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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
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  • Einleitung
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  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Eine intakte Regulierung der Muskelglukoseaufnahme ist wichtig für die Aufrechterhaltung der Ganzkörperglukose-Homöostase. Dieses Protokoll stellt die Bewertung der insulin- und kontraktionsstimulierten Glukoseaufnahme in isolierten und inkubierten reifen Skelettmuskeln dar, wenn die Auswirkungen verschiedener physiologischer Interventionen auf den Glukosestoffwechsel des ganzen Körpers beschrieben werden.

Zusammenfassung

Die Skelettmuskulatur ist ein insulinansprechendes Gewebe und nimmt typischerweise den größten Teil der Glukose auf, die nach einer Mahlzeit in das Blut gelangt. Darüber hinaus wurde berichtet, dass die Skelettmuskulatur die Extraktion von Glukose aus dem Blut während des Trainings im Vergleich zu Ruhebedingungen um das bis zu 50-fache erhöhen kann. Die Erhöhung der Muskelglukoseaufnahme während des Trainings und der Insulinstimulation hängt von der Translokation des Glukosetransporters 4 (GLUT4) von intrazellulären Kompartimenten zur Muskelzelloberflächenmembran sowie der Phosphorylierung von Glukose zu Glucose-6-phosphat durch Hexokinase II ab. Die Isolierung und Inkubation von Mausmuskeln wie M. soleus und M . extensor digitorum longus (EDL) ist ein geeignetes Ex-vivo-Modell, um die Auswirkungen von Insulin und elektrisch induzierter Kontraktion (ein Modell für Bewegung) auf die Glukoseaufnahme in reifen Skelettmuskeln zu untersuchen. So ermöglicht das Ex-vivo-Modell die Bewertung der Muskelinsulinsensitivität und ermöglicht es, die Muskelkraftproduktion während der Kontraktion anzupassen, um eine gleichmäßige Rekrutierung von Muskelfasern während der Messung der Muskelglukoseaufnahme zu gewährleisten. Darüber hinaus eignet sich das beschriebene Modell für pharmakologische Wirkstofftests, die sich auf die Insulinsensitivität der Muskeln auswirken oder hilfreich sein können, wenn es darum geht, die regulatorische Komplexität der Glukoseaufnahme der Skelettmuskulatur abzugrenzen.

Hier beschreiben und liefern wir ein detailliertes Protokoll zur Messung der insulin- und kontraktionsstimulierten Glukoseaufnahme in isolierten und inkubierten Soleus- und EDL-Muskelpräparaten von Mäusen unter Verwendung von radioaktiv markierter [3H]2-Desoxy-D-Glucose und [14C]Mannitol als extrazellulärem Marker. Dies ermöglicht eine genaue Beurteilung der Glukoseaufnahme in reifer Skelettmuskulatur in Abwesenheit von Störfaktoren, die das intakte Tiermodell stören können. Darüber hinaus liefern wir Informationen über die metabolische Lebensfähigkeit der inkubierten Mausskelettmuskulatur, was darauf hindeutet, dass die angewandte Methode unter bestimmten Bedingungen bei der Untersuchung des Muskelenergiestoffwechsels einige Vorbehalte aufweist.

Einleitung

Die Skelettmuskulatur besitzt die Fähigkeit, große Mengen Glukose aus dem extrazellulären Raum als Reaktion auf Insulin und Bewegung zu extrahieren. Dies trägt zur Aufrechterhaltung der Ganzkörper-Glukosehomöostase bei und sichert die Glukoseversorgung in Zeiten hohen Energiebedarfs. Da sich eine intakte Regulation der Glukoseaufnahme der Skelettmuskulatur als wichtig für die allgemeine Gesundheit und körperliche Leistungsfähigkeiterwiesen hat 1,2, haben Messungen der Muskelglukoseaufnahme unter verschiedenen Bedingungen viel Aufmerksamkeit erhalten. Bei Menschen und Tieren wurde die hyperinsulinämisch-euglykämische Klemme als Goldstandardtechnik zur Beurteilung der Insulinsensitivität in vivo 3,4 verwendet. Im Gegensatz zu den Erkenntnissen aus einem oralen Glukosetoleranztest erfordert die hyperinsulinämisch-euglykämische Klemmtechnik keine intakte gastrointestinale Funktion oder Insulinsekretion aus der Bauchspeicheldrüse und ermöglicht somit den Vergleich der Insulinreaktionen zwischen Probanden, die Variationen in der Magen-Darm- und/oder Pankreasfunktion aufweisen. Messungen der Muskelglukoseaufnahme in vivo während des Trainings beim Menschen werden seit den 1960er Jahren häufig durchgeführt5. Zunächst durch den Einsatz von arteriovenösen Gleichgewichtstechniken6 und später durch den Einsatz der Positronen-Emissions-Tomographie (PET)-Bildgebung in Kombination mit einem positronenemittierenden Glukoseanalogon, z.B. 18F-Fluor-Desoxy-Glucose7. Bei Nagetieren wird die trainingsstimulierte Muskelglukoseaufnahme in vivo typischerweise durch die Verwendung von radioaktiven oder stabilen isotopenmarkierten Glukoseanaloga 8,9,10 durchgeführt.

Eine ergänzende Methode zur Messung der Muskelglukoseaufnahme in vivo besteht darin, kleine Muskeln von Nagetieren zu isolieren und zu inkubieren und anschließend die Glukoseaufnahme mit radioaktiven oder stabilen isotopenmarkierten Glukoseanaloga11,12,13 zu messen. Diese Methode ermöglicht eine genaue und zuverlässige Quantifizierung der Glukoseaufnahmeraten in reifen Skelettmuskeln und kann in Gegenwart verschiedener Insulinkonzentrationen und während der durch elektrische Stimulation ausgelösten Kontraktion durchgeführt werden. Noch wichtiger ist, dass Messungen der Glukoseaufnahme in isolierten und inkubierten Skelettmuskeln von Bedeutung sind, wenn der metabolische Phänotyp der Muskeln untersucht wird, die verschiedenen Interventionen unterzogen wurden (z. B. Ernährung, körperliche Aktivität, Infektion, Therapeutika). Das isolierte Skelettmuskelmodell ist auch ein geeignetes Werkzeug für pharmakologische Verbindungstests, die die Glukoseaufnahme per se beeinflussen und/oder die Insulinsensitivität modifizieren können12,14. Auf diese Weise kann die Wirksamkeit von Verbindungen zur Regulierung des Muskelglukosestoffwechsels in einem hochkontrollierten Milieu getestet und bewertet werden, bevor anschließend in vivo in präklinischen Tiermodellen getestet wird.

Unter bestimmten Bedingungen kann die metabolische Lebensfähigkeit eine Herausforderung im isolierten und inkubierten Skelettmuskelmodellsystem darstellen. In der Tat bedeutet das Fehlen eines Kreislaufsystems in den inkubierten Muskeln, dass die Zufuhr von Substraten (z. B. Sauerstoff und Nährstoffen) vollständig von einer einfachen Diffusion zwischen den Muskelfasern und der Umgebung abhängt. In diesem Zusammenhang ist es von Bedeutung, dass die inkubierten Muskeln klein und dünn sind und daher weniger eine Barriere für die Sauerstoffdiffusion während der Inkubationdarstellen 15. Insbesondere bei längerer Inkubation über mehrere Stunden können sich aufgrund unzureichender Sauerstoffversorgung hypoxische Zustände entwickeln, die zu einem Erschöpfung der Muskelenergie führen15. Obwohl verschiedene Marker der metabolischen Lebensfähigkeit in inkubierten Rattenmuskeln bereits berichtet wurden, zusammen mit der Identifizierung wichtiger Variablen, die zur Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der Rattenmuskeln beitragen15, ist eine umfassende Bewertung der metabolischen Lebensfähigkeit in kleinen inkubierten Mausmuskeln immer noch gerechtfertigt. Daher wird der Glykogengehalt derzeit hauptsächlich als Marker für die metabolische Lebensfähigkeit in inkubierten Mausskelettmuskelnverwendet 16,17.

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Messung der basalen, insulin- und kontraktionsstimulierten Glukoseaufnahme in isolierten und inkubierten Soleus- und EDL-Muskeln von Mäusen unter Verwendung von radioaktiv markierter [3H]2-Desoxy-D-Glucose und [14C]Mannitol als extrazellulärem Marker. In der vorliegenden Studie wurde die Glukoseaufnahme während eines Zeitraums von 10 Minuten gemessen und die Methode wird unter Verwendung submaximaler und maximal wirksamer Insulinkonzentrationen sowie eines einzigen Kontraktionsprotokolls vorgestellt. Die hierin beschriebenen Protokolle können jedoch leicht in Bezug auf Inkubationszeit, Insulindosierung und elektrisches Stimulationsprotokoll modifiziert werden. Darüber hinaus bieten wir eine gründliche Charakterisierung verschiedener Marker der metabolischen Lebensfähigkeit in inkubiertem Soleus- und EDL-Mausmuskel. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine Glukoseergänzung zum Inkubationspuffer unerlässlich ist, um die metabolische Lebensfähigkeit des für 1 Stunde inkubierten Muskels zu erhalten.

Protokoll

Verfahren mit Versuchstieren sollten in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und den lokalen Rechtsvorschriften durchgeführt werden. Alle für diese Studie verwendeten Tierversuche entsprachen der Europäischen Konvention zum Schutz von Wirbeltieren, die für experimentelle und andere wissenschaftliche Zwecke verwendet werden, und wurden von der dänischen Tierversuchsinspektion genehmigt.

1. Vorbereitung der Versuchsapparatur und der Nahtschlaufen

HINWEIS: Verwenden Sie für diese Studie ein integriertes Muskelstreifen-Myographiesystem mit maßgeschneiderten Inkubationshaken, um isolierte Mausskelettmuskeln zu inkubieren (Abbildung 1). Dieses System ermöglicht es dem Muskel, in einer physiologischen Lösung mit kontinuierlicher Sauerstoffversorgung (95%O2 und 5% CO2) und bei konstanter Temperatur zu baden. Das Muskelgewebebad ist mit einem Kraftaufnehmer zur Messung der Muskelkraftproduktion während der Kontraktion gekoppelt. Um myomechanische Reaktionen während der Kontraktion hervorzurufen und aufzuzeichnen, verwenden Sie einen elektrischen Pulsstimulator bzw. ein Datenerfassungsprogramm. Stimulieren Sie die inkubierten Muskeln, sich durch Platinelektroden zusammenzuziehen, die zentral und auf beiden Seiten des Muskels positioniert sind.

  1. Schalten Sie das Myographensystem ein und erwärmen Sie die Kammern auf 30 °C. Offene Datenerfassungssoftware, die mit dem Myographensystem kompatibel ist, und kalibrieren Sie Kraftaufnehmer, um die Vergleichbarkeit zwischen Datensätzen zu gewährleisten.
  2. Beginnen Sie mit dem Schneiden von ~ 16 cm Strängen nicht resorbierbarer chirurgischer Nylonnähte. Verwenden Sie eine Pinzette, um aus einem einzelnen Strang eine Schleife von etwa 0,4 cm Durchmesser zu erzeugen. Wiederholen Sie dies, bis genügend Schleifen erzeugt wurden. Jeder Muskel benötigt zwei Schlaufen - eine für die proximale und eine für die distale Sehne.

2. Aufbereitung von Lösungen und Inkubationsmedien

  1. Aufbereitung von basalen Inkubationsmedien
    1. Bereiten Sie die folgenden Stammlösungen vor: 2,5 M Natriumchlorid (NaCl, 250 ml), 0,5 M Natriumbicarbonat (NaHCO 3, 250 ml), 0,5 M Kaliumchlorid (KCl, 50 ml), 0,25 m Calciumchlorid (CaCl2, 50 ml), 0,25 M Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4, 50 mL), 0,25 M Magnesiumsulfat (MgSO4,50 ml), 110 mM Natriumpyruvat (Na-Pyruvat, 100 ml), 500 mM D-Mannitol (100 ml), 1 M 2-Desoxy-D-glucose (4 ml), 15%ige Lösung von Rinderserumalbumin (BSA), dialysiert gegen Krebs-Ringer-Henseleit (KRH) Puffer (unten in Schritt 4 beschrieben) (100 ml).
      HINWEIS: Zwei Lösungen sind erforderlich, um die Ruhe- und kontraktionsstimulierte Glukoseaufnahme zu messen. Darüber hinaus erfordert jede einzelne Insulinkonzentration, die zur Beurteilung der insulinstimulierten Glukoseaufnahme verwendet wird, zwei Lösungen. Daher werden insgesamt sechs verschiedene Lösungen benötigt, um die basale, submaximale Insulin-, maximale Insulin- und kontraktionsstimulierte Glukoseaufnahme in isolierten Mausskelettmuskeln zu messen. Im Folgenden bezieht sich "basale Inkubationsmedien" auf Medien ohne Insulin oder radioaktive Tracer. "Inkubationsmedien" bezieht sich auf Medien, die Insulin enthalten. "Glukoseaufnahme-Inkubationsmedien" bezieht sich auf Medien, die neben Insulin zusätzlich zu Insulin 2-Desoxy-D-Glucose und radioaktive Tracer in einer Konzentration enthalten, die mit der in den "Inkubationsmedien" verwendeten Konzentration identisch ist.
    2. Bereiten Sie einen KRH-Puffer vor, indem Sie Reinstwasser (ddH 2 O) mit NaCl (117 mM),NaHCO 3 (24,6 mM), KCl (4,7 mM), CaCl 2 (2,5 mM), KH 2 PO 4 (1,2 mM) und MgSO4 (1,2mM) ergänzen. Anschließend wird der KRH-Puffer mit 95% O2 und 5%CO2 für mindestens 10 min abgegast. Der gewünschte pH-Wert des KRH-Puffers sollte zwischen 7,35-7,45 bei 30 °C liegen. Wenn die pH-Einstellung bei Raumtemperatur durchgeführt wird, sollte der pH-Wert des KRH-Puffers zwischen 7,25 und 7,35 liegen.
    3. BSA (0,1%), Na-Pyruvat (2 mM) und D-Mannit (8 mM) in den begasten und pH-angepassten KRH-Puffer geben, um die basalen Inkubationsmedien zu vervollständigen. Lagern Sie basale Inkubationsmedien in einem verschlossenen Behälter, um die Entgasung vonO2 und CO 2 zu minimieren, und legen Sie die Medien bei 30 °C auf.
      HINWEIS: Typischerweise wird die Osmolarität der KRH-Ergänzungen (dh Na-Pyruvat, D-Mannit und D-Glukose) über ein gesamtes Experiment konstant gehalten, um eine Schrumpfung oder Ausdehnung der Muskelzellen zu vermeiden. Das hierin beschriebene Protokoll verwendet eine Osmolarität von 10 mM für die KRH-Ergänzungen. Wenn ein glukosehaltiger Puffer benötigt wird, ersetzen Sie KRH-Ergänzungen, um den Bedarf zu decken, z. B. 5 mM D-Glucose und 5 mM D-Mannitol.
    4. Um mögliche BSA-assoziierte Verunreinigungen im Inkubationspuffer zu vermeiden, dialysieren Sie BSA gegen KRH.
      1. Um eine 15%ige BSA-Stammlösung herzustellen, die gegen KRH-Puffer dialysiert wird, lösen Sie zunächst 300 g fettfreies BSA in analytischer Qualität in 900 ml KRH-Puffer auf. Als nächstes kochen Sie das Dialyserohr in destilliertem Wasser, bis der Schlauch weich ist.
      2. Füllen Sie den Schlauch mit der BSA-KRH-Lösung und sichern Sie die Schlauchenden. Legen Sie den Schlauch mit BSA-KRH in 5 L KRH-Puffer und lassen Sie ihn über Nacht bei 4 °C stehen. Am nächsten Tag den KRH-Puffer austauschen und den Schlauch mit BSA-KRH im KRH-Puffer über Nacht bei 4 °C belassen.
      3. Sammeln Sie schließlich die BSA-KRH-Lösung aus dem Schlauch und fügen Sie KRH-Puffer zu einem Endvolumen von 2 L hinzu (d. h. 15% BSA-KRH-Stammlösung). Teilen Sie die 15% BSA-KRH-Lagerlösung in Aliquots auf und lagern Sie sie im Gefrierschrank bei ~-20 °C.
  2. Herstellung von insulinhaltigen Inkubationsmedien
    1. Für die Inkubationsmedien, die eine submaximal wirksame Insulinkonzentration enthalten, fügen Sie 1 μL einer 100 mU/ml Insulinstammlösung pro ml basaler Inkubationsmedien (100 μU/ml Insulin) hinzu.
    2. Für die Inkubationsmedien, die eine maximal wirksame Insulinkonzentration enthalten, fügen Sie 1 μL einer 10 E/ml Insulin-Stammlösung pro ml basaler Inkubationsmedien (10 mU/ml Insulin) hinzu.
  3. Herstellung von Glukoseaufnahme-Inkubationsmedien
    ACHTUNG: Der Umgang mit radioaktivem Material ist nur in einem eingeschränkten und kontrollierten Bereich durch autorisiertes Personal erlaubt und einige Universitäten, Forschungseinrichtungen und Unternehmen können den Erwerb einer "Radioaktivitätsnutzungserlaubnis" verlangen. Material und Abfall müssen gemäß den entsprechenden lokalen Verfahren, Richtlinien und Gesetzen behandelt werden.
    1. Befolgen Sie das gleiche Verfahren wie in Abschnitt 2.1.2 beschrieben.
    2. BSA (0,1%), Na-Pyruvat (2 mM), D-Mannit (7 mM) und 2-Desoxy-D-Glucose (1 mM) in den begasten und pH-eingestellten KRH-Puffer geben.
    3. [3H]2-Desoxy-D-glucose (0,028 MBq/ml) und [14C]Mannit (0,0083 MBq/ml) in den ergänzten KRH-Puffer geben, um die Glukoseaufnahme-Inkubationsmedien zu vervollständigen. Bei 30 °C lagern. Wenn [3H]2-Desoxy-D-glucose und [14C]Mannit in Ethanol gelöst sind, entfernen Sie das Ethanol durchN2-vermittelte Verdampfung vor der Verwendung.
    4. Für die Glukoseaufnahmeinkubationsmedien, die eine submaximal wirksame Insulinkonzentration enthalten, fügen Sie 1 μL einer 100 mU/ml Insulinvorratslösung pro ml Glukoseaufnahme-Inkubationsmedien (100 μE/ml Insulin) hinzu.
    5. Für die Glukoseaufnahme-Inkubationsmedien, die eine maximal wirksame Insulinkonzentration enthalten, fügen Sie 1 μL einer 10 E/ml Insulinstammlösung pro ml Glukoseaufnahme-Inkubationsmedien (10 mU/ml Insulin) hinzu.

3. Tiere und Dissektion des Maus-Soleus und des EDL-Muskels für die Inkubation

HINWEIS: Verfahren mit Versuchstieren sollten in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und lokalen Rechtsvorschriften durchgeführt werden. Das beschriebene Verfahren kann mit hauseigenen gezüchteten oder kommerziell erhältlichen männlichen und weiblichen Mäusen verschiedener Stämme und genetischer Hintergründe angewendet werden. Das folgende Verfahren wird für gefütterte weibliche C57Bl/6J-Mäuse bereitgestellt. Im Durchschnitt waren Mäuse 19 Wochen alt und wogen 25 g. Die Mäuse wurden in einem 12:12 h Hell-Dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu Standard-Nagetier-Chow und Wasser gehalten. Tierversuche wurden um ~ 9:00 Uhr Ortszeit begonnen und alle Tiere wurden innerhalb eines Zeitraums von 2 h geopfert.

  1. Geben Sie 4 ml vorerwärmte (30 °C) basale Inkubationsmedien in jede Inkubationskammer und stellen Sie sicher, dass die basalen Inkubationsmedien kontinuierlich mit 95%O2 und 5% CO2 oxygeniert sind.
  2. Anästhesien von Mäusen mit einer intraperitonealen Injektion von Pentobarbital (10 mg/100 g Körpergewicht) oder einer anderen verfügbaren Anästhesie (z. B. Tribromethanol).
    HINWEIS: Beachten Sie, dass in einigen Ländern eine Lizenz für den Umgang mit Pentobarbital und anderen Anästhetika erforderlich sein kann. Bevor eine Muskeldissektion eingeleitet werden kann, muss die Anästhesie jedes Tieres richtig induziert werden. Um dies zu gewährleisten, werden Schwanz- und Beinreflexe getestet. Für optimale Ergebnisse sollte die Dissektion gut geübt werden, um eine Schädigung der Muskeln während der Entfernung zu vermeiden.
  3. Anästhesierte Mäuse, die anfällig sind, auf ein Dissektionstablett (z. B. Styropordeckel) legen und die Vorder- und Hinterpfoten bei Bedarf mit einer Nadel feststecken.
  4. Entfernen Sie die Haut vom Unterschenkel und stellen Sie sicher, dass sowohl die Achillessehne als auch das Kniegelenk sichtbar sind.
    1. Für die Dissektion des Musculus soleus befestigen Sie zunächst eine einzelne Nahtschaufe an der Achillessehne. Befestigen Sie eine Pinzette an der Achillessehne distal der Nahtschaufe und schneiden Sie sie ab, um die Muskeln Soleus und Gastrocnemius von der Pfote zu lösen. Schieben Sie vorsichtig die Pinzette über die Maus und legen Sie dabei den Musculus soleus frei.
    2. Stecken Sie die Pinzette der Pinzette ab und legen Sie eine zweite Nahtschaufe um die proximale Sehne des Musculus soleus. Als nächstes schneiden Sie die proximale Sehne ab und sezieren Sie Soleus (einschließlich der beiden angebrachten Nahtschlaufen) frei von Magen-Magen-Darm-Muskel. Legen Sie den Musculus soleus schnell in die Inkubationskammer, indem Sie jede Nahtschaufe an den jeweiligen Haken befestigen.
  5. Entfernen Sie die Faszie, die den m. tibialis anterior (TA) bedeckt, mit einer Pinzette. Wenn es richtig gemacht wird, sollten distale Sehnen der TA- und EDL-Muskeln klar weiß und sichtbar sein; und voneinander getrennt.
  6. Schneiden Sie die distale Sehne des TA-Muskels ab und sezieren Sie den Muskel für spätere Analysen (z. B. Genotypisierung) ab. Befreien Sie mit einer Pinzette sanft den EDL-Muskel aus dem umgebenden Gewebe, lassen Sie den Muskel jedoch intakt und schneiden Sie die Sehnen nicht durch. Legen Sie eine Nahtschelle um die distale Sehne und eine zweite Nahtschelle um die proximale Sehne von EDL.
  7. Als nächstes schneiden Sie die Sehnen, die den EDL-Muskel lösen, mit zwei angebrachten Nahtschlaufen ab und legen Sie den Muskel schnell in die Inkubationskammer, indem Sie jede Nahtschelle an den jeweiligen Haken befestigen. Um die Spannung während der Inkubation und insbesondere bei der elektrisch induzierten Kontraktion der Soleus- und EDL-Muskulatur nicht zu verlieren, ist es von großer Bedeutung, die Nahtschlaufen um die Sehnen mit engen Knoten zu fixieren.
  8. Zum Schluss das Tier einschläfern, z.B. durch Zervixdislokation.
  9. Wenn die Muskeln seziert und in Inkubationskammern platziert wurden, passen Sie die Ruhespannung jedes Muskels auf ~ 5 mN an und inkubieren Sie die Muskeln für mindestens 10 Minuten vor, bevor Sie das experimentelle Protokoll einleiten.

4. Insulin-stimulierte Glukoseaufnahme in isolierter Maus-Skelettmuskulatur

  1. Nach Schritt 3.9 werden die basalen Inkubationsmedien durch Inkubationsmedien ersetzt, die kein Insulin enthalten (basale Inkubationsmedien), eine submaximal wirksame Insulinkonzentration oder eine maximal wirksame Insulinkonzentration und 20 min in den Inkubationskammern belassen. Räumen Sie jede Inkubationskammer um 1 min auf und verschaffen Sie sich so Zeit für die anschließende Muskelernte.
  2. Ersetzen Sie am Ende der 20-minütigen Stimulationsperiode die Inkubationsmedien durch die Glukoseaufnahme-Inkubationsmedien mit einer identischen Insulinkonzentration und lassen Sie sie 10 Minuten in den Inkubationskammern, wiederum mit einem Abstand von 1 min zwischen den einzelnen Inkubationskammern.
  3. Nach 10 min Inkubation in den Glukoseaufnahme-Inkubationsmedien entfernen Sie vorsichtig die Muskeln aus den Inkubationskammern und waschen sie in eiskalten basalen Inkubationsmedien. Anschließend trocknen Sie die Muskeln schnell auf Filterpapier, bevor die Nahtschlaufen entfernt und die Muskeln in flüssigem Stickstoff eingefroren werden. Es ist zwingend erforderlich, dass die inkubierten Muskeln schnell geerntet werden, wenn man neben der Glukoseaufnahme auch verschiedene intrazelluläre Metaboliten und Proteinsignale untersuchen möchte.
  4. Sammeln Sie 100 μL der Glukoseaufnahme-Inkubationsmedien aus jeder Inkubationskammer und lagern Sie sie bei -20 °C. Die Menge an Radioaktivität in diesen Proben wird in die Berechnung der Muskelglukoseaufnahme einbezogen.

5. Kontraktionsstimulierte Glukoseaufnahme in isolierten Mausskelettmuskeln

HINWEIS: Um eine Kontraktion der isolierten Mausskelettmuskulatur zu induzieren, verwenden Sie das folgende Protokoll: 1 Zug/15 s, jeder Zug 1 s lang, bestehend aus 0,2 ms Impulsen, die bei 100 Hz abgegeben werden. Andere ähnliche Protokolle, die eine Kontraktion der isolierten Mausskelettmuskulatur hervorrufen, werden jedoch wahrscheinlich auch funktionieren. Wichtig ist, dass die Spannung angepasst wird, um eine maximale Kraftentwicklung des inkubierten Muskels zu erzeugen, die vom Versuchsaufbau abhängig ist. Wenn dies nicht gewährleistet ist, riskieren Sie, dass sich nicht alle Fasern des Muskels zusammenziehen. Dies wiederum kann zu Verzerrungen im Datensatz führen.

  1. Nach Schritt 3.9 platzieren Sie die Platinelektroden zentral und auf beiden Seiten der Muskeln. Beginnen Sie die Kontraktion der Muskeln unmittelbar nach dem Ersetzen der basalen Inkubationsmedien durch die Glukoseaufnahme-Inkubationsmedien. Wenn möglich, räumen Sie jede Inkubationskammer um 1 min und verschaffen Sie sich so Zeit für die anschließende Muskelernte. Denken Sie daran, die Kraftproduktion von jedem inkubierten Muskel aufzuzeichnen.
  2. Entfernen Sie nach 10 Minuten Kontraktion in den Glukoseaufnahme-Inkubationsmedien die Platinelektroden, sammeln Sie die Muskeln vorsichtig aus den Inkubationskammern und waschen Sie sie in eiskalten basalen Inkubationsmedien. Anschließend trocknen Sie die Muskeln schnell auf Filterpapier, bevor die Nahtschlaufen entfernt und die Muskeln in flüssigem Stickstoff eingefroren werden. Der gesamte Muskelerntevorgang sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden.
  3. Sammeln Sie 100 μL der Glukoseaufnahme-Inkubationsmedien aus jeder Inkubationskammer und lagern Sie sie bei -20 °C. Die Menge an Radioaktivität in diesen Proben wird in die Berechnung der Muskelglukoseaufnahme einbezogen.

6. Homogenisierung und Verarbeitung der Skelettmuskulatur

HINWEIS: Das unten angegebene Verfahren zur Muskelhomogenisierung ermöglicht es, sowohl die Glukoseaufnahme als auch die myozelluläre Signalgebung durch Western Blotting in denselben Muskelproben zu bestimmen.

  1. Homogenisieren Sie jeden Muskel in 400 μL eiskaltem Puffer mit einem pH-Wert von 7,5, der 10% Glycerin, 20 mM Natriumpyrophosphat, 1% IGEPAL CA-630 (NP-40), 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (gelöst in Isopropanol), 150 mM NaCl, 50 mM HEPES, 20 mM β-Glycerophosphat, 10 mM Natriumfluorid (NaF), 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 1 mM Glykoletherdiamintetraessigsäure (EGTA), 10 μg/ml Aprotinin, 10 μg/ml Leupeptin, 3 mM Benzamidin und 2mM Natriumorthovanadat unter Verwendung von Stahlperlen und einem Tissuelyser (2 x 45 s bei 30 Hz). Drehen Sie alle Homogenate Ende über Ende für 1 h bei 4 °C, danach werden sie bei 16.000 x g für 20 min bei 4 °C zentrifugiert. Sammeln Sie das Lysat (Überstand), das zur Bestimmung der Muskelglukoseaufnahme verwendet wird.

7. Bestimmung von radioaktiv markiertem 2-Desoxyglucose und Mannitol

  1. Fügen Sie 150 μL jedes Muskellysats und 25 μL der Glukoseaufnahme-Inkubationsmedien aus jeder Inkubationskammer hinzu, um flüssige Szintillationszählfläschchen mit 2 ml flüssiger Szintillationsflüssigkeit zu trennen. Bereiten Sie außerdem zwei blinde Kontrollfläschchen vor, die nur 3 ml flüssige Szintillationsflüssigkeit enthalten. Schließen Sie alle Fläschchen und mischen Sie gründlich, indem Sie jede Durchstechflasche für ~ 5 s vorwirbeln.
  2. Geben Sie die Durchstechflaschen in einen flüssigen Szintillationszähler und messen Sie die Radioaktivität von [3H]2-Desoxy-D-Glucose und [14C]Mannitol gemäß den Richtlinien des Herstellers. Notieren Sie DPM (Zerfälle pro Minute) für jede flüssige Szintillationsfläschchen.

8. Berechnung der Muskelglukoseaufnahmeraten

  1. Verwenden Sie das Lysat aus Schritt 6.1, um die Gesamtproteinkonzentration in jeder Muskelprobe mit Standard-Proteinquantifizierungsmethoden (z. B. Bicinchoninsäure- oder Bradford-Assays) zu messen. Berechnen Sie die Menge an Protein (mg), die jeder Szintillationsdurchstechflasche zugesetzt wird.
    HINWEIS: Die Rate der Glukoseaufnahme für jede Muskelprobe wird berechnet, indem die Menge an [3 H]2-Desoxy-D-Glucose im extrazellulären Raum von der Gesamtmenge an [3H]2-Desoxy-D-Glucose in der Muskelprobe subtrahiert wird,wobei [14C]Mannit als extrazellulärer Marker verwendet wird. Es wird angenommen, dass [3 H]2-Desoxy-D-glucose und [14C]Mannitol während der Inkubation ähnliche Diffusionseigenschaften innerhalb des Muskelgewebesaufweisen. Führen Sie die folgenden Berechnungen durch:
  2. Beginnen Sie mit der Subtraktion des DPM [3H] und [14C] der blinden Kontrollproben von allen Muskel- und Medienproben.
  3. Bestimmung des extrazellulären Muskelraums in μL (μL-ECS):
    [14C] DPM-Muskel / ([14C]DPM-Medien / Mvol)
  4. Berechnen Sie die Menge an [3 H]DPM im extrazellulären Muskelraum ([3H]DPMECS):
    μL-ECS-× ([3H]DPM-Medien / Mvol)
  5. Berechnen Sie die Menge an [3 H]DPM im intrazellulären Muskelraum ([3H]DPMICS):
    [3H] DPM-Muskel− [3H]DPMECS
  6. Berechnen Sie die Muskelglukoseaufnahmerate (μmol / g Protein / Stunde):
    [3H] DPMICS / ([3H]DPMmedia / M vol) / [2-Desoxy-D-glucose])) / mgProtein) / Th
    HINWEIS: Für alle obigen Gleichungen gilt
    [14C] DPM-Muskel ist die Menge an [14C]Mannitol-Radioaktivität in einer Muskelprobe;
    [14C] DPM-Medien sind die Menge an [14C]Mannitol-Radioaktivität in einer Medienprobe;
    [3H] DPM-Muskel ist die Menge an [3H]2-Desoxy-D-Glukose-Radioaktivität in einer Muskelprobe;
    [3H] DPM-Mediensind die Menge an [3H]2-Desoxy-D-Glukose-Radioaktivität in einer Medienprobe;
    [3H] DPMECS ist die Menge an [3H]2-Desoxy-D-Glucose-Radioaktivität im extrazellulären Muskelraum;
    [3H] DPMICS ist die Menge an [3H]2-Desoxy-D-Glukose-Radioaktivität im intrazellulären Muskelraum;
    μL-ECS ist der extrazelluläre Muskelraum in μL;
    Mvol ist das Volumen (μL) von Inkubationsmedien, die für die Szintillationszählung verwendet werden (z. B. "25", wie oben erwähnt);
    T h ist der Zeitfaktor, der zur Berechnung der Aufnahmeraten pro Stunde verwendet wird (d.h . "1/6" beim Inkubieren von Muskeln mit Glukoseaufnahmemedien für 10 min).
  7. Berücksichtigen Sie diese Beispielberechnung. Die [3H] und [14 C] DPM der blinden Kontrollproben (17bzw. 6) wurden von den unten genannten DPM-Werten subtrahiert.
    [14C] DPM-Muskel: 343
    [14C] DPM-Medien: 11846
    [3H] DPM-Muskel: 4467
    [3H] DPM-Medien: 39814
    Mvol: 25
    mg Protein: 0,396 (in 150 μL Muskelproteinlysat)
    [2-Desoxy-D-Glukose]: 1 (mM)
    T h: 1/6 (h)
    μL-ECS = 343 DPM / (11846 DPM / 25 μL) = 0,724 μL
    [3H] DPMECS: 0,724 μL × (39814 DPM / 25 μL) = 1153 DPM
    [3H] DPM-ICS: 4467 DPM - 1153 DPM = 3314 DPM
    Glukoseaufnahme: ((3314 DPM / (39814 DPM / 25 μL) / 1 mmol / L) / 0,396 mg Protein) / (1/6 Stunde) = 31,53 μmol / g Protein / Stunde

9. SDS-PAGE und Western Blot Analysen

  1. Soleus- und EDL-Muskellysate im Laemmli-Puffer zubereiten und 5 min bei 96 °C erhitzen.
  2. Trennen Sie gleiche Mengen an Muskelprotein durch SDS-PAGE auf selbstgegossenen Gelen und übertragen Sie die Proteine auf Polyvinylidenfluoridmembranen durch halbtrockenes Blotting.
  3. Anschließend werden Membranen in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,05% Tween 20 und 2% Magermilch inkubiert und Sondenmembranen mit relevanten primären und sekundären Antikörpern.
  4. Erkennen Sie Proteine mit Chemilumineszenz und visualisieren Sie sie mit einem digitalen Bildgebungssystem.

10. Muskelglykogen, Nukleotide, Laktat, Kreatin und Phosphokreatin

  1. Verwenden Sie Perchlorsäure, um EDL- und Soleus-Muskelproben zu extrahieren.
  2. Anschließend neutralisieren Sie Proben und analysieren Sie sie auf Laktat, Kreatin und Phosphokreatin, wie zuvor beschrieben18.
  3. Analysieren Sie den Nukleotidgehalt in EDL und Soleusmuskel durch Umkehrphasen-HPLC nach der Extraktion in Perchlorsäure.
  4. Bestimmung des Muskelglykogengehalts im gesamten Muskelhomogenat als Glykosyleinheiten nach Säurehydrolyse durch eine fluorometrische Methode wie zuvor beschrieben18.

11. Statistiken

  1. Führen Sie statistische Analysen mit einer Software für statistische Analysen durch.
  2. Verwenden Sie einen ANOVA-Test (Two-Way Analysis of Variance), um statistische Unterschiede zwischen den in Tabelle 1 dargestellten Werten zu bewerten.
  3. Verwenden Sie ungepaarte Student t-Tests , um statistische Unterschiede in der Glukoseaufnahme zwischen EDL und Soleus innerhalb jeder in Abbildung 2 dargestellten Gruppe zu bewerten. Präsentieren Sie Daten als Mittel ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM). P < 0,05 gilt als statistisch signifikant.

Ergebnisse

Wie in Abbildung 2 gezeigt, waren die basalen Glukoseaufnahmeraten zwischen isoliertem Soleus- und EDL-Muskel von weiblichen Mäusen ähnlich. Dies wurde auch mehrmals vor12,13,19,20 berichtet. Die Glukoseaufnahme stieg um das ~0,8- und ~0,6-fache und erreichte 12 bzw. 9 μmol/g Protein/h im Soleus- bzw. EDL-Muskel als Reaktion auf ...

Diskussion

Eine intakte Regulierung der Glukoseaufnahme in der Skelettmuskulatur ist wichtig für die Erhaltung der allgemeinen Gesundheit1. Daher dient die Untersuchung der Muskelglukoseaufnahme oft als primäre Anzeige bei der Bewertung verschiedener gesundheitsverändernder Interventionen. Hier beschreiben wir eine Ex-vivo-Methode zur Messung der Glukoseaufnahme in isolierten und inkubierten Soleus- und EDL-Muskeln von Mäusen als Reaktion auf Insulin und elektrisch induzierte Kontraktionen. Die Methode i...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des Danish Council for Independent Research - Medical Sciences (FSS8020-00288B) und der Novo Nordisk Foundation (NNF160C0023046) unterstützt. Diese Arbeit wurde auch durch ein Forschungsstipendium an Rasmus Kjøbsted von der Danish Diabetes Academy unterstützt, das von der Novo Nordisk Foundation mit der Fördernummer NNF17SA0031406 finanziert wird. Die Autoren danken Karina Olsen, Betina Bolmgren und Irene Bech Nielsen (Department of Nutrition, Exercise and Sports, Faculty of Science, University of Copenhagen) für ihre kompetente technische Unterstützung.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
[14C]D-mannitolAmerican Radiolabeled Chemicals, Inc.ARC 0127
[3H]2-deoxy-D-glucose American Radiolabeled Chemicals, Inc.ART 0103A
2-Deoxy-D-glucoseSigmaD8375
4-0 USP non-sterile surgical nylon sutureHarvard Apparatus51-7698
Streptavidin/HRP (Conjugate)DAKOP0397Used to detect ACC protein
Akt2 antibodyCell Signaling3063
AMPKα2 antibodySanta CruzSC-19131
aprotininSigmaA1153
benzamidineSigmaB6505
Bovine serum albumin (BSA)SigmaA7030
CaCl2Merck1020831000
Calibration kit (force)Danish Myo Technology A/S300041
ChemiluminescenceMilliporeWBLUF0500
D-GlucoseMerck1084180100
D-MannitolSigmaM4125
Data collection programNational InstrumentsLabVIEW software version 7.1
Dialysis tubingViskingDTV.12000.09 Size No.9
Digital imaging systemBioRadChemiDoc MP
EDTASigma EDSE9884
EGTASigmaE4378
Electrical Pulse StimulatorDigitimerD330 MultiStim System
GlycerolSigmaG7757
HEPESSigmaH7637
IGEPAL CA-630 SigmaI8896
InsulinNovo NordiskActrapid, 100 IE/mL
KClMerck1049361000
KH2PO4Merck104873025
leupeptinSigmaL2884
MgSO4Merck1058860500
Muscle Strip Myograph SystemDanish Myo Technology A/SModel 820MS
Na-OrthovanadateSigmaS6508
Na-PyrophosphateSigma221368
Na-PyruvateSigmaP2256
NaClMerck106041000
NaFSigmaS1504
NaHCO3VWR27778260
pACC Ser212 antibodyCell Signaling3661
pAkt Thr308 antibodyCell Signaling9275
pAMPK Thr172 antibodyCell Signaling2531
phenylmethylsulfonylfluorideSigmaP7626
Platinum electrodesDanish Myo Technology A/S300145
pTBC1D4 Ser588 antibodyCell Signaling8730
Scintillation counterPerkin ElmerTri-Carb-2910TR
Scintillation fluid Perkin Elmer6013329
Statistical analyses softwareSystatSigmaPlot version 14
TBC1D4 antibodyAbcamab189890
TissueLyser II Qiagen85300
Ultrapure waterMerckMilli-Q Reference A+ System
β-glycerophosphateSigmaG9422

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