Medição da absorção de glicose estimulada por insulina e contração em músculo esquelético maduro isolado e incubado de camundongos

Resumo

A regulação intacta da absorção de glicose muscular é importante para manter a homeostase de glicose corporal inteira. Este protocolo apresenta avaliação da absorção de glicose estimulada pela insulina e contração em músculo esquelético maduro isolado e incubado ao delinear o impacto de várias intervenções fisiológicas em todo o metabolismo da glicose corporal.

Resumo

O músculo esquelético é um tecido responsivo à insulina e normalmente ocupa a maior parte da glicose que entra no sangue após uma refeição. Além disso, foi relatado que o músculo esquelético pode aumentar a extração de glicose do sangue em até 50 vezes durante o exercício em comparação com as condições de repouso. O aumento da absorção de glicose muscular durante o exercício e estimulação da insulina depende da translocação do transportador de glicose 4 (GLUT4) de compartimentos intracelulares para a membrana da superfície celular muscular, bem como fosforilação da glicose para glicose-6-fosfato por hexokinase II. Isolamento e incubação de músculos do camundongo como m. soleus e m. extensor digitorum longus (EDL) é um modelo ex vivo apropriado para estudar os efeitos da insulina e contração eletricamente induzida (um modelo para exercício) na absorção de glicose no músculo esquelético maduro. Assim, o modelo ex vivo permite a avaliação da sensibilidade à insulina muscular e possibilita a combinação da produção de força muscular durante a contração, garantindo o recrutamento uniforme de fibras musculares durante as medições da absorção de glicose muscular. Além disso, o modelo descrito é adequado para testes compostos farmacológicos que podem ter um impacto na sensibilidade à insulina muscular ou podem ser de ajuda ao tentar delinear a complexidade regulatória da absorção de glicose muscular esquelética.

Aqui descrevemos e fornecemos um protocolo detalhado sobre como medir a absorção de glicose estimulada por insulina e contração em preparações musculares isoladas e incubadas de soleus e EDL de camundongos usando radiolabeled [³H]2-deoxy-D-glicose e [¹⁴C]mannitol como um marcador extracelular. Isso permite uma avaliação precisa da absorção de glicose no músculo esquelético maduro na ausência de fatores de confusão que possam interferir no modelo animal intacto. Além disso, fornecemos informações sobre a viabilidade metabólica do músculo esquelético do camundongo incubado sugerindo que o método aplicado possui algumas ressalvas sob certas condições ao estudar o metabolismo da energia muscular.

Introdução

O músculo esquelético possui a capacidade de extrair grandes quantidades de glicose do espaço extracelular em resposta à insulina e ao exercício. Isso ajuda a manter a homeostase de glicose do corpo inteiro e garante a oferta de glicose em tempos de alta demanda energética. Uma vez que a regulação intacta da absorção de glicose muscular esquelética tem se mostrado importante para a saúde geral e o desempenho físico ^1,2, as medidas de absorção de glicose muscular durante várias condições têm recebido muita atenção. Em humanos e animais, o grampo hiperinsulinemico-euglicícmico tem sido usado como técnica padrão-ouro para avaliar a sensibilidade à insulina in vivo ^3,4. Em contraste com os achados obtidos a partir de um teste de tolerância à glicose oral, a técnica de grampo hiperinsulinem-euglicícica não requer função gastrointestinal intacta ou secreção de insulina do pâncreas e, portanto, permite que as respostas à insulina sejam comparadas entre indivíduos que apresentam variações na função gastro-intestinal e/ou pancreática. As medidas de absorção de glicose muscular in vivo durante o exercício em humanos têm sido realizadas com frequência desde a década^de 1960 5. Primeiro pelo uso de técnicas de equilíbrio arteriovenoso⁶ e posteriormente pelo uso de tomografia de emissão de pósitrons (PET) em combinação com um pósitron emissor de glicose análogo por exemplo ¹⁸F-Fluoro-deoxy-glicose⁷. Em roedores, a absorção de glicose muscular estimulada pelo exercício in vivo é tipicamente realizada pelo uso de análogos de glicose radioativo ou estável rotulados ^8,9,10.

Um método complementar às medidas de absorção de glicose muscular in vivo, é isolar e incubar pequenos músculos de roedores e, posteriormente, medir a absorção de glicose usando análogos de glicose radioativos ou estáveis^rotulados 11,12,13. Este método permite quantificação precisa e confiável das taxas de absorção de glicose no músculo esquelético maduro e pode ser realizado na presença de várias concentrações de insulina e durante a contração provocada por estimulação elétrica. Mais importante, as medidas de absorção de glicose em músculo esquelético isolado e incubado são relevantes na investigação do fenótipo metabólico muscular dos camundongos que passaram por diversas intervenções (por exemplo, nutrição, atividade física, infecção, terapêutica). O modelo muscular esquelético isolado também é uma ferramenta adequada para testes compostos farmacológicos que podem afetar a absorção de glicose por si só e/ou modificar a sensibilidade à insulina^12,14. Desta forma, a eficácia dos compostos projetados para regular o metabolismo da glicose muscular pode ser testada e avaliada em um meio altamente controlado antes do teste in vivo subsequente em modelos pré-clínicos de animais.

Em algumas condições, a viabilidade metabólica pode representar um desafio no sistema de modelo muscular esquelético isolado e incubado. De fato, a falta de um sistema circulatório nos músculos incubados implica que a entrega de substratos (por exemplo, oxigênio e nutrientes) depende totalmente da simples difusão entre as fibras musculares e o ambiente circundante. Em relação a isso, é importante que os músculos incubados sejam pequenos e finos e, portanto, representem menos uma barreira para a difusão de oxigênio durante a incubação¹⁵. Especialmente durante incubações prolongadas por várias horas, estados hipóxicos podem se desenvolver devido ao suprimento insuficiente de oxigênio, resultando em esgotamento de energia muscular¹⁵. Embora vários marcadores de viabilidade metabólica no músculo de rato incubado tenham sido relatados anteriormente, juntamente com a identificação de variáveis importantes que ajudam a manter a viabilidade muscular do rato¹⁵, uma avaliação abrangente da viabilidade metabólica em pequenos músculos de camundongos incubados ainda é justificada. Assim, atualmente, o teor de glicogênio tem sido usado principalmente como marcador de viabilidade metabólica no músculo esquelético do camundongo incubado^16,17.

Aqui descrevemos um protocolo detalhado para medir a absorção de glicose basal, insulina e contração em sola isolada e incubada e músculo EDL de camundongos usando radiolabeled [³H]2-deoxy-D-glicose e [¹⁴C]mannitol como um marcador extracelular. No presente estudo, a absorção de glicose foi medida durante um período de 10 minutos e o método é apresentado com o uso de concentrações de insulina submaxisticamente e maximamente eficazes, bem como um único protocolo de contração. No entanto, os protocolos aqui descritos podem ser facilmente modificados no que diz respeito ao tempo de incubação, daagem de insulina e protocolo de estimulação elétrica. Além disso, fornecemos uma caracterização completa de vários marcadores de viabilidade metabólica em soleus incubado e músculo do rato EDL. Os resultados indicam que a suplementação de glicose no tampão de incubação é essencial para preservar a viabilidade metabólica do músculo incubado por 1 hora.

Protocolo

Os procedimentos envolvendo animais de pesquisa devem ser realizados de acordo com as diretrizes pertinentes e a legislação local. Todos os experimentos animais utilizados para este estudo cumpriram a Convenção Europeia para a Proteção de Animais vertebrados utilizados para fins experimentais e outros científicos e foram aprovados pela Inspetoria dinamarquesa de Experimentos Animais.

1. Preparação do aparelho experimental e loops de sutura

NOTA: Para este estudo, utilize um sistema de miógrafo de tira muscular integrada com ganchos de incubação personalizados para incubar músculos esqueléticos isolados do camundongo (Figura 1). Este sistema permite que os músculos se banam em uma solução fisiológica com oxigenação contínua (95% O₂ e 5% DE CO₂) e em temperatura constante. O banho de tecido muscular é acoplado a um transdutor de força para a medição da produção de força muscular durante a contração. Para obter e registrar respostas miomecânicas durante a contração, empregue um estimulador de pulso elétrico e um programa de coleta de dados, respectivamente. Estimule os músculos incubados a contrair por eletrodos de platina posicionados centralmente e em ambos os lados do músculo.

1. Ligue o sistema de miógrafo e as câmaras quentes a 30 °C. Abra o software de coleta de dados compatível com o sistema de miógrafo e calibrar transdutores de força para garantir a comparabilidade entre conjuntos de dados.
2. Comece cortando ~16 cm de fios de sutura cirúrgica não absorvível de nylon. Use fórceps para criar um laço de aproximadamente 0,4 cm de diâmetro a partir de um único fio. Repita isso até que loops suficientes tenham sido produzidos. Cada músculo precisa de duas voltas - uma para o proximal e outra para o tendão distal.

2. Elaboração de soluções e mídia de incubação

1. Preparação de mídia basal de incubação
   1. Preparar as seguintes soluções de estoque: cloreto de sódio de 2,5 M (NaCl, 250 mL), bicarbonato de sódio de 0,5 M (NaHCO₃, 250 mL), cloreto de potássio de 0,5 M (KCl, 50 mL), 0,25 M de cloreto de cálcio (CaCl₂, 50 mL), 0,25 M de fosfato de dihidrogênio de potássio (KH₂PO₄, 50 mL), 0,25 Sulfato de magnésio (MgSO₄, 50 mL), pirugem de sódio de 110 mM (Na-Pyruvate 100 mL), 500 mM D-mannitol (100 mL), 1 M 2-desoxy-D-glicose (4 mL), solução de 15% de albumina bovina (BSA) dialisada contra tampão Krebs-Ringer-Henseleit (KRH) (descrito abaixo na etapa 4) (100 mL).
      NOTA: Duas soluções são necessárias para medir o repouso e a absorção de glicose estimulada pela contração. Além disso, cada concentração de insulina usada para avaliar a absorção de glicose estimulada pela insulina requer duas soluções. Assim, no total, seis soluções diferentes são necessárias para medir a insulina basal, submaximal, insulina máxima e absorção de glicose estimulada por contração em músculo esquelético isolado do camundongo. A seguir, "mídia basal de incubação" refere-se à mídia sem insulina ou rastreadores radioativos. 'Mídia de incubação' refere-se a meios de comunicação contendo insulina. "Mídia de incubação de glicose" refere-se a meios de comunicação contendo 2-desóxi-D-glicose e rastreadores radioativos, além de insulina em uma concentração idêntica à usada na "mídia de incubação".
   2. Prepare um buffer KRH suplementando água ultrapura (ddH₂O) com NaCl (117 mM), NaHCO₃ (24,6 mM), KCl (4,7 mM), CaCl₂ (2,5 mM), KH₂PO₄ (1,2 mM) e MgSO₄ (1,2 mM). Posteriormente, gase o buffer KRH com 95% de O₂ e 5% de CO₂ por pelo menos 10 min. O pH desejado do buffer KRH deve estar entre 7,35-7,45 a 30 °C. Se o ajuste de pH for realizado à temperatura ambiente, o pH do buffer KRH deve ficar entre 7,25-7,35.
   3. Adicione BSA (0,1%), Na-Pyruate (2 mM) e D-mannitol (8 mM) ao buffer KRH ajustado a gás e pH para completar a mídia de incubação basal. Armazene mídia basal em um recipiente selado para minimizar a desgasificação de O₂ e CO₂ e coloque a mídia a 30 °C.
      NOTA: Normalmente, a osmolaridade dos suplementos KRH (ou seja, Na-Pyruato, D-Mannitol e D-glicose) é mantida constante em todo um experimento para evitar o encolhimento ou expansão das células musculares. O protocolo descrito aqui usa uma osmolaridade de 10 mM para os suplementos KRH. Se for necessário um tampão contendo glicose, substitua os suplementos KRH para atender às necessidades, por exemplo, 5 mM D-glicose e 5 mM D-mannitol.
   4. Para evitar possíveis contaminantes associados à BSA no buffer de incubação, dilyze BSA contra KRH.
      1. Para fazer uma solução de estoque BSA de 15% diálisada contra o buffer KRH, comece dissolvendo 300 g de BSA sem gordura de grau analítico em 900 mL de buffer KRH. Em seguida, ferva o tubo de diálise em água relítila até que a tubulação esteja macia.
      2. Encha o tubo com a solução BSA-KRH e proteja as extremidades do tubo. Coloque a tubulação com BSA-KRH em 5 L de buffer KRH e deixe-a durante a noite a 4 °C. No dia seguinte substitua o buffer KRH e deixe a tubulação com BSA-KRH no buffer KRH durante a noite a 4 °C.
      3. Por fim, colete a solução BSA-KRH da tubulação e adicione o buffer KRH a um volume final de 2 L (ou seja, 15% de solução de estoque BSA-KRH). Divida a solução de estoque BSA-KRH de 15% em alíquotas e armazene no congelador a ~-20 °C.
2. Preparação de meios de incubação contendo insulina
   1. Para a mídia de incubação contendo uma concentração de insulina submaximicamente eficaz, adicione 1 μL de uma solução de estoque de insulina de 100 mU/mL por mL de mídia basal de incubação (100 μU/mL insulina).
   2. Para a mídia de incubação contendo uma concentração de insulina extremamente eficaz, adicione 1 μL de uma solução de estoque de insulina U/mL de 10 U/mL por mL de mídia basal de incubação (insulina de 10 mU/mL).
3. Preparação de mídia de incubação de captação de glicose
   ATENÇÃO: O manuseio de material radioativo só é permitido em área restrita e controlada por pessoas autorizadas e algumas universidades, instituições de pesquisa e empresas podem exigir a aquisição de uma "Licença de Uso da Radioatividade". O material e o lixo devem ser tratados de acordo com os procedimentos, diretrizes e legislações locais adequados.
   1. Siga o mesmo procedimento descrito na seção 2.1.2.
   2. Adicionar BSA (0,1%), Na-Pyruate (2 mM), D-mannitol (7 mM) e 2-desoxi-D-glicose (1 mM) ao tampão KRH ajustado a gás e pH.
   3. Adicione [³H]2-desoxy-D-glicose (0,028 MBq/mL) e [¹⁴C]mannitol (0,0083 MBq/mL) ao tampão KRH suplementado para completar a mídia de incubação de captação de glicose. Armazenar a 30 °C. Se [³H]2-desoxi-D-glicose e [¹⁴C]mannitol forem dissolvidos no etanol remova o etanol por evaporação mediada N₂ antes de usar.
   4. Para a mídia de incubação de captação de glicose contendo uma concentração de insulina submaximally eficaz, adicione 1 μL de uma solução de estoque de insulina de 100 mU/mL por mL de mídia de incubação de glicose (100 μU/mL insulina).
   5. Para a mídia de incubação de glicose contendo uma concentração de insulina extremamente eficaz, adicione 1 μL de uma solução de estoque de insulina de 10 U/mL por mL de mídia de incubação de glicose (insulina de 10 mU/mL).

3. Animais e dissecção do soleus do camundongo e músculo EDL para incubação

NOTA: Os procedimentos envolvendo animais de pesquisa devem ser realizados de acordo com as diretrizes pertinentes e a legislação local. O procedimento descrito pode ser usado com camundongos machos e fêmeas criados internamente ou comercialmente disponíveis de várias cepas e origens genéticas. O procedimento a seguir é fornecido para camundongos C57Bl/6J alimentados com mulheres. Em média, os camundongos tinham 19 semanas e pesavam 25 g. Os ratos foram mantidos em um ciclo claro-escuro de 12:12 h com livre acesso à comida e água de roedores padrão. Experimentos em animais foram iniciados às ~9:00 am hora local e todos os animais foram sacrificados dentro de um período de 2h.

1. Adicione 4 mL de mídia de incubação basal pré-aquecida (30°C) a cada câmara de incubação e certifique-se de que a mídia basal de incubação esteja continuamente oxigenada com 95% de O₂ e 5% de CO₂.
2. Anestesize camundongos com injeção intraperitoneal de pentobarbital (10 mg/100 g de peso corporal) ou outra anestesia disponível (por exemplo, tribromoetanol).
   NOTA: Esteja ciente de que em alguns países pode ser necessária uma licença para lidar com medicamentos pentobarbitais e outros anestésicos. Antes que a dissecção muscular possa ser iniciada, a anestesia de cada animal deve ser devidamente induzida. Para garantir isso, os reflexos da cauda e da perna são testados. Para obter resultados ideais, a dissecção deve ser bem praticada para evitar danificar os músculos durante a remoção.
3. Coloque camundongos anestesiados propensos a uma bandeja de dissecção (por exemplo, tampa de isopor) e fixe as patas dianteiras e traseiras, conforme necessário, usando uma agulha.
4. Remova a pele da perna inferior e certifique-se de que tanto o tendão de Aquiles quanto a articulação do joelho estejam visíveis.
   1. Para a dissecção do músculo soleus, comece anexando um único laço de sutura ao tendão de Aquiles. Fixar um fórceps de pean no tendão de Aquiles distally do laço de sutura e cortar para liberar os músculos soleus e gastrocnemius da pata. Deslize cuidadosamente as fórceps de ervilha através do rato, expondo assim o músculo soleus.
   2. Fixar os fórceps de pean e colocar um segundo laço de sutura em torno do tendão proximal do músculo soleus. Em seguida, corte o tendão proximal e disseque soleus (incluindo os dois laços de sutura anexados) livre de músculo gastrocnemius. Coloque rapidamente o músculo soleus na câmara de incubação anexando cada laço de sutura aos respectivos ganchos.
5. Remova a fáscia que cobre o m. tibialis anterior (TA) usando fórceps. Se feito corretamente, os tendões distais dos músculos TA e EDL devem ser claros brancos e visíveis; e separados um do outro.
6. Corte o tendão distal do músculo TA e disseca o músculo para análises posteriores (por exemplo, genotipagem). Usando fórceps, liberte suavemente o músculo EDL dos tecidos circundantes, mas deixe o músculo intacto e não corte os tendões. Coloque uma alça de sutura em torno do tendão distal e um segundo laço de sutura em torno do tendão proximal de EDL.
7. Em seguida, corte os tendões liberando o músculo EDL com duas alças de sutura anexadas e coloque rapidamente o músculo na câmara de incubação anexando cada laço de sutura aos respectivos ganchos. Para não perder a tensão durante a incubação e especialmente durante a contração eletricamente induzida dos músculos soleus e EDL, é de grande importância fixar os laços de sutura ao redor dos tendões com nós apertados.
8. Por fim, eutanize o animal por luxação cervical.
9. Quando os músculos tiverem sido dissecados e colocados em câmaras de incubação, ajuste a tensão de repouso de cada músculo para ~5 mN e pré-incubar os músculos por pelo menos 10 minutos antes de iniciar o protocolo experimental.

4. Absorção de glicose estimulada por insulina em músculo esquelético de camundongos isolado

1. Seguindo a etapa 3.9 substitua a mídia basal de incubação por meios de incubação que não contenham insulina (mídia de incubação basal), uma concentração de insulina submaximicamente eficaz ou uma concentração de insulina extremamente eficaz e deixe nas câmaras de incubação por 20 minutos. Espaço cada câmara de incubação por 1 min, assim dando tempo para a colheita subsequente dos músculos.
2. Ao final do período de estimulação de 20 minutos, substitua a mídia de incubação pela mídia de incubação de glicose contendo uma concentração idêntica de insulina e deixe nas câmaras de incubação por 10 minutos, novamente com 1 minuto de espaçamento entre cada câmara de incubação.
3. Após 10 minutos de incubação na mídia de incubação de glicose, remova suavemente os músculos das câmaras de incubação e lave-os em meios de incubação basal gelado. Posteriormente, seque rapidamente os músculos no papel filtro antes que as alças de sutura sejam removidas e os músculos sejam congelados em nitrogênio líquido. É imprescindível que os músculos incubados sejam colhidos rapidamente se também se desejar investigar vários metabólitos intracelulares e sinalização proteica, além da absorção de glicose.
4. Colete 100 μL da mídia de incubação de glicose de cada câmara de incubação e armazene-a a -20 °C. A quantidade de radioatividade nessas amostras será incluída no cálculo da absorção de glicose muscular.

5. Absorção de glicose estimulada por contração em músculo esquelético de camundongos isolado

NOTA: Para induzir a contração de músculo esquelético isolado do camundongo use o seguinte protocolo: 1 trem/15 s, cada trem de 1 s de comprimento composto por pulsos de 0,2 ms entregues a 100 Hz. No entanto, outros protocolos semelhantes que provocam contração de músculo esquelético de camundongos isolados provavelmente funcionarão também. É importante ressaltar que a tensão deve ser ajustada para gerar o desenvolvimento da força máxima do músculo incubado, que depende da configuração experimental. Se isso não for garantido, você pode correr o risco de que nem todas as fibras do músculo estejam contraindo. Por sua vez, isso pode induzir viés no conjunto de dados.

1. Seguindo o passo 3.9 coloque os eletrodos de platina centralmente e em ambos os lados dos músculos. Inicie a contração dos músculos imediatamente após a substituição da mídia basal de incubação pela mídia de incubação de glicose. Se possível, espaço cada câmara de incubação por 1 min, assim dando tempo para a colheita subsequente dos músculos. Lembre-se de registrar a produção de força de cada músculo incubado.
2. Após 10 minutos de contração na mídia de incubação de captação de glicose, remova os eletrodos de platina, colecione suavemente os músculos das câmaras de incubação e lave-os em meios de incubação basal gelado. Posteriormente, seque rapidamente os músculos no papel filtro antes que as alças de sutura sejam removidas e os músculos congelados em nitrogênio líquido. Todo o procedimento de colheita muscular deve ser realizado o mais rápido possível.
3. Colete 100 μL da mídia de incubação de glicose de cada câmara de incubação e armazene-a a -20 °C. A quantidade de radioatividade nessas amostras será incluída no cálculo da absorção de glicose muscular.

6. Homogeneização e processamento muscular esquelético

NOTA: O procedimento dado abaixo para homogeneização muscular permite determinar tanto a captação de glicose quanto a sinalização miocelular por manchas ocidentais no mesmo conjunto de amostras musculares.

1. Homogeneize cada músculo em 400 μL de tampão gelado com pH 7,5 contendo 10% de glicerol, 20 mM de sódio-pirofosfato, 1% IGEPAL CA-630 (NP-40), 2 mM fenilmetmethylsulfonylfluofluo (dissolvida em isopropanol), 150 mM NaCl, 50 mM HEPES, 20 mM β-gliceofosfato, 10 mM de flúor de sódio (NaF), 1 mM ácido ethylenodiaminatotraacetic (EDTA), 1 mM ácido glicoletherdiaminetetraactic (EGTA), 10 μg/ml aprotinina, 10 μg/mL leupepínia, 3 mM de benzamidina e 2mM de sódio-ortovanadate usando contas de aço e um tecido (2 x 45 s a 30 Hz). Gire todos os homogeneizadores de ponta a ponta por 1h a 4 °C após o qual são centrifugados a 16.000 x g por 20 min a 4 °C. Recolher o lysate (supernasce) que é usado para determinar a absorção de glicose muscular.

7. Determinação de radiolabeled 2-desoxyglucose e mannitol

1. Adicione 150 μL de cada lise muscular e 25 μL da mídia de incubação de glicose de cada câmara de incubação para separar frascos de cintilação líquida contendo 2 mL de fluido de cintilação líquida. Além disso, prepare dois frascos de controle cego contendo apenas 3 mL de fluido de cintilação líquida. Feche todos os frascos e misture bem ao vórtice cada frasco por ~5 s.
2. Coloque os frascos em um contador de cintilação líquida e meça radioatividade de [³H]2-desoxi-D-glicose e [¹⁴C]mannitol de acordo com as diretrizes do fabricante. Registo DPM (desintegrações por minuto) para cada frasco de cintilação líquida.

8. Cálculo das taxas de absorção de glicose muscular

1. Use o lisato da etapa 6.1 para medir a concentração total de proteínas em cada amostra muscular usando métodos padrão de quantificação de proteínas (por exemplo, ácido bicinchonínico ou ensaios de Bradford). Calcule a quantidade de proteína (mg) adicionada a cada frasco de cintilação.
   NOTA: A taxa de absorção de glicose para cada amostra muscular é calculada subtraindo a quantidade de [³H]2-deoxy-D-glicose localizada no espaço extracelular da quantidade total de [³H]2-deoxy-D-glicose na amostra muscular usando [¹⁴C]mannitol como um marcador extracelular. Supõe-se que [³H]2-deoxy-D-glicose e [¹⁴C]mannitol apresentam propriedades de difusão semelhantes dentro do tecido muscular durante a incubação. Realize os seguintes cálculos:
2. Comece subtraindo o DPM [³H] e [¹⁴C] das amostras de controle cego de todas as amostras de músculo e mídia.
3. Determine o espaço extracelular muscular em μL (μL-ECS):
   [¹⁴C] Músculo_{DPM /} ([¹⁴C]_{DPM media} / M_vol)
4. Calcule a quantidade de [³H]DPM no espaço extracelular muscular ([³H]DPM_ECS):
   μL-ECS × ([³H]_{DPM media} / M_vol)
5. Calcule a quantidade de [³H]DPM no espaço intracelular muscular ([³H]DPM_ICS):
   [³H] Músculo_DPM− [³H]DPM_ECS
6. Calcule a taxa de absorção de glicose muscular (μmol / g proteína / hora):
   [³H] DPM_ICS / ([³H]DPM_media / M_vol) / [2-desoxy-D-glicose]) / mg protein) / T_h
   NOTA: Para todas as equações acima,
   [¹⁴C] Músculo_{DPM é} a quantidade de [¹⁴C]radioatividade mannitol em uma amostra muscular;
   [¹⁴C] DPM_media é a quantidade de [¹⁴C]radioatividade mannitol em uma amostra de mídia;
   [³H] Músculo_{DPM é} a quantidade de radioatividade de [³H]2-deoxy-D-glicose em uma amostra muscular;
   [³H] DPM_mediaé a quantidade de [³H]2-deoxy-D-glicose radioatividade em uma amostra de mídia;
   [³H] DPM_ECS é a quantidade de radioatividade de [³H]2-deoxy-D-glicose no espaço extracelular muscular;
   [³H] DPM_ICS é a quantidade de radioatividade de [³H]2-deoxy-D-glicose no espaço intracelular muscular;
   μL-ECS é o espaço extracelular muscular em μL;
   M_vol é o volume (μL) de mídia de incubação usado para contagem de cintilação (por exemplo, '25' como mencionado acima);
   T_h é o fator de tempo usado para calcular as taxas de absorção por hora (ou seja, '1/6' ao incubar músculos com mídia de absorção de glicose por 10 minutos)
7. Leve em consideração este cálculo de exemplo. O DPM [³H] e [¹⁴C] das amostras de controle cego (17 e 6, respectivamente) foram subtraídos dos valores DPM mencionados abaixo.
   [¹⁴C] Músculo_DPM: 343
   [¹⁴C] Mídia_DPM: 11846
   [³H] Músculo_DPM: 4467
   [³H] Mídia_DPM: 39814
   M_vol: 25
   mg proteína: 0,396 (em 150 μL de proteína muscular lysate)
   [2-desoxi-D-glicose]: 1 (mM)
   T_h: 1/6 (h)
   μL-ECS = 343 DPM / (11846 DPM / 25 μL) = 0,724 μL
   [³H] DPM_ECS: 0,724 μL × (39814 DPM / 25 μL) = 1153 DPM
   [³H] DPM_ICS: 4467 DPM - 1153 DPM = 3314 DPM
   Captação de glicose: ((3314 DPM / (39814 DPM / 25 μL) / 1 mmol/L) / 0,396 mg de proteína) / (1/6 hora) = 31,53 μmol / g proteína / hora

9. Análises de SDS-PAGE e manchas ocidentais

1. Prepare os lises musculares soleus e EDL no tampão laemmli e aqueça por 5 min a 96 °C.
2. Separe quantidades iguais de proteína muscular por SDS-PAGE em géis autoproclamados e transfira as proteínas para membranas de flúor de polivinida por manchas semi-secas.
3. Posteriormente, incubar membranas em soro fisiológico tamponado por tris contendo 0,05% de Tween 20 e 2% de leite desnatado e membranas sondas com anticorpos primários e secundários relevantes.
4. Detecte proteínas com chemiluminescência e visualize-as por um sistema de imagem digital.

10. Glicogênio muscular, nucleotídeos, lactato, creatina e fosfocreatina

1. Use ácido polemóico para extrair amostras musculares de EDL e soleus.
2. Posteriormente, neutralize as amostras e analise-as para lactato, creatina e fosfocreatina como descrito anteriormente¹⁸.
3. Analise o teor de nucleotídeos em EDL e músculo soleus por HPLC de fase reversa após a extração em ácido polemóico.
4. Determine o teor de glicogênio muscular em todo o músculo homogeneizar como unidades de glicosyl após hidrólise ácida por um método fluorométrico como descrito anteriormente¹⁸.

11. Estatísticas

1. Realizar análises estatísticas com software de análises estatísticas.
2. Utilize uma análise bidirecional do teste de variância (ANOVA) para avaliar diferenças estatísticas entre os valores apresentados na Tabela 1.
3. Utilizar testes t de estudante não remunerados para avaliar diferenças estatísticas na absorção de glicose entre EDL e soleus dentro de cada grupo apresentado na Figura 2. Apresentar dados como meio ± erro padrão da média (SEM). P < 0,05 é considerado estatisticamente significante.

Resultados

Como mostrado na Figura 2, as taxas de absorção de glicose basal foram semelhantes entre os músculos isolados soleus e EDL de camundongos fêmeas. Isso também foi relatado várias vezes antes^de 12,13,19,20. A absorção de glicose aumentou em ~0,8 e ~0,6 dobra atingindo 12 e 9 μmol/g proteína/h no músculo soleus e EDL, respec...

Discussão

A regulação intacta da absorção de glicose no músculo esquelético é importante para preservar a saúde geral¹. Assim, a investigação da absorção de glicose muscular muitas vezes serve como leitura primária ao avaliar várias intervenções que alteram a saúde. Aqui descrevemos um método ex vivo para medir a absorção de glicose em soleus isolado e incubado e músculo EDL de camundongos em resposta à insulina e contrações eletricamente induzidas. O método é rápido e confiável ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
[14C]D-mannitol	American Radiolabeled Chemicals, Inc.	ARC 0127
[3H]2-deoxy-D-glucose	American Radiolabeled Chemicals, Inc.	ART 0103A
2-Deoxy-D-glucose	Sigma	D8375
4-0 USP non-sterile surgical nylon suture	Harvard Apparatus	51-7698
Streptavidin/HRP (Conjugate)	DAKO	P0397	Used to detect ACC protein
Akt2 antibody	Cell Signaling	3063
AMPKα2 antibody	Santa Cruz	SC-19131
aprotinin	Sigma	A1153
benzamidine	Sigma	B6505
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A7030
CaCl2	Merck	1020831000
Calibration kit (force)	Danish Myo Technology A/S	300041
Chemiluminescence	Millipore	WBLUF0500
D-Glucose	Merck	1084180100
D-Mannitol	Sigma	M4125
Data collection program	National Instruments	LabVIEW software version 7.1
Dialysis tubing	Visking	DTV.12000.09 Size No.9
Digital imaging system	BioRad	ChemiDoc MP
EDTA	Sigma EDS	E9884
EGTA	Sigma	E4378
Electrical Pulse Stimulator	Digitimer	D330 MultiStim System
Glycerol	Sigma	G7757
HEPES	Sigma	H7637
IGEPAL CA-630	Sigma	I8896
Insulin	Novo Nordisk	Actrapid, 100 IE/mL
KCl	Merck	1049361000
KH2PO4	Merck	104873025
leupeptin	Sigma	L2884
MgSO4	Merck	1058860500
Muscle Strip Myograph System	Danish Myo Technology A/S	Model 820MS
Na-Orthovanadate	Sigma	S6508
Na-Pyrophosphate	Sigma	221368
Na-Pyruvate	Sigma	P2256
NaCl	Merck	106041000
NaF	Sigma	S1504
NaHCO3	VWR	27778260
pACC Ser212 antibody	Cell Signaling	3661
pAkt Thr308 antibody	Cell Signaling	9275
pAMPK Thr172 antibody	Cell Signaling	2531
phenylmethylsulfonylfluoride	Sigma	P7626
Platinum electrodes	Danish Myo Technology A/S	300145
pTBC1D4 Ser588 antibody	Cell Signaling	8730
Scintillation counter	Perkin Elmer	Tri-Carb-2910TR
Scintillation fluid	Perkin Elmer	6013329
Statistical analyses software	Systat	SigmaPlot version 14
TBC1D4 antibody	Abcam	ab189890
TissueLyser II	Qiagen	85300
Ultrapure water	Merck	Milli-Q Reference A+ System
β-glycerophosphate	Sigma	G9422