测量小鼠分离和孵育成熟骨骼肌中胰岛素和收缩刺激的葡萄糖摄取

摘要

肌肉葡萄糖摄取的完全调节对于维持全身葡萄糖稳态非常重要。该方案在描述各种生理干预对全身葡萄糖代谢的影响时，评估孤立和孵育成熟骨骼肌中胰岛素和收缩刺激的葡萄糖摄取。

摘要

骨骼肌是一种胰岛素反应组织，通常占据饭后进入血液的大部分葡萄糖。此外，据报道，与静息条件相比，骨骼肌在运动期间可能使血液中葡萄糖的提取增加多达50倍。运动和胰岛素刺激期间肌肉葡萄糖摄取的增加取决于葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）从细胞内隔室到肌肉细胞表面膜的易位，以及葡萄糖通过己糖激酶II磷酸化为葡萄糖-6-磷酸。小鼠肌肉（如 米氏 支原肌和 长指伸 肌（EDL））的分离和孵育是研究胰岛素和电诱导收缩（运动模型）对成熟骨骼肌葡萄糖摄取的影响的适当离体模型。因此，离体模型允许评估肌肉胰岛素敏感性，并使得在收缩期间匹配肌肉力量的产生成为可能，从而确保在测量肌肉葡萄糖摄取期间肌肉纤维的均匀募集。此外，所描述的模型适用于可能对肌肉胰岛素敏感性产生影响的药理学化合物测试，或者在试图描绘骨骼肌葡萄糖摄取的调节复杂性时可能有所帮助。

在这里，我们描述并提供有关如何使用放射性标记的[³H]2-脱氧-D-葡萄糖和[¹⁴C]甘露醇作为细胞外标志物来测量小鼠的分离和孵育的比目鱼和EDL肌肉制剂中胰岛素和收缩刺激葡萄糖摄取的详细方案。这可以准确评估成熟骨骼肌中的葡萄糖摄取，而没有可能干扰完整动物模型的混杂因素。此外，我们提供有关孵化小鼠骨骼肌代谢活力的信息，表明在研究肌肉能量代谢时，所应用的方法在某些条件下具有一些警告。

引言

骨骼肌具有从细胞外空间提取大量葡萄糖的能力，以响应胰岛素和运动。这有助于维持全身葡萄糖稳态，并在高能量需求期间确保葡萄糖供应。由于骨骼肌葡萄糖摄取的完整调节已被证明对整体健康和身体表现很重要^1，2，因此在各种条件下测量肌肉葡萄糖摄取受到了很多关注。在人类和动物中，高胰岛素 -正血糖钳夹已被用作评估体内胰岛素敏感性的金标准技术^3，4.与口服葡萄糖耐量试验的结果相反，高胰岛素-正血糖钳夹技术不需要完整的胃肠功能或胰腺分泌胰岛素，因此可以在胃肠和/或胰腺功能变化的受试者之间比较胰岛素反应。自20世纪60年代以来，人类运动期间体内肌肉葡萄糖摄取的测量一直很频繁⁵。首先通过使用动静脉平衡技术⁶ ，后来通过使用正电子发射断层扫描（PET）成像结合发射葡萄糖类似物，例如¹⁸F-氟脱氧葡萄糖⁷。在啮齿动物中，运动刺激的肌肉在体内葡萄糖摄取通常通过使用放射性或稳定同位素标记的葡萄糖类似物^8，9，10进行。

测量体内肌肉葡萄糖摄取的补充方法是从啮齿动物中分离和孵育小肌肉，然后使用放射性或稳定同位素标记的葡萄糖类似物^11，12，13测量葡萄糖摄取。该方法可以准确可靠地量化成熟骨骼肌中的葡萄糖摄取率，并且可以在存在各种胰岛素浓度和通过电刺激引起的收缩期间进行。更重要的是，在研究经过各种干预（例如营养，身体活动，感染，治疗）的小鼠的肌肉代谢表型时，分离和孵育骨骼肌中葡萄糖摄取的测量具有相关性。分离的骨骼肌模型也是可能影响葡萄糖摄取本身和/或改变胰岛素敏感性的药理学化合物测试 的 合适工具^12，14。通过这种方式，设计用于调节肌肉葡萄糖代谢的化合物的功效可以在高度受控的环境中进行测试和评估，然后再在临床前动物模型中进行后续的体内测试。

在某些条件下，代谢活力可能对孤立和孵育的骨骼肌模型系统构成挑战。事实上，在孵化的肌肉中缺乏循环系统意味着基质（例如氧气和营养物质）的输送完全取决于肌肉纤维与周围环境之间的简单扩散。关于这一点，重要的是，孵化的肌肉小而薄，因此，在孵育过程中代表较少的氧扩散屏障¹⁵。特别是在长时间孵育数小时期间，缺氧状态可能由于氧气供应不足导致肌肉能量消耗^而发展15。尽管先前已经报道了孵化大鼠肌肉中代谢活力的各种标志物以及有助于维持大鼠肌肉活力的重要变量^的鉴定15，但仍然需要对小孵化小鼠肌肉中的代谢活力进行全面评估。因此，目前，糖原含量已主要被用作培养小鼠骨骼肌^16，17中代谢活力的标志物。

在这里，我们描述了一个详细的方案，以测量使用放射性标记的[³H]2-脱氧-D-葡萄糖和[¹⁴C]甘露醇作为细胞外标志物的小鼠分离和孵育的比目鱼和EDL肌肉中的基础，胰岛素和收缩刺激的葡萄糖摄取。在本研究中，在10分钟内测量葡萄糖摄取，并且该方法使用亚最大和最大有效胰岛素浓度以及单一收缩方案。然而，本文中描述的方案可以很容易地在孵育时间、胰岛素剂量和电刺激方案方面进行修改。此外，我们还对孵育的比目鱼和EDL小鼠肌肉中的代谢活力的各种标志物进行了彻底的表征。结果表明，向孵育缓冲液补充葡萄糖对于保持孵育肌肉1小时的代谢活力至关重要。

研究方案

涉及研究动物的程序应根据相关准则和当地立法进行。用于本研究的所有动物实验均符合《欧洲保护脊椎动物公约》，用于实验和其他科学目的，并得到丹麦动物实验监察局的批准。

1.实验装置和缝合环的制备

注意:对于本研究，使用带有定制孵育钩的集成肌肉条肌图系统来孵育孤立的小鼠骨骼肌（图1）。该系统允许肌肉在具有连续氧合（95%O₂ 和5%CO₂）和恒定温度下的生理溶液中沐浴。肌肉组织浴与力传感器耦合，用于测量收缩过程中的肌肉力产生。为了在收缩期间引发和记录肌力学反应，请分别使用电脉冲刺激器和数据收集程序。刺激孵化的肌肉通过位于肌肉中央和两侧的铂电极收缩。

1. 打开肌电图系统和加热室至30°C。 与肌电图系统兼容的开放式数据收集软件，并校准力传感器，以确保数据集之间的可比性。
2. 首先切割约16厘米的不可吸收的手术尼龙缝合线。使用镊子从单股线形成直径约0.4厘米的环。重复此操作，直到生成足够的循环。每块肌肉需要两个环 - 一个用于近端，一个用于远端肌腱。

2. 溶液和培养基的制备

1. 基础孵育培养基的制备
   1. 准备以下储备溶液:2.5 M 氯化钠（NaCl，250 mL），0.5 M 碳酸氢钠（NaHCO₃，250 mL），0.5 M 氯化钾（KCl，50 mL），0.25 M 氯化钙（CaCl₂，50 mL），0.25 M 磷酸二氢钾（KH₂PO₄，50 mL），0.25 M 硫酸镁（MgSO₄，50 mL），110 mM 丙酮酸钠（Na-丙酮酸钠， 100 mL），500 mM D-甘露醇（100 mL），1 M 2-脱氧-D-葡萄糖（4 mL），15%的牛血清白蛋白（BSA）溶液透析克雷布斯 - 林格 - 亨赛利特（KRH）缓冲液（在下面的步骤4中描述）（100 mL）。
      注意:需要两种解决方案来测量静息和收缩刺激的葡萄糖摄取。此外，用于评估胰岛素刺激的葡萄糖摄取的每种胰岛素浓度都需要两种溶液。因此，总共需要六种不同的解决方案来测量孤立的小鼠骨骼肌中的基础，次最大胰岛素，最大胰岛素和收缩刺激的葡萄糖摄取。在下文中，"基础孵育培养基"是指不含胰岛素或放射性示踪剂的培养基。"培养基"是指含有胰岛素的培养基。"葡萄糖摄取孵育培养基"是指除胰岛素外还含有2-脱氧-D-葡萄糖和放射性示踪剂的培养基，其浓度与"培养基"中使用的浓度相同。
   2. 通过添加超纯水（ddH₂O）与NaCl（117 mM），NaHCO₃（24.6 mM），KCl（4.7 mM），CaCl_2（2.5 mM），KH₂PO₄（1.2 mM）和MgSO₄（1.2 mM）来制备KRH缓冲液。随后，用95%O 2和5_{%CO 2}向KRH缓冲液加气至少10分钟。在30°C时，KRH缓冲液的所需pH值应在7.35-7.45之间。 如果在室温下进行pH调节，KRH缓冲液的pH值应在7.25-7.35之间。
   3. 将BSA（0.1%），丙酮酸钠（2mM）和D-甘露醇（8mM）添加到气体和pH调节的KRH缓冲液中，以完成基础孵育培养基。将基础孵育培养基储存在密封容器中，以尽量减少O₂ 和CO₂ 的脱气，并将培养基置于30°C。
      注意:通常，KRH补充剂（即丙酮酸钠，D-甘露醇和D-葡萄糖）的渗透压在整个实验中保持恒定，以避免肌肉细胞的收缩或扩张。这里描述的方案使用10mM的渗透压作为KRH补充剂。如果需要含葡萄糖的缓冲液，请更换KRH补充剂以满足需求，例如5 mM D-葡萄糖和5 mM D-甘露醇。
   4. 为避免孵育缓冲液中可能存在的BSA相关污染物，请针对KRH透析BSA。
      1. 要使15%的BSA储备溶液透析到KRH缓冲液中，首先将300g分析级无脂BSA溶解在900mL KRH缓冲液中。接下来，将透析管在重新蒸馏的水中煮沸，直到管子变软。
      2. 用BSA-KRH溶液填充管道并固定管道末端。将带有BSA-KRH的管子置于5L KRH缓冲液中，并在4°C下过夜。 第二天更换KRH缓冲液，并将管道与BSA-KRH在KRH缓冲液中以4°C过夜。
      3. 最后，从管道中收集BSA-KRH溶液，并将KRH缓冲液加入最终体积为2 L（即15%BSA-KRH储备溶液）。将15%BSA-KRH储备溶液分成等分试样，并储存在〜-20°C的冰箱中。
2. 含胰岛素的培养基的制备
   1. 对于含有亚最大有效胰岛素浓度的培养基，每mL基础培养基（100μU / mL胰岛素）加入1μL1μL胰岛素储备溶液。
   2. 对于含有最大有效胰岛素浓度的孵育培养基，每mL基础培养基（10 mU / mL胰岛素）加入1μL 10 U / mL胰岛素储备溶液。
3. 葡萄糖摄取孵育培养基的制备
   注意:只有授权人员才能在限制和控制区域内处理放射性物质，一些大学、研究机构和公司可能需要获得"放射性使用许可证"。材料和废物必须按照适当的当地程序，准则和法规进行处理。
   1. 按照第 2.1.2 节中所述的相同过程操作。
   2. 将BSA（0.1%），丙酮酸钠（2mM），D-甘露醇（7mM）和2-脱氧-D-葡萄糖（1mM）添加到气体和pH调节的KRH缓冲液中。
   3. 将[³H]2-脱氧-D-葡萄糖（0.028 MBq / mL）和[¹⁴C]甘露醇（0.0083 MBq / mL）加入补充的KRH缓冲液中，以完成葡萄糖摄取孵育培养基。储存在30°C。 如果将[³H]2-脱氧-D-葡萄糖和[¹⁴C]甘露醇溶解在乙醇中，则在使用前通过N₂ 介导的蒸发除去乙醇。
   4. 对于含有低于最大有效胰岛素浓度的葡萄糖摄取孵育培养基，每mL葡萄糖摄取孵育培养基（100μU / mL胰岛素）加入1μL1μL胰岛素储备溶液。
   5. 对于含有最大有效胰岛素浓度的葡萄糖摄取孵育培养基，每mL葡萄糖摄取孵育培养基（10 mU / mL胰岛素）加入1μL 10 U / mL胰岛素储备溶液。

3.动物和小鼠比目鱼和EDL肌肉的解剖进行孵育

注意:涉及研究动物的程序应根据相关指南和当地立法进行。所描述的程序可用于各种菌株和遗传背景的内部繁殖或市售的雄性和雌性小鼠。为喂养的雌性C57Bl / 6J小鼠提供以下程序。平均而言，小鼠年龄为19周，体重为25克。将小鼠维持在12:12小时的明暗循环中，自由获得标准的啮齿动物食物和水。动物实验于当地时间约9:00开始，所有动物在2小时内处死。

1. 向每个孵育室中加入4 mL预热（30°C）基础孵育培养基，并确保基础培养基用95%O₂ 和5%CO₂连续氧化。
2. 腹腔注射戊巴比妥（10mg / 100g体重）或其他可用的麻醉剂（例如三溴乙醇）麻醉小鼠。
   注意:请注意，在某些国家/地区，可能需要获得处理戊巴比妥和其他麻醉药物的许可证。在开始肌肉解剖之前，必须正确诱导每只动物的麻醉。为了确保这一点，对尾巴和腿部反射进行了测试。为了获得最佳效果，应进行良好的解剖练习，以避免在切除过程中损伤肌肉。
3. 将麻醉的小鼠俯卧在解剖托盘（例如聚苯乙烯泡沫塑料盖）上，并根据需要使用针头固定前爪和后爪。
4. 从小腿上取下皮肤，并确保跟腱和膝关节都可见。
   1. 对于比目鱼肌的解剖，首先将单个缝合环连接到跟腱上。将镊子固定在缝合环远端的跟腱上，并进行切割以从爪子中释放比目鱼和腓肠肌。小心地将豌豆镊子滑过小鼠，从而暴露出比目鱼肌。
   2. 固定下豌豆镊子，并在比目鱼肌的近端肌腱周围放置第二个缝合环。接下来，切除近端肌腱并解剖没有腓肠肌的比目鱼（包括两个连接的缝合环）。通过将每个缝合环连接到各自的钩子上，将比目鱼肌快速放置在孵育室中。
5. 使用镊子移除覆盖 胫骨分枝前 （TA）的筋膜。如果操作正确，TA和EDL肌肉的远端肌腱应清晰可见白色;并彼此分离。
6. 切除TA肌的远端肌腱并解剖肌肉以进行后续分析（例如基因分型）。使用镊子，轻轻地将EDL肌肉从周围组织中解放出来，但保持肌肉完整，不要切断肌腱。在EDL的远端肌腱周围放置一个缝合环，在EDL的近端肌腱周围放置第二个缝合环。
7. 接下来，用两个连接的缝合环切割释放EDL肌肉的肌腱，并通过将每个缝合环连接到各自的钩子来快速将肌肉置于孵育室中。为了在孵育期间，特别是在电诱导的比目鱼和EDL肌肉收缩期间失去张力，用紧密的结固定肌腱周围的缝合环非常重要。
8. 最后，通过例如宫颈脱位对动物实施安乐死。
9. 当肌肉被解剖并放置在孵育室中时，将每块肌肉的静息张力调整至〜5mN，并在启动实验方案之前将肌肉预孵育至少10分钟。

4. 胰岛素刺激的葡萄糖摄取在分离的小鼠骨骼肌中

1. 在步骤3.9之后，将基础孵育培养基替换为不含胰岛素的孵育培养基（基础孵育培养基），次最大有效胰岛素浓度或最大有效胰岛素浓度并在孵育室中放置20分钟。将每个孵育室间隔1分钟，从而为随后收获肌肉腾出时间。
2. 在20分钟刺激期结束时，用含有相同浓度胰岛素的葡萄糖摄取培养基替换孵育培养基，并在孵育室中放置10分钟，每个孵育室之间再次间隔1分钟。
3. 在葡萄糖摄取培养基中孵育10分钟后，轻轻地从孵育室中除去肌肉，并在冰冷的基础孵育培养基中洗涤它们。随后，在去除缝合环并将肌肉冻结在液氮中之前，在滤纸上快速干燥肌肉。如果人们还希望研究除葡萄糖摄取之外的各种细胞内代谢物和蛋白质信号传导，则必须快速收获孵化的肌肉。
4. 从每个孵育室收集100μL葡萄糖摄取孵育培养基并将其储存在-20°C。 这些样品中的放射性量将包括在肌肉葡萄糖摄取的计算中。

5. 孤立小鼠骨骼肌收缩刺激葡萄糖摄取

注意:为了诱导孤立的小鼠骨骼肌收缩，请使用以下方案:1个训练/ 15秒，每个训练1秒长，由以100 Hz传递的0.2 ms脉冲组成。然而，其他类似的方案引发孤立的小鼠骨骼肌的收缩也可能起作用。重要的是，应调整电压以产生孵化肌肉的最大力发展，这取决于实验设置。如果不能确保这一点，您可能会面临并非所有肌肉纤维都在收缩的风险。反过来，这可能会在数据集中引起偏差。

1. 在步骤3.9之后，将铂电极放在肌肉的中心和两侧。用葡萄糖摄取孵育培养基替换基础孵育培养基后立即开始肌肉收缩。如果可能，将每个孵育室间隔1分钟，从而为随后收获肌肉腾出时间。请记住记录每个孵化肌肉的力产生。
2. 在葡萄糖摄取孵育培养基中收缩10分钟后，除去铂电极，轻轻地从孵育室收集肌肉，并在冰冷的基础孵育培养基中洗涤它们。随后，在去除缝合环并将肌肉冻结在液氮中之前，在滤纸上快速干燥肌肉。整个肌肉采集过程应尽可能快地进行。
3. 从每个孵育室收集100μL葡萄糖摄取孵育培养基并将其储存在-20°C。 这些样品中的放射性量将包括在肌肉葡萄糖摄取的计算中。

6. 骨骼肌均质化与加工

注意:下面给出的肌肉均质化程序可以通过同一组肌肉样品中的蛋白质印迹来确定葡萄糖摄取和肌细胞信号传导。

1. 在400μL冰冷缓冲液中匀浆每个肌肉，其中pH 7.5含有10%甘油，20mM焦磷酸钠，1%IGEPAL CA-630（NP-40），2mM苯基甲基磺酰氟（溶解在异丙醇中），150mM NaCl，50mM HEPES，20mM β甘油磷酸盐，10mM氟化钠（NaF），1mM乙二胺四乙酸（EDTA），1mM乙二胺四乙酸（EGTA），10μg/ ml抑肽酶， 10 μg/mL leupeptin、3 mM 苯甲脒和 2mM 正钒酸钠，使用钢珠和组织分析器（30 Hz 下 2 x 45 s）。在4°C下端对端旋转所有匀浆1小时，之后在4°C下以16，000× g 离心20分钟。 收集裂解物（上清液），用于确定肌肉葡萄糖摄取。

7. 放射性标记的2-脱氧葡萄糖和甘露醇的测定

1. 从每个孵育室中加入150μL每个肌肉裂解物和25μL葡萄糖摄取孵育培养基，以分离含有2mL液体闪烁液的液体闪烁计数小瓶。此外，制备两个仅含有3 mL液体闪烁液的盲控瓶。关闭所有小瓶，并通过涡旋每个小瓶约5秒彻底混合。
2. 将小瓶置于液体闪烁计数器中，并根据制造商的指南测量[³H]2-脱氧-D-葡萄糖和[¹⁴C]甘露醇的放射性。记录每个液体闪烁小瓶的DPM（每分钟崩解次数）。

8. 肌肉葡萄糖摄取率的计算

1. 使用步骤6.1中的裂解物，使用标准蛋白质定量方法（例如，比辛可宁酸或布拉德福德测定）测量每个肌肉样品中的总蛋白质浓度。计算添加到每个闪烁小瓶中的蛋白质（mg）的量。
   注意:每个肌肉样本的葡萄糖摄取速率是通过从肌肉样品中[³H]2-脱氧-D-葡萄糖的总量中减去位于细胞外空间的[³H]2-脱氧-D-葡萄糖的量来计算的，使用[¹⁴C]甘露醇作为细胞外标志物。假设[³H]2-脱氧-D-葡萄糖和[¹⁴C]甘露醇在孵育期间在肌肉组织内表现出相似的扩散特性。执行以下计算:
2. 首先从所有肌肉和培养基样本中减去盲对照样本的 [³H] 和 [¹⁴C] DPM。
3. 确定以μL（μL-ECS）为单位的肌肉细胞外空间:
   [¹⁴摄氏度]DPM_肌肉 / （[¹⁴C]DPM_媒体 / M_卷）
4. 计算肌肉细胞外空间（[³H]DPM_ECS）中[³H]DPM的量:
   μL-ECS × （[³H]DPM_介质 / M_体积）
5. 计算肌肉细胞内空间（[³H]DPM_ICS）中[³H]DPM的量:
   [³小时]DPM_肌肉− [³H]DPM_弹性体
6. 计算肌肉葡萄糖摄取率（μmol/g蛋白质/小时）:
   [³小时]DPM_ICS / （[³H]DPM_培养基 / M_vol） / [2-脱氧-D-葡萄糖]）） / mg 蛋白） / T_h
   注:对于上述所有方程，
   [¹⁴摄氏度]DPM_{肌肉是肌肉} 样品中[¹⁴C]甘露醇放射性的量;
   [¹⁴摄氏度]DPM_{培养基是培养} 基样品中[¹⁴C]甘露醇放射性的量;
   [³小时]DPM_{肌肉是肌肉} 样品中[³H]2-脱氧-D-葡萄糖放射性的量;
   [³小时]DPM_{培养基是培养基}样品中[³H]2-脱氧-D-葡萄糖放射性的量;
   [³小时]DPM_ECS 是肌肉细胞外空间中[³H]2-脱氧-D-葡萄糖放射性的量;
   [³小时]DPM_ICS 是肌肉细胞内空间中[³H]2-脱氧-D-葡萄糖放射性的量;
   μL-ECS是μL中的肌肉细胞外空间;
   M_vol 是用于闪烁计数的孵育培养基的体积（μL）（例如，如上所述的'25'）;
   T_h 是用于计算每小时摄取率的时间因子（即，当用葡萄糖摄取培养基孵育肌肉 10 分钟时，"1/6"）
7. 请考虑此示例计算。盲对照样品（分别为17和6）的[³H]和[¹⁴C]DPM已从下面提到的DPM值中减去。
   [¹⁴摄氏度]DPM_肌肉: 343
   [¹⁴摄氏度]DPM_媒体: 11846
   [³小时]DPM_肌肉: 4467
   [³小时]媒体_:39814
   M_卷: 25
   mg蛋白质:0.396（在150μL肌肉蛋白质裂解物中）
   [2-脱氧-D-葡萄糖]: 1 （mM）
   T_h: 1/6 （h）
   μL-ECS = 343 DPM / （11846 DPM / 25 μL） = 0.724 μL
   [³小时]DPM_ECS: 0.724 μL × （39814 DPM / 25 μL） = 1153 DPM
   [³小时]DPM_ICS: 4467 DPM - 1153 DPM = 3314 DPM
   葡萄糖摄取: （（3314 DPM / （39814 DPM / 25 μL） / 1 mmol/L） / 0.396 mg 蛋白质） / （1/6 小时） = 31.53 μmol / g 蛋白质 / 小时

9. SDS-PAGE和蛋白质印迹分析

1. 在Laemmli缓冲液中制备比目鱼和EDL肌肉裂解物，并在96°C下加热5分钟。
2. 在自铸凝胶上通过SDS-PAGE分离等量的肌肉蛋白，并通过半干转将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上。
3. 随后，在含有0.05%吐温20和2%脱脂牛奶和探针膜的Tris缓冲盐水中孵育膜，并与相关的一抗和二抗一抗和探针膜。
4. 通过化学发光检测蛋白质，并通过数字成像系统对其进行可视化。

10.肌肉糖原、核苷酸、乳酸、肌酸和磷酸肌酸

1. 使用高氯酸提取EDL和比目鱼肌肉样品。
2. 随后，中和样品并分析它们的乳酸，肌酸和磷酸肌酸，如前所述¹⁸。
3. 在高氯酸中提取后，通过反相HPLC分析EDL和比目鱼肌中的核苷酸含量。
4. 通过如前所述¹⁸的荧光法测定酸水解后整个肌肉中糖原匀浆的肌肉糖原含量。

11. 统计

1. 使用统计分析软件执行统计分析。
2. 使用双向方差分析 （ANOVA） 检验来评估 表 1 中所示值之间的统计差异。
3. 使用未成对的学生 t 检验来评估 图2中每组中EDL和比目鱼之间葡萄糖摄取的统计差异。将数据显示为均值±均值标准误差 （SEM）。P < 0.05 被认为具有统计学意义。

结果

如图2所示，从雌性小鼠分离出的比目鱼和EDL肌之间的基础葡萄糖摄取率相似。在12^，13，^19，20之前也曾多次报告。在比目鱼和EDL肌肉中，葡萄糖摄取增加约0.8和〜0.6倍，分别达到12和9μmol / g蛋白质/ h，以响应低于最大有效胰岛素浓度（100μU / mL）。当肌?...

讨论

骨骼肌葡萄糖摄取的完全调节对于保持整体健康很重要¹.因此，在评估各种改变健康的干预措施时，对肌肉葡萄糖摄取的研究通常作为主要读数。在这里，我们描述了一种离体方法，用于测量小鼠分离和孵育的比目鱼和EDL肌肉中葡萄糖摄取，以响应胰岛素和电诱导的收缩。该方法快速可靠，可以精确控制孵化肌肉的周围环境，从而可以准确研究从血液中可以找到的激素和底物的?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
[14C]D-mannitol	American Radiolabeled Chemicals, Inc.	ARC 0127
[3H]2-deoxy-D-glucose	American Radiolabeled Chemicals, Inc.	ART 0103A
2-Deoxy-D-glucose	Sigma	D8375
4-0 USP non-sterile surgical nylon suture	Harvard Apparatus	51-7698
Streptavidin/HRP (Conjugate)	DAKO	P0397	Used to detect ACC protein
Akt2 antibody	Cell Signaling	3063
AMPKα2 antibody	Santa Cruz	SC-19131
aprotinin	Sigma	A1153
benzamidine	Sigma	B6505
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A7030
CaCl2	Merck	1020831000
Calibration kit (force)	Danish Myo Technology A/S	300041
Chemiluminescence	Millipore	WBLUF0500
D-Glucose	Merck	1084180100
D-Mannitol	Sigma	M4125
Data collection program	National Instruments	LabVIEW software version 7.1
Dialysis tubing	Visking	DTV.12000.09 Size No.9
Digital imaging system	BioRad	ChemiDoc MP
EDTA	Sigma EDS	E9884
EGTA	Sigma	E4378
Electrical Pulse Stimulator	Digitimer	D330 MultiStim System
Glycerol	Sigma	G7757
HEPES	Sigma	H7637
IGEPAL CA-630	Sigma	I8896
Insulin	Novo Nordisk	Actrapid, 100 IE/mL
KCl	Merck	1049361000
KH2PO4	Merck	104873025
leupeptin	Sigma	L2884
MgSO4	Merck	1058860500
Muscle Strip Myograph System	Danish Myo Technology A/S	Model 820MS
Na-Orthovanadate	Sigma	S6508
Na-Pyrophosphate	Sigma	221368
Na-Pyruvate	Sigma	P2256
NaCl	Merck	106041000
NaF	Sigma	S1504
NaHCO3	VWR	27778260
pACC Ser212 antibody	Cell Signaling	3661
pAkt Thr308 antibody	Cell Signaling	9275
pAMPK Thr172 antibody	Cell Signaling	2531
phenylmethylsulfonylfluoride	Sigma	P7626
Platinum electrodes	Danish Myo Technology A/S	300145
pTBC1D4 Ser588 antibody	Cell Signaling	8730
Scintillation counter	Perkin Elmer	Tri-Carb-2910TR
Scintillation fluid	Perkin Elmer	6013329
Statistical analyses software	Systat	SigmaPlot version 14
TBC1D4 antibody	Abcam	ab189890
TissueLyser II	Qiagen	85300
Ultrapure water	Merck	Milli-Q Reference A+ System
β-glycerophosphate	Sigma	G9422