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要約

筋肉グルコース取り込みの無傷の調節は、全身グルコース恒常性を維持するために重要である。このプロトコルは、全身のグルコース代謝に対する様々な生理学的介入の影響を描写する際に、単離およびインキュベートされた成熟骨格筋におけるインスリンおよび収縮刺激グルコース取り込みの評価を提示する。

要約

骨格筋はインスリン応答性組織であり、典型的には食事後に血液に入るグルコースの大部分を吸収する。また、骨格筋は、運動中に血液からのグルコースの抽出を安静時に比べて最大50倍に増加させることが報告されている。運動およびインスリン刺激中の筋肉グルコース取り込みの増加は、細胞内区画から筋細胞表面膜へのグルコーストランスポーター4(GLUT4)の転座、ならびにヘキソキナーゼIIによるグルコースのグルコース-6-リン酸へのリン酸化に依存する。ミレやm.エクステンサー・デジトルム・ロンガス(EDL)などのマウス筋肉の単離とインキュベーションは、成熟骨格筋におけるグルコース取り込みに対するインスリンおよび電気的に誘発された収縮(運動のためのモデル)の影響を研究するための適切なエクスビボモデルである。したがって、ex vivoモデルは、筋インスリン感受性の評価を可能にし、収縮中の筋力産生を一致させ、筋グルコース取り込みの測定中に筋線維の均一な動員を保証することを可能にする。さらに、記載されたモデルは、筋インスリン感受性に影響を与え得るか、または骨格筋グルコース取り込みの調節的複雑さを描写しようとする際に有用であり得る薬理学的化合物試験に適している。

ここでは、放射性標識された[3H]2-デオキシ-D-グルコースおよび[14C]マンニトールを細胞外マーカーとして用いて、マウスから単離およびインキュベートしたヒラメおよびEDL筋肉調製物におけるインスリンおよび収縮刺激グルコース取り込みを測定する方法に関する詳細なプロトコールを記載および提供する。これにより、無傷の動物モデルに干渉し得る交絡因子の非存在下での成熟骨格筋におけるグルコース取り込みの正確な評価が可能になる。さらに、我々は、インキュベートされたマウス骨格筋の代謝生存率に関する情報を提供し、筋肉エネルギー代謝を研究する際に、適用された方法が特定の条件下でいくつかの注意点を有することを示唆している。

概要

骨格筋は、インスリンおよび運動に応答して細胞外空間から大量のグルコースを抽出する能力を有する。これは、全身のグルコース恒常性を維持するのに役立ち、高いエネルギー需要の時にグルコース供給を確保します。骨格筋グルコース取り込みの無傷の調節が全体的な健康および身体能力にとって重要であることが示されているので1,2、様々な状態における筋肉グルコース取り込みの測定は多くの注目を集めている。ヒトおよび動物において、高インスリン血症 - 正常血糖クランプは、インビボでのインスリン感受性を評価するためのゴールドスタンダード技術として使用されている3,4。経口糖負荷試験から得られた所見とは対照的に、高インスリン血糖 - 正常血糖クランプ技術は、無傷の胃腸機能または膵臓からのインスリン分泌を必要としないため、胃腸および/または膵臓機能に変動を示す被験者間でインスリン応答を比較することを可能にする。ヒトにおける運動中の生体内での筋肉グルコース取り込みの測定は、1960年代から頻繁に行われてきた5。最初に動静脈平衡技術6の使用によって、そして後に陽電子放出グルコース類似体例えば18F−フルオロデオキシグルコース7と組み合わせた陽電子放出断層撮影(PET)画像化の使用による。げっ歯類において、運動刺激筋肉インビボでのグルコース取り込みは、典型的には、放射性または安定同位体標識グルコース類似体8、9、10の使用によって行われる。

インビボでの筋肉グルコース取り込みの測定に相補的な方法は、げっ歯類から小筋肉を単離およびインキュベートし、続いて放射性または安定同位体標識グルコース類似体を用いてグルコース取り込みを測定することである11、12、13。この方法は、成熟骨格筋におけるグルコース取り込み速度の正確かつ信頼性の高い定量を可能にし、様々なインスリン濃度の存在下で、および電気刺激によって誘発される収縮中に行うことができる。さらに重要なことに、単離およびインキュベートされた骨格筋におけるグルコース取り込みの測定は、様々な介入(例えば栄養、身体活動、感染、治療薬)を受けたマウスの筋肉代謝表現型を調査する際に関連性がある。単離された骨格筋モデルは、グルコース取り込み自体に影響を及ぼし、および/またはインスリン感受性を変化させる可能性のある薬理学的化合物試験のための適切なツールでもある12,14。このようにして、筋肉グルコース代謝を調節するように設計された化合物の有効性を、前臨床動物モデルにおけるその後のin vivo試験の前に、高度に制御された環境で試験および評価することができる。

いくつかの条件下では、代謝生存率は、単離およびインキュベートされた骨格筋モデル系において課題を提起し得る。実際、インキュベートされた筋肉における循環系の欠如は、基質(例えば酸素および栄養素)の送達が筋線維と周囲の環境との間の単純な拡散に完全に依存することを伴う。これに関して、インキュベートされた筋肉が小さくて薄く、したがって、インキュベーション中の酸素拡散のための障壁が少ないことが重要である15。特に数時間の長時間のインキュベーション中に、酸素供給が不十分で筋肉エネルギーが枯渇するため、低酸素状態が発症することがあります15。インキュベートされたラット筋肉における代謝生存率の様々なマーカーが、ラット筋肉の生存率を維持するのに役立つ重要な変数の同定とともに以前に報告されているが15、小さなインキュベートされたマウス筋肉における代謝生存率の包括的な評価は依然として正当化される。したがって、現在のところ、グリコーゲン含量は、主にインキュベートされたマウス骨格筋における代謝生存率のマーカーとして使用されている16、17。

ここでは、放射性標識された[3H]2-デオキシ-D-グルコースおよび[14C]マンニトールを細胞外マーカーとして用いて、マウスから単離およびインキュベートしたヒラメ筋およびEDL筋における基礎、インスリンおよび収縮刺激グルコース取り込みを測定するための詳細なプロトコールについて説明する。本研究では、グルコース取り込みを10分間に測定し、この方法は、サブ最大および最大に有効なインスリン濃度ならびに単一の収縮プロトコールの使用を提示する。しかしながら、本明細書に記載されるプロトコルは、インキュベーション時間、インスリン投与量、および電気刺激プロトコルに関して容易に変更することができる。さらに、インキュベートされたヒラメおよびEDLマウス筋肉における代謝生存率の様々なマーカーの徹底的な特徴付けを提供する。この結果は、インキュベーションバッファーへのグルコース補給が、1時間インキュベートした筋肉の代謝生存率を維持するために不可欠であることを示している。

プロトコル

研究動物に関する手続きは、関連するガイドラインおよび現地の法律に従って実施されるべきである。この研究に使用されたすべての動物実験は、実験的およびその他の科学的目的に使用される脊椎動物の保護に関する欧州条約に準拠しており、デンマーク動物実験検査官によって承認されました。

1. 実験装置及び縫合ループの作製

注:この研究では、カスタマイズされたインキュベーションフックを備えた統合筋ストリップ筋電図システムを使用して、単離されたマウス骨格筋をインキュベートします(図1)。このシステムは、筋肉が連続的な酸素化(95%O2および5%CO2)および一定の温度で生理学的溶液に浸すことを可能にする。筋組織浴は、収縮中の筋力産生の測定のための力トランスデューサに結合される。収縮中の筋力学的応答を惹起して記録するには、それぞれ電気パルス刺激装置およびデータ収集プログラムを使用する。インキュベートした筋肉を刺激し、筋肉の中央と両側に配置された白金電極によって収縮させます。

  1. ミオグラフシステムをオンにし、チャンバーを30°Cに温めます。 筋電計システムと互換性のあるオープンデータ収集ソフトウェアと力トランスデューサを較正して、データセット間の比較可能性を確保します。
  2. まず、約16cmの非吸収性外科用ナイロン縫合糸を切断することから始めます。鉗子を使用して、1本のストランドから直径約0.4cmのループを作成します。十分なループが生成されるまで、これを繰り返します。各筋肉には2つのループが必要です - 1つは近位用、もう1つは遠位腱用です。

2. 溶液およびインキュベーション培地の調製

  1. 基礎インキュベーション培地の調製
    1. 2.5 M 塩化ナトリウム (NaCl, 250 mL), 0.5 M 炭酸水素ナトリウム (NaHCO3, 250 mL), 0.5 M 塩化カリウム (KCl, 50 mL), 0.25 M 塩化カルシウム (CaCl 2, 50 mL), 0.25 M リン酸二水素カリウム (KH2 PO 4, 50 mL), 0.25 M 硫酸マグネシウム (MgSO4, 50 mL), 110 mM ピルビン酸ナトリウム (Na-ピルビン酸, 100mL)、500mM D−マンニトール(100mL)、1M 2−デオキシ−D−グルコース(4mL)、クレブス・リンガー・ヘンゼライト(KRH)緩衝液(ステップ4で後述)に対してウシ血清アルブミン(BSA)の15%溶液(100mL)を透析した。
      注:安静時および収縮刺激グルコース取り込みを測定するには、2つの溶液が必要です。さらに、インスリン刺激グルコース取り込みを評価するために使用される各単一インスリン濃度は、2つの溶液を必要とする。したがって、単離されたマウス骨格筋における基礎、極小インスリン、最大インスリン、および収縮刺激グルコース取り込みを測定するには、合計6つの異なる溶液が必要である。以下において、「基礎インキュベーション培地」とは、インスリンまたは放射性トレーサーを含まない培地をいう。「インキュベーション培地」は、インスリンを含有する培地を指す。「グルコース取り込みインキュベーション培地」は、「インキュベーション培地」で使用されるものと同じ濃度でインスリンに加えて2−デオキシ−D−グルコースおよび放射性トレーサーを含有する培地を指す。
    2. 超純水(ddH2O)にNaCl(117 mM)、NaHCO3(24.6mM)、KCl(4.7 mM)、CaCl 2(2.5 mM)、KH 2PO 4(1.2 mM)、および MgSO 4 (1.2 mM) を補充して KRH バッファーを調製します。続いて、KRH緩衝液を95%O2および5%CO2で少なくとも10分間ガス化する。KRH緩衝液の所望のpHは、30°Cで7.35〜7.45の間であるべきである。 pH調整を室温で行う場合、KRH緩衝液のpHは7.25〜7.35の範囲でなければなりません。
    3. BSA(0.1%)、ピルビン酸Na(2 mM)、およびD-マンニトール(8 mM)をガス化およびpH調整KRH緩衝液に加え、基礎インキュベーション培地を完成させた。基礎インキュベーション培地を密閉容器に保管して、O2 およびCO2 の脱気を最小限に抑え、培地を30°Cで配置する。
      注:典型的には、KRHサプリメント(すなわち、Na-ピルビン酸、D-マンニトール、およびD-グルコース)の浸透圧は、筋肉細胞の収縮または膨張を避けるために、実験全体にわたって一定に保たれる。本明細書に記載のプロトコルは、KRHサプリメントに対して10mMのオスモル濃度を使用する。グルコース含有緩衝液が必要な場合は、KRHサプリメントをニーズに合わせて交換してください(例:5 mM D-グルコースおよび5 mM D-マンニトール)。
    4. インキュベーションバッファー中のBSA関連汚染物質の可能性を回避するために、KRHに対してBSAを透析します。
      1. KRH緩衝液に対して透析して15%BSAストック溶液を作るには、まず300gの分析グレードの無脂肪BSAを900mLのKRH緩衝液に溶解します。次に、透析チューブを再蒸留水でチューブが柔らかくなるまで沸騰させます。
      2. チューブにBSA-KRH溶液を充填し、チューブの端部を固定します。BSA-KRHを含むチューブを5LのKRHバッファーに入れ、4°Cで一晩放置する。 翌日、KRH緩衝液を交換し、チューブをBSA-KRHと共にKRH緩衝液中に4°Cで一晩放置した。
      3. 最後に、チューブからBSA-KRH溶液を収集し、KRH緩衝液を最終容量2L(すなわち、15%BSA-KRHストック溶液)に添加する。15%BSA-KRHストック溶液をアリコートに分割し、〜-20°Cの冷凍庫に保管する。
  2. インスリンを含有するインキュベーション培地の調製
    1. 最大以下の有効インスリン濃度を含むインキュベーション培地の場合、基礎インキュベーション培地(100 μU/mLインスリン)の1 mLあたり100 mU/mLインスリンストック溶液を1 μL加えます。
    2. 最大有効インスリン濃度を含むインキュベーション培地の場合、基礎インキュベーション培地(10 mU/mLインスリン)1 mLあたり10 U/mLインスリンストック溶液を1 μL加えます。
  3. グルコース取り込みインキュベーション培地の調製
    注意:放射性物質の取り扱いは、許可された職員によって制限および管理された地域でのみ許可されており、一部の大学、研究機関、企業では「放射能使用許可証」の取得が必要な場合があります。材料と廃棄物は、適切な現地の手順、ガイドライン、および法律に従って処理する必要があります。
    1. セクション 2.1.2 で説明されているのと同じ手順に従います。
    2. BSA(0.1%)、ピルビン酸Na(2mM)、D-マンニトール(7mM)、および2-デオキシ-D-グルコース(1mM)をガス化およびpH調整KRH緩衝液に加える。
    3. 補充されたKRH緩衝液に[3H]2-デオキシ-D-グルコース(0.028 MBq/mL)および[14C]マンニトール(0.0083 MBq/mL)を加え、グルコース取り込みインキュベーション培地を完成させる。30°Cで保存してください。 [3H]2-デオキシ-D-グルコースおよび[14C]マンニトールがエタノールに溶解している場合は、使用前にN2 媒介蒸発によりエタノールを除去する。
    4. 最大以下の有効インスリン濃度を含むグルコース取り込みインキュベーション培地の場合、グルコース取り込みインキュベーション培地(100 μU/mLインスリン)の1 mLあたり100 mU/mLのインスリンストック溶液を1 μL加えます。
    5. 最大有効インスリン濃度を含むグルコース取り込みインキュベーション培地の場合、グルコース取り込みインキュベーション培地(10 mU/mLインスリン)1 mLあたり10 U/mLインスリンストック溶液を1 μL加える。

3.動物および孵卵のためのマウスヒラメおよびEDL筋肉の解剖

注:研究動物に関する手続きは、関連するガイドラインおよび現地の法律に従って行う必要があります。記載された手順は、様々な系統および遺伝的背景を有する自家飼育または市販の雄および雌マウスと共に使用することができる。以下の手順は、給餌された雌性C57Bl/6Jマウスに対して提供される。平均して、マウスは19週齢であり、体重は25gであった。マウスは、標準的なげっ歯類のチャウおよび水への自由なアクセスを伴う12:12時間の明暗サイクルで維持された。動物実験は現地時間の午前9時~で開始され、すべての動物を2時間以内に屠殺した。

  1. 4 mLの予備加温(30°C)基礎インキュベーション培地を各インキュベーションチャンバーに追加し、基礎インキュベーション培地が95%O2 および5%CO2で連続的に酸素化されていることを確認します。
  2. ペントバルビタール(10mg / 100g体重)または他の利用可能な麻酔(例えばトリブロモエタノール)の腹腔内注射でマウスを麻酔する。
    注:一部の国では、ペントバルビタールやその他の麻酔薬を取り扱うためのライセンスが必要な場合があります。筋肉解剖を開始する前に、各動物の麻酔を適切に誘導しなければならない。これを確実にするために、尾と脚の反射がテストされます。最適な結果を得るためには、除去中に筋肉を傷つけないように解剖をよく実践する必要があります。
  3. 麻酔をかけやすいマウスを解剖トレイ(例えば発泡スチロールの蓋)の上に置き、必要に応じて針を使用して前足と後足を固定する。
  4. 下肢から皮膚を取り除き、アキレス腱と膝関節の両方が見えることを確認します。
    1. ヒラメ筋の解剖のために、アキレス腱に単一の縫合ループを取り付けることから始める。縫合ループの遠位にあるアキレス腱にエンドウ豆の鉗子を固定し、切断して足からヒラメと腓腹筋を解放します。マウスを横切ってエンドウ豆の鉗子を慎重にスライドさせ、ヒラメの筋肉を露出させます。
    2. エンドウ豆の鉗子をピン留めし、ヒラメの近位腱の周りに2回目の縫合ループを置きます。次に、近位腱を切断し、腓腹筋のないヒラメ(取り付けられた2つの縫合ループを含む)を解剖する。各縫合ループをそれぞれのフックに取り付けることによって、ヒラメ筋をインキュベーションチャンバーに素早く配置する。
  5. 鉗子を用いて 前脛骨 炎(TA)を覆う筋膜を除去する。正しく行われれば、TAおよびEDL筋肉の遠位腱は白色で透明で見えるはずである。そして互いに分離した。
  6. TA筋の遠位腱を切断し、後の分析(例えば、遺伝子型決定)のために筋肉を解剖する。鉗子を使用して、EDL筋肉を周囲の組織から穏やかに解放するが、筋肉をそのまま残し、腱を切らさない。遠位腱の周りに1つの縫合ループを配置し、EDLの近位腱の周りに2番目の縫合ループを配置する。
  7. 次に、EDL筋を解放する腱を2つの縫合ループで切断し、各縫合ループをそれぞれのフックに取り付けて筋肉をインキュベーションチャンバーに素早く配置します。孵卵中、特にヒラメおよびEDL筋肉の電気的に誘発された収縮中に緊張を失わないためには、腱の周りの縫合ループをタイトな結び目で固定することが非常に重要です。
  8. 最後に、例えば子宮頸部脱臼によって動物を安楽死させる。
  9. 筋肉を解剖し、インキュベーションチャンバーに入れたら、各筋肉の安静時張力を〜5mNに調整し、実験プロトコールを開始する前に筋肉を少なくとも10分間プレインキュベートする。

4. 単離されたマウス骨格筋におけるインスリン刺激グルコース取り込み

  1. ステップ3.9に続いて、基礎インキュベーション培地をインスリンを含まないインキュベーション培地(基礎インキュベーション培地)、最大効果以下のインスリン濃度または最大有効インスリン濃度と交換し、インキュベーションチャンバーに20分間放置する。各インキュベーションチャンバを1分間間隔を空け、それによって筋肉のその後の収穫のための時間を作る。
  2. 20分間の刺激期間の終わりに、インキュベーション培地を同一濃度のインスリンを含むグルコース取り込みインキュベーション培地と交換し、インキュベーションチャンバ内に10分間放置し、再度各インキュベーションチャンバ間に1分間間隔をあけて放置する。
  3. グルコース取り込みインキュベーション培地中での10分間のインキュベーションの後、インキュベーションチャンバから筋肉を穏やかに除去し、氷冷基礎インキュベーション培地で洗浄する。その後、縫合ループが除去され、筋肉が液体窒素で凍結される前に、ろ紙上の筋肉を素早く乾燥させる。グルコース取り込みに加えて、様々な細胞内代謝産物およびタンパク質シグナル伝達を調査したい場合は、インキュベートされた筋肉を迅速に採取することが不可欠である。
  4. 各インキュベーションチャンバーから100 μLのグルコース取り込みインキュベーション培地を収集し、-20°Cで保存します。 これらのサンプル中の放射能の量は、筋肉グルコース取り込みの計算に含まれるであろう。

5. 単離されたマウス骨格筋における収縮刺激グルコース取り込み

注:孤立したマウス骨格筋の収縮を誘導するには、次のプロトコルを使用します:1列車/15秒、各列車1秒の長さは100Hzで送達される0.2msパルスからなる。しかし、単離されたマウス骨格筋の収縮を誘発する他の同様のプロトコルも同様に機能する可能性が高い。重要なことに、インキュベートされた筋肉の最大力発達を生成するように電圧を調整する必要があり、これは実験セットアップに依存する。これが保証されていない場合、筋肉のすべての繊維が収縮しているわけではないというリスクがあります。その結果、データセットにバイアスが発生する可能性があります。

  1. ステップ3.9に続いて、白金電極を中央および筋肉の両側に配置する。基礎インキュベーション培地をグルコース取り込みインキュベーション培地で交換した直後に筋肉の収縮を開始する。可能であれば、各インキュベーションチャンバを1分間間隔を空け、その後の筋肉の収穫のための時間を作る。インキュベートされた各筋肉からの力の生産を記録することを忘れないでください。
  2. グルコース取り込みインキュベーション培地で10分間収縮した後、白金電極を取り外し、インキュベーションチャンバから筋肉を静かに集め、氷冷基礎インキュベーション培地で洗浄する。その後、縫合糸ループが除去され、筋肉が液体窒素で凍結する前に、ろ紙上の筋肉を素早く乾燥させる。筋肉採取手順全体は、できるだけ早く実行する必要があります。
  3. 各インキュベーションチャンバーから100 μLのグルコース取り込みインキュベーション培地を収集し、-20°Cで保存します。 これらのサンプル中の放射能の量は、筋肉グルコース取り込みの計算に含まれるであろう。

6. 骨格筋の均質化と処理

注:筋肉の均質化のために以下に与えられる手順は、筋肉サンプルの同じセットにおけるウェスタンブロッティングによってグルコース取り込みおよび筋細胞シグナル伝達の両方を決定することを可能にする。

  1. 10%グリセロール、20 mM ピロリン酸ナトリウム、1% IGEPAL CA-630 (NP-40)、2 mM フェニルメチルスルホニルフルオリド (イソプロパノールに溶解)、150 mM NaCl、50 mM HEPES、20 mM β-グリセロリン酸、10 mM フッ化ナトリウム (NaF)、1 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、1 mM グリコールエーテルジアミン四酢酸 (EGTA)、10 μg/ml アプロチニンを含む pH 7.5 で各筋肉をホモジナイズし、 10 μg/mL のロイペプチン、3 mM ベンズアミジン、および 2 mM ナトリウム - オルトバナジン酸塩をスチールビーズと組織溶解装置 (30 Hz で 2 x 45 s) を使用。すべてのホモジネートを4°Cで1時間エンドオーバーエンド回転させた後、16,000 x g で4°Cで20分間遠心分離します。 筋肉のグルコース取り込みを決定するために使用される溶解液(上清)を収集します。

放射性標識2-デオキシグルコースおよびマンニトールの測定

  1. 各インキュベーションチャンバから150 μLの各筋肉溶解物および25 μLのグルコース取り込みインキュベーション培地を、2 mLの液体シンチレーション流体を含む別々の液体シンチレーション計数バイアルに加える。さらに、3mLの液体シンチレーション液のみを含む2つのブラインドコントロールバイアルを調製する。すべてのバイアルを閉じ、各バイアルを約5秒間ボルテックスして徹底的に混合します。
  2. バイアルを液体シンチレーションカウンターに入れ、[3H]2-デオキシ-D-グルコースと[14C]マンニトールの放射能をメーカーのガイドラインに従って測定します。各液体シンチレーションバイアルのDPM(1分あたりの崩壊)を記録します。

8. 筋肉のグルコース取り込み率の計算

  1. ステップ6.1からの溶解物を使用して、標準的なタンパク質定量法(例えば、ビシンコニン酸またはブラッドフォードアッセイ)を使用して、各筋肉サンプル中の総タンパク質濃度を測定する。各シンチレーションバイアルに添加するタンパク質量(mg)を計算する。
    注:各筋肉サンプルのグルコース取り込み率は、[14C]マンニトールを細胞外マーカーとして用いた筋肉サンプル中の[3H]2-デオキシ-D-グルコースの総量から細胞外空間に位置する[3H]2-デオキシ-D-グルコースの量を差し引くことによって計算される。[3H]2-デオキシ-D-グルコースおよび[14C]マンニトールは、インキュベーション中に筋肉組織内で同様の拡散特性を示すと推定される。次の計算を実行します。
  2. まず、すべての筋肉および培地サンプルから盲検対照サンプルの[3H]および[14C]DPMを差し引くことから始めます。
  3. 筋肉細胞外空間をμL(μL-ECS)で決定する:
    [14C]DPM筋肉 / ([14C]DPMメディア / Mボリューム)
  4. 筋肉細胞外空間における[3H]DPMの量を計算する([3H]DPMECS):
    μL-ECS × ([3H]DPM培地 / Mvol)
  5. 筋肉細胞内空間における[3H]DPMの量を計算する([3H]DPMICS):
    [3時間]DPM筋肉− [3時間] DPMECS
  6. 筋肉グルコース取り込み速度(μmol/gタンパク質/時間)を計算する:
    [3時間]DPMICS / ([3H]DPM培地 / Mvol) / [2-デオキシ-D-グルコース])) / mg タンパク質) / Th
    注: 上記のすべての方程式について、
    [14C]DPM筋 は、筋肉サンプル中の[14C]マンニトール放射能の量である。
    [14C]DPM培地は、培地 サンプル中の[14C]マンニトール放射能の量である。
    [3時間]DPM筋 は、筋肉サンプル中の[3H]2-デオキシ-D-グルコース放射能の量である。
    [3時間]DPM培地は、培地サンプル中の[3H]2-デオキシ-D-グルコース放射能の量である。
    [3時間]DPMECS は、筋肉細胞外空間における[3H]2-デオキシ-D-グルコース放射能の量である。
    [3時間]DPMICS は、筋肉細胞内空間における[3H]2-デオキシ-D-グルコース放射能の量である。
    μL-ECSは、μLにおける筋肉細胞外空間である。
    Mvolは、シンチレーション計数に使用されるインキュベーション培地の体積(μL)である(例えば、上述のように'25')。
    Th は、1時間あたりの取り込み速度を計算するために使用される時間係数です(すなわち、筋肉をグルコース取り込み培地で10分間インキュベートしたときの「1/6」)。
  7. この計算例を考慮してください。盲検対照試料(それぞれ17および6)の[3H]および[14C]DPMを、以下に述べるDPM値から差し引いた。
    [14C]DPMの筋肉: 343
    [14C]DPMメディア: 11846
    [3時間]DPMの筋肉: 4467
    [3時間]DPMメディア: 39814
    M巻:25
    mgタンパク質:0.396(150μL筋肉タンパク質溶解液中)
    [2-デオキシ-D-グルコース]:1(mM)
    T h: 1/6 (h)
    μL-ECS = 343 DPM / (11846 DPM / 25 μL) = 0.724 μL
    [3時間]DPMECS: 0.724 μL × (39814 DPM / 25 μL) = 1153 DPM
    [3時間]DPMICS: 4467 DPM - 1153 DPM = 3314 DPM
    グルコース取り込み:((3314 DPM/(39814 DPM/25 μL)/1 ミリモル/L)/0.396 mgタンパク質)/(1/6時間)=31.53 μmol/gタンパク質/時間

9. SDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析

  1. ヒラメおよびEDL筋溶解物をLaemmli緩衝液中で調製し、96°Cで5分間加熱する。
  2. セルフキャストゲル上のSDS-PAGEによって等量の筋肉タンパク質を分離し、セミドライブロッティングによってタンパク質をポリフッ化ビニリデン膜に転写する。
  3. 続いて、0.05%Tween 20および2%スキムミルクおよびプローブ膜を含むトリス緩衝生理食塩水中で膜を関連する一次抗体および二次抗体と共にインキュベートする。
  4. 化学発光でタンパク質を検出し、デジタルイメージングシステムで可視化します。

10.筋肉グリコーゲン、ヌクレオチド、乳酸塩、クレアチン、およびホスホクレアチン

  1. 過塩素酸を使用してEDLおよびヒラメ筋サンプルを抽出します。
  2. 続いて、サンプルを中和し、前述のように乳酸塩、クレアチン、およびホスホクレアチンについて分析する18。
  3. 過塩素酸での抽出後の逆相HPLCによりEDLおよびヒラメ筋中のヌクレオチド含有量を分析する。
  4. 18に記載した蛍光法によって酸加水分解後のグリコシル単位として全筋ホモジネート中の筋グリコーゲン含量を決定する。

11. 統計

  1. 統計分析ソフトウェアで統計分析を実行します。
  2. 二元配置分散分析(ANOVA)検定を使用して、 表1に示す値間の統計的差を評価します。
  3. 不対の学生 t検定 を使用して、 図2に示す各グループ内のEDLとヒラメの間のグルコース取り込みの統計的差を評価します。平均の標準誤差(SEM)±手段としてデータを提示する。P<0.05は統計的に有意であると考えられる。

結果

図2に示すように、基礎グルコース取り込み速度は、雌マウスから単離されたヒラメとEDL筋との間で類似していた。これはまた、12、13、19、20の前に数回報告されています。グルコース取り込みは、最大以下の有効インスリン濃度(100μU/mL)に応答して?...

ディスカッション

骨格筋におけるグルコース取り込みの無傷の調節は、全体的な健康を維持するために重要である1。したがって、筋肉のグルコース取り込みの調査は、様々な健康を変える介入を評価する際の主要な読み出しとしてしばしば役立つ。ここで我々は、インスリンおよび電気的に誘導された収縮に応答してマウスから単離およびインキュベートされたヒラメおよびEDL筋肉における...

開示事項

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謝辞

この研究は、デンマーク独立研究医学評議会(FSS8020-00288B)とノボノルディスク財団(NNF160C0023046)からの助成金によって支援されました。この研究は、ノボノルディスク財団の助成金番号NNF17SA0031406からデンマーク糖尿病アカデミーからラスムス・キョブステッドへの研究助成金によっても支援されました。著者らは、カリーナ・オルセン、ベティナ・ボルムグレン、アイリーン・ベック・ニールセン(コペンハーゲン大学理学部栄養・運動・スポーツ学科)の熟練した技術支援に感謝したい。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
[14C]D-mannitolAmerican Radiolabeled Chemicals, Inc.ARC 0127
[3H]2-deoxy-D-glucose American Radiolabeled Chemicals, Inc.ART 0103A
2-Deoxy-D-glucoseSigmaD8375
4-0 USP non-sterile surgical nylon sutureHarvard Apparatus51-7698
Streptavidin/HRP (Conjugate)DAKOP0397Used to detect ACC protein
Akt2 antibodyCell Signaling3063
AMPKα2 antibodySanta CruzSC-19131
aprotininSigmaA1153
benzamidineSigmaB6505
Bovine serum albumin (BSA)SigmaA7030
CaCl2Merck1020831000
Calibration kit (force)Danish Myo Technology A/S300041
ChemiluminescenceMilliporeWBLUF0500
D-GlucoseMerck1084180100
D-MannitolSigmaM4125
Data collection programNational InstrumentsLabVIEW software version 7.1
Dialysis tubingViskingDTV.12000.09 Size No.9
Digital imaging systemBioRadChemiDoc MP
EDTASigma EDSE9884
EGTASigmaE4378
Electrical Pulse StimulatorDigitimerD330 MultiStim System
GlycerolSigmaG7757
HEPESSigmaH7637
IGEPAL CA-630 SigmaI8896
InsulinNovo NordiskActrapid, 100 IE/mL
KClMerck1049361000
KH2PO4Merck104873025
leupeptinSigmaL2884
MgSO4Merck1058860500
Muscle Strip Myograph SystemDanish Myo Technology A/SModel 820MS
Na-OrthovanadateSigmaS6508
Na-PyrophosphateSigma221368
Na-PyruvateSigmaP2256
NaClMerck106041000
NaFSigmaS1504
NaHCO3VWR27778260
pACC Ser212 antibodyCell Signaling3661
pAkt Thr308 antibodyCell Signaling9275
pAMPK Thr172 antibodyCell Signaling2531
phenylmethylsulfonylfluorideSigmaP7626
Platinum electrodesDanish Myo Technology A/S300145
pTBC1D4 Ser588 antibodyCell Signaling8730
Scintillation counterPerkin ElmerTri-Carb-2910TR
Scintillation fluid Perkin Elmer6013329
Statistical analyses softwareSystatSigmaPlot version 14
TBC1D4 antibodyAbcamab189890
TissueLyser II Qiagen85300
Ultrapure waterMerckMilli-Q Reference A+ System
β-glycerophosphateSigmaG9422

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