1-14C]deoxyglucose into glycogen in heart and skeletal muscle in vivo: implications for the quantitation of tissue glucose uptake. Diabetes. 46 (7), 1106-1110 (1997).
  34. Bhave, G., Neilson, E. G. Body fluid dynamics: back to the future. Journal of the American Society of Nephrology JASN. 22 (12), 2166-2181 (2011).
  35. Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P. Metabolism and the circadian clock converge. Physiological Reviews. 93 (1), 107-135 (2013).
  36. Dyar, K. A., et al. Muscle insulin sensitivity and glucose metabolism are controlled by the intrinsic muscle clock. Molecular Metabolism. 3 (1), 29-41 (2014).
  37. Basse, A. L., et al. Skeletal muscle insulin sensitivity show circadian rhythmicity which is independent of exercise training status. Frontiers in Physiology. 9, 1198 (2018).
  38. Segal, S. S., Faulkner, J. A. Temperature-dependent physiological stability of rat skeletal muscle in vitro. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 248 (3), 265-270 (1985).
  39. Wallberg-Henriksson, H. Glucose transport into skeletal muscle. Influence of contractile activity, insulin, catecholamines and diabetes mellitus. Acta Physiologica Scandinavica. Supplementum. 564, 1-80 (1987).
  40. Alkhateeb, H., Chabowski, A., Bonen, A. Viability of the isolated soleus muscle during long-term incubation. Applied Physiology, Nutrition, and Metabolism. 31 (4), 467-476 (2006).
  41. Cleland, P. J., Rattigan, S., Clark, M. G. Glucose-induced loss of exercise-mediated 3-0-methyl glucose uptake by isolated rat soleus and epitrochlearis muscles. Hormone and Metabolic Research. 22 (2), 121-122 (1990).
  42. Gulve, E. A., Cartee, G. D., Holloszy, J. O. Prolonged incubation of skeletal muscle in vitro: prevention of increases in glucose transport. The American Journal of Physiology. 261 (1), 154-160 (1991).
  43. Deshmukh, A. S., et al. Deep proteomics of mouse skeletal muscle enables quantitation of protein isoforms, metabolic pathways, and transcription factors. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 841-853 (2015).
  44. Rudich, A., Klip, A. Push/pull mechanisms of GLUT4 traffic in muscle cells. Acta physiologica Scandinavica. 178 (4), 297-308 (2003).
  45. Kjøbsted, R., et al. Enhanced muscle insulin sensitivity after contraction/exercise is mediated by AMPK. Diabetes. 66 (3), 598-612 (2017).
  46. Kjøbsted, R., et al. TBC1D4 is necessary for enhancing muscle insulin sensitivity in response to AICAR and contraction. Diabetes. 68 (9), 1756-1766 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

171 2 deoxy D glucose

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved