Medição da absorção de glicose estimulada por insulina e contração em músculo esquelético maduro isolado e incubado de camundongos

Resumo

A regulação intacta da absorção de glicose muscular é importante para manter a homeostase de glicose corporal inteira. Este protocolo apresenta avaliação da absorção de glicose estimulada pela insulina e contração em músculo esquelético maduro isolado e incubado ao delinear o impacto de várias intervenções fisiológicas em todo o metabolismo da glicose corporal.

Resumo

O músculo esquelético é um tecido responsivo à insulina e normalmente ocupa a maior parte da glicose que entra no sangue após uma refeição. Além disso, foi relatado que o músculo esquelético pode aumentar a extração de glicose do sangue em até 50 vezes durante o exercício em comparação com as condições de repouso. O aumento da absorção de glicose muscular durante o exercício e estimulação da insulina depende da translocação do transportador de glicose 4 (GLUT4) de compartimentos intracelulares para a membrana da superfície celular muscular, bem como fosforilação da glicose para glicose-6-fosfato por hexokinase II. Isolamento e incubação de músculos do camundongo como m. soleus e m. extensor digitorum longus (EDL) é um modelo ex vivo apropriado para estudar os efeitos da insulina e contração eletricamente induzida (um modelo para exercício) na absorção de glicose no músculo esquelético maduro. Assim, o modelo ex vivo permite a avaliação da sensibilidade à insulina muscular e possibilita a combinação da produção de força muscular durante a contração, garantindo o recrutamento uniforme de fibras musculares durante as medições da absorção de glicose muscular. Além disso, o modelo descrito é adequado para testes compostos farmacológicos que podem ter um impacto na sensibilidade à insulina muscular ou podem ser de ajuda ao tentar delinear a complexidade regulatória da absorção de glicose muscular esquelética.

Aqui descrevemos e fornecemos um protocolo detalhado sobre como medir a absorção de glicose estimulada por insulina e contração em preparações musculares isoladas e incubadas de soleus e EDL de camundongos usando radiolabeled [³H]2-deoxy-D-glicose e [¹⁴C]mannitol como um marcador extracelular. Isso permite uma avaliação precisa da absorção de glicose no músculo esquelético maduro na ausência de fatores de confusão que possam interferir no modelo animal intacto. Além disso, fornecemos informações sobre a viabilidade metabólica do músculo esquelético do camundongo incubado sugerindo que o método aplicado possui algumas ressalvas sob certas condições ao estudar o metabolismo da energia muscular.

Introdução

O músculo esquelético possui a capacidade de extrair grandes quantidades de glicose do espaço extracelular em resposta à insulina e ao exercício. Isso ajuda a manter a homeostase de glicose do corpo inteiro e garante a oferta de glicose em tempos de alta demanda energética. Uma vez que a regulação intacta da absorção de glicose muscular esquelética tem se mostrado importante para a saúde geral e o desempenho físico ^1,2, as medidas de absorção de glicose muscular durante várias condições têm recebido muita atenção. Em humanos e animais, o grampo hiperinsulinemico-euglicícmico tem sido usado como técnica padrão-

Protocolo

Os procedimentos envolvendo animais de pesquisa devem ser realizados de acordo com as diretrizes pertinentes e a legislação local. Todos os experimentos animais utilizados para este estudo cumpriram a Convenção Europeia para a Proteção de Animais vertebrados utilizados para fins experimentais e outros científicos e foram aprovados pela Inspetoria dinamarquesa de Experimentos Animais.

1. Preparação do aparelho experimental e loops de sutura

NOTA: Para este estudo, utilize um sistema de miógrafo de tira muscular integrada com ganchos de incubação personalizados para incubar músculos esqueléticos isolados do camundong

Resultados

Como mostrado na Figura 2, as taxas de absorção de glicose basal foram semelhantes entre os músculos isolados soleus e EDL de camundongos fêmeas. Isso também foi relatado várias vezes antes^de 12,13,19,20. A absorção de glicose aumentou em ~0,8 e ~0,6 dobra atingindo 12 e 9 μmol/g proteína/h no músculo soleus e EDL, respec...

Discussão

A regulação intacta da absorção de glicose no músculo esquelético é importante para preservar a saúde geral¹. Assim, a investigação da absorção de glicose muscular muitas vezes serve como leitura primária ao avaliar várias intervenções que alteram a saúde. Aqui descrevemos um método ex vivo para medir a absorção de glicose em soleus isolado e incubado e músculo EDL de camundongos em resposta à insulina e contrações eletricamente induzidas. O método é rápido e confiável ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
[14C]D-mannitol	American Radiolabeled Chemicals, Inc.	ARC 0127
[3H]2-deoxy-D-glucose	American Radiolabeled Chemicals, Inc.	ART 0103A
2-Deoxy-D-glucose	Sigma	D8375
4-0 USP non-sterile surgical nylon suture	Harvard Apparatus	51-7698
Streptavidin/HRP (Conjugate)	DAKO	P0397	Used to detect ACC protein
Akt2 antibody	Cell Signaling	3063
AMPKα2 antibody	Santa Cruz	SC-19131
aprotinin	Sigma	A1153
benzamidine	Sigma	B6505
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A7030
CaCl2	Merck	1020831000
Calibration kit (force)	Danish Myo Technology A/S	300041
Chemiluminescence	Millipore	WBLUF0500
D-Glucose	Merck	1084180100
D-Mannitol	Sigma	M4125
Data collection program	National Instruments	LabVIEW software version 7.1
Dialysis tubing	Visking	DTV.12000.09 Size No.9
Digital imaging system	BioRad	ChemiDoc MP
EDTA	Sigma EDS	E9884
EGTA	Sigma	E4378
Electrical Pulse Stimulator	Digitimer	D330 MultiStim System
Glycerol	Sigma	G7757
HEPES	Sigma	H7637
IGEPAL CA-630	Sigma	I8896
Insulin	Novo Nordisk	Actrapid, 100 IE/mL
KCl	Merck	1049361000
KH2PO4	Merck	104873025
leupeptin	Sigma	L2884
MgSO4	Merck	1058860500
Muscle Strip Myograph System	Danish Myo Technology A/S	Model 820MS
Na-Orthovanadate	Sigma	S6508
Na-Pyrophosphate	Sigma	221368
Na-Pyruvate	Sigma	P2256
NaCl	Merck	106041000
NaF	Sigma	S1504
NaHCO3	VWR	27778260
pACC Ser212 antibody	Cell Signaling	3661
pAkt Thr308 antibody	Cell Signaling	9275
pAMPK Thr172 antibody	Cell Signaling	2531
phenylmethylsulfonylfluoride	Sigma	P7626
Platinum electrodes	Danish Myo Technology A/S	300145
pTBC1D4 Ser588 antibody	Cell Signaling	8730
Scintillation counter	Perkin Elmer	Tri-Carb-2910TR
Scintillation fluid	Perkin Elmer	6013329
Statistical analyses software	Systat	SigmaPlot version 14
TBC1D4 antibody	Abcam	ab189890
TissueLyser II	Qiagen	85300
Ultrapure water	Merck	Milli-Q Reference A+ System
β-glycerophosphate	Sigma	G9422