Medición de la absorción de glucosa estimulada por insulina y contracción en músculo esquelético maduro aislado e incubado de ratones

Resumen

La regulación intacta de la absorción de glucosa muscular es importante para mantener la homeostasis de glucosa en todo el cuerpo. Este protocolo presenta una evaluación de la absorción de glucosa estimulada por la insulina y la contracción en el músculo esquelético maduro aislado e incubado al delinear el impacto de varias intervenciones fisiológicas en el metabolismo de la glucosa en todo el cuerpo.

Resumen

El músculo esquelético es un tejido sensible a la insulina y generalmente absorbe la mayor parte de la glucosa que ingresa a la sangre después de una comida. Además, se ha informado que el músculo esquelético puede aumentar la extracción de glucosa de la sangre hasta 50 veces durante el ejercicio en comparación con las condiciones de reposo. El aumento en la absorción de glucosa muscular durante el ejercicio y la estimulación de la insulina depende de la translocación del transportador de glucosa 4 (GLUT4) de los compartimentos intracelulares a la membrana de la superficie de la célula muscular, así como de la fosforilación de la glucosa a glucosa-6-fosfato por la hexoquinasa II. El aislamiento e incubación de músculos de ratón como m. soleus y m. extensor digitorum longus (EDL) es un modelo ex vivo apropiado para estudiar los efectos de la insulina y la contracción inducida eléctricamente (un modelo para el ejercicio) en la absorción de glucosa en el músculo esquelético maduro. Por lo tanto, el modelo ex vivo permite la evaluación de la sensibilidad a la insulina muscular y permite igualar la producción de fuerza muscular durante la contracción, asegurando un reclutamiento uniforme de las fibras musculares durante las mediciones de la absorción de glucosa muscular. Además, el modelo descrito es adecuado para pruebas farmacológicas de compuestos que pueden tener un impacto en la sensibilidad a la insulina muscular o pueden ser de ayuda cuando se trata de delinear la complejidad reguladora de la absorción de glucosa del músculo esquelético.

Aquí describimos y proporcionamos un protocolo detallado sobre cómo medir la absorción de glucosa estimulada por la insulina y la contracción en preparaciones musculares aisladas e incubadas de sóleo y EDL de ratones que utilizan [³H]2-desoxi-D-glucosa y [¹⁴C]manitol como marcador extracelular. Esto permite una evaluación precisa de la absorción de glucosa en el músculo esquelético maduro en ausencia de factores de confusión que puedan interferir en el modelo animal intacto. Además, proporcionamos información sobre la viabilidad metabólica del músculo esquelético de ratón incubado, lo que sugiere que el método aplicado posee algunas advertencias bajo ciertas condiciones al estudiar el metabolismo de la energía muscular.

Introducción

El músculo esquelético posee la capacidad de extraer grandes cantidades de glucosa del espacio extracelular en respuesta a la insulina y el ejercicio. Esto ayuda a mantener la homeostasis de glucosa en todo el cuerpo y asegura el suministro de glucosa durante los momentos de alta demanda de energía. Dado que se ha demostrado que la regulación intacta de la absorción de glucosa del músculo esquelético es importante para la salud general y el rendimiento físico ^1,2, las mediciones de la absorción de glucosa muscular durante diversas afecciones han recibido mucha atención. En humanos y animales, la pinza hiperinsulinémica-euglucémica se ha utilizado como la técnica estándar de oro para evaluar la sensibilidad a la insulina in vivo ^3,4. A diferencia de los hallazgos obtenidos de una prueba de tolerancia oral a la glucosa, la técnica de pinza hiperinsulinémica-euglucémica no requiere una función gastrointestinal intacta o la secreción de insulina del páncreas y, por lo tanto, permite comparar las respuestas a la insulina entre sujetos que exhiben variaciones en la función gastrointestinal y / o pancreática. Las mediciones de la absorción de glucosa muscular in vivo durante el ejercicio en humanos se han realizado con frecuencia desde la década de 1960⁵. Primero mediante el uso de técnicas de equilibrio arteriovenoso⁶ y más tarde mediante el uso de imágenes de tomografía por emisión de positrones (PET) en combinación con un análogo de glucosa emisora de positrones, por ejemplo, ¹⁸F-fluoro-desoxi-glucosa⁷. En roedores, la absorción de glucosa muscular estimulada por el ejercicio in vivo se realiza típicamente mediante el uso de análogos de glucosa marcados con isótopos radiactivos o estables ^8,9,10.

Un método complementario a las mediciones de la captación de glucosa muscular in vivo, es aislar e incubar músculos pequeños de roedores y posteriormente medir la absorción de glucosa utilizando análogos de glucosa marcados con isótopos radiactivos o estables 11,12,13. Este método permite una cuantificación precisa y confiable de las tasas de absorción de glucosa en el músculo esquelético maduro y se puede realizar en presencia de varias concentraciones de insulina y durante la contracción provocada por la estimulación eléctrica. Más importante aún, las mediciones de la absorción de glucosa en el músculo esquelético aislado e incubado son relevantes cuando se investiga el fenotipo metabólico muscular de ratones que se han sometido a diversas intervenciones (por ejemplo, nutrición, actividad física, infección, terapéutica). El modelo de músculo esquelético aislado es también una herramienta adecuada para las pruebas de compuestos farmacológicos que pueden afectar la absorción de glucosa per se y/o modificar la sensibilidad a la insulina^12,14. De esta manera, la eficacia de los compuestos diseñados para regular el metabolismo de la glucosa muscular puede ser probada y evaluada en un entorno altamente controlado antes de las pruebas in vivo posteriores en modelos animales preclínicos.

Bajo algunas condiciones, la viabilidad metabólica puede plantear un desafío en el sistema modelo de músculo esquelético aislado e incubado. De hecho, la falta de un sistema circulatorio en los músculos incubados implica que la entrega de sustratos (por ejemplo, oxígeno y nutrientes) depende completamente de la difusión simple entre las fibras musculares y el entorno circundante. Con respecto a esto, es de importancia que los músculos incubados sean pequeños y delgados y, por lo tanto, representen menos barrera para la difusión de oxígeno durante la incubación¹⁵. Especialmente durante incubaciones prolongadas durante varias horas, se pueden desarrollar estados hipóxicos debido al suministro insuficiente de oxígeno que resulta en el agotamiento de la energía muscular¹⁵. Aunque varios marcadores de viabilidad metabólica en el músculo de rata incubado se han reportado previamente junto con la identificación de variables importantes que ayudan a mantener la viabilidad muscular de^{la rata 15}, todavía se justifica una evaluación exhaustiva de la viabilidad metabólica en pequeños músculos de ratones incubados. Por lo tanto, en la actualidad, el contenido de glucógeno se ha utilizado principalmente como marcador de viabilidad metabólica en el músculo esquelético de ratón incubado^16,17.

Aquí describimos un protocolo detallado para medir la absorción de glucosa basal, estimulada por la insulina y la contracción en el músculo sóleo y EDL aislado e incubado de ratones utilizando [³H]2-desoxi-D-glucosa y [¹⁴C]manitol como marcador extracelular. En el presente estudio, la absorción de glucosa se midió durante un período de 10 minutos y el método se presenta con el uso de concentraciones de insulina submáxima y máximamente efectivas, así como un protocolo de contracción único. Sin embargo, los protocolos descritos en este documento pueden modificarse fácilmente con respecto al tiempo de incubación, la dosis de insulina y el protocolo de estimulación eléctrica. Además, proporcionamos una caracterización exhaustiva de varios marcadores de viabilidad metabólica en el sóleo incubado y el músculo de ratón EDL. Los resultados indican que la suplementación con glucosa al tampón de incubación es esencial para preservar la viabilidad metabólica del músculo incubado durante 1 hora.

Protocolo

Los procedimientos en los que participen animales de investigación deben realizarse de conformidad con las directrices pertinentes y la legislación local. Todos los experimentos con animales utilizados para este estudio cumplieron con el Convenio Europeo para la Protección de los Animales Vertebrados utilizados para Fines Experimentales y otros Fines Científicos y fueron aprobados por la Inspección Danesa de Experimentación Animal.

1. Preparación del aparato experimental y de los bucles de sutura

NOTA: Para este estudio, utilice un sistema de miógrafo de tira muscular integrado con ganchos de incubación personalizados para incubar músculos esqueléticos de ratón aislados (Figura 1). Este sistema permite que el músculo se bañe en una solución fisiológica con oxigenación continua (95% O₂ y 5% CO₂) y a temperatura constante. El baño de tejido muscular está acoplado a un transductor de fuerza para la medición de la producción de fuerza muscular durante la contracción. Para obtener y registrar respuestas miomecánicas durante la contracción, emplee un estimulador de pulso eléctrico y un programa de recopilación de datos, respectivamente. Estimular los músculos incubados para que se contraigan mediante electrodos de platino colocados centralmente y a ambos lados del músculo.

1. Encienda el sistema de miógrafo y caliente las cámaras a 30 °C. Software de recopilación de datos abiertos compatible con el sistema de miógrafo y calibrar transductores de fuerza para garantizar la comparabilidad entre conjuntos de datos.
2. Comience cortando hebras de ~ 16 cm de sutura de nylon quirúrgico no absorbible. Use fórceps para crear un lazo de aproximadamente 0,4 cm de diámetro a partir de una sola hebra. Repita esto hasta que se hayan producido suficientes bucles. Cada músculo necesita dos asas: una para el tendón proximal y otra para el tendón distal.

2. Preparación de soluciones y medios de incubación

1. Preparación de medios de incubación basal
   1. Preparar las siguientes soluciones madre: cloruro de sodio de 2,5 M (NaCl, 250 mL), bicarbonato de sodio de 0,5 M (NaHCO₃, 250 mL), cloruro de potasio de 0,5 M (KCl, 50 mL), cloruro de calcio de 0,25 M (CaCl₂, 50 mL), fosfato de dihidrógeno potásico de 0,25 M (KH₂PO₄, 50 mL), sulfato de magnesio de 0,25 M (MgSO₄, 50 mL), piruvato de sodio de 110 mM (Na-Piruvato, 100 mL), 500 mM D-manitol (100 mL), 1 M 2-desoxi-D-glucosa (4 mL), solución al 15% de albúmina sérica bovina (BSA) dializada contra tampón Krebs-Ringer-Henseleit (KRH) (descrito a continuación en el paso 4) (100 ml).
      NOTA: Se requieren dos soluciones para medir la absorción de glucosa en reposo y estimulada por la contracción. Además, cada concentración de insulina utilizada para evaluar la absorción de glucosa estimulada por insulina requiere dos soluciones. Por lo tanto, en total se necesitan seis soluciones diferentes para medir la absorción de insulina basal, submáxima, insulina máxima y glucosa estimulada por la contracción en el músculo esquelético aislado del ratón. A continuación, "medios de incubación basal" se refiere a los medios sin insulina ni trazadores radiactivos. "Medios de incubación" se refiere a los medios que contienen insulina. «Medio de incubación de captación de glucosa»: medio que contiene 2-desoxi-D-glucosa y trazadores radiactivos, además de insulina, a una concentración idéntica a la utilizada en los «medios de incubación».
   2. Prepare un tampón KRH complementando agua ultrapura (ddH₂O) con NaCl (117 mM), NaHCO₃ (24.6 mM), KCl (4.7 mM), CaCl₂ (2.5 mM), KH₂PO₄ (1.2 mM) y MgSO₄ (1.2 mM). Posteriormente, gasee el tampón KRH con 95% de O₂ y 5% de CO₂ durante al menos 10 min. El pH deseado del tampón KRH debe estar entre 7.35-7.45 a 30 °C. Si el ajuste del pH se realiza a temperatura ambiente, el pH del tampón KRH debe estar entre 7.25-7.35.
   3. Agregue BSA (0.1%), Na-piruvato (2 mM) y D-manitol (8 mM) al tampón KRH gaseado y ajustado al pH para completar el medio de incubación basal. Almacene los medios de incubación basales en un recipiente sellado para minimizar la desgasificación de O₂ y CO₂ y coloque los medios a 30 °C.
      NOTA: Por lo general, la osmolaridad de los suplementos de KRH (es decir, Na-piruvato, D-manitol y D-glucosa) se mantiene constante a lo largo de todo un experimento para evitar la contracción o expansión de las células musculares. El protocolo descrito aquí utiliza una osmolaridad de 10 mM para los suplementos de KRH. Si se necesita un tampón que contenga glucosa, reemplace los suplementos de KRH para satisfacer las necesidades, por ejemplo, 5 mM de D-glucosa y 5 mM de D-manitol.
   4. Para evitar posibles contaminantes asociados a BSA en el tampón de incubación, dialice BSA contra KRH.
      1. Para hacer una solución madre de BSA al 15% dializada contra el tampón KRH, comience disolviendo 300 g de BSA libre de grasa de grado analítico en 900 ml de tampón KRH. A continuación, hierva el tubo de diálisis en agua redilada hasta que el tubo esté blando.
      2. Llene el tubo con la solución BSA-KRH y asegure los extremos del tubo. Coloque el tubo con BSA-KRH en 5 L de tampón KRH y déjelo durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, reemplace el tampón KRH y deje el tubo con BSA-KRH en el tampón KRH durante la noche a 4 ° C.
      3. Por último, recoja la solución BSA-KRH de la tubería y agregue el tampón KRH a un volumen final de 2 L (es decir, una solución madre BSA-KRH al 15%). Divida la solución madre de BSA-KRH al 15% en alícuotas y guárdela en el congelador a ~ -20 ° C.
2. Preparación de medios de incubación que contienen insulina
   1. Para los medios de incubación que contienen una concentración de insulina submáximamente efectiva, agregue 1 μL de una solución madre de insulina de 100 mU/mL por ml de medio de incubación basal (100 μU/mL de insulina).
   2. Para los medios de incubación que contienen una concentración de insulina máxima efectiva, agregue 1 μL de una solución madre de insulina de 10 U / ml por ml de medio de incubación basal (10 ml / ml de insulina).
3. Preparación de los medios de incubación de captación de glucosa
   PRECAUCIÓN: El manejo de material radiactivo solo está permitido en un área restringida y controlada por personal autorizado y algunas universidades, instituciones de investigación y empresas pueden requerir la adquisición de un "Permiso de Uso de Radiactividad". El material y los desechos deben manejarse de acuerdo con los procedimientos, directrices y legislación locales apropiados.
   1. Siga el mismo procedimiento descrito en la sección 2.1.2.
   2. Agregue BSA (0.1%), Na-piruvato (2 mM), D-manitol (7 mM) y 2-desoxi-D-glucosa (1 mM) al tampón KRH gaseado y ajustado al pH.
   3. Añadir [³H]2-desoxi-D-glucosa (0,028 MBq/mL) y [¹⁴C]manitol (0,0083 MBq/mL) al tampón KRH suplementado para completar el medio de incubación de la absorción de glucosa. Conservar a 30 °C. Si [³H]2-desoxi-D-glucosa y [¹⁴C]manitol se disuelven en etanol, elimine el etanol por evaporación mediada por N₂ antes de su uso.
   4. Para los medios de incubación de captación de glucosa que contienen una concentración de insulina submáximamente efectiva, agregue 1 μL de una solución madre de insulina de 100 mU/mL por ml de medio de incubación de absorción de glucosa (100 μU/mL de insulina).
   5. Para los medios de incubación de captación de glucosa que contienen una concentración de insulina máximamente efectiva, agregue 1 μL de una solución madre de insulina de 10 U/mL por ml de medio de incubación de absorción de glucosa (10 mU/mL de insulina).

3. Animales y disección del sóleo de ratón y músculo EDL para incubación

NOTA: Los procedimientos que involucran animales de investigación deben realizarse de acuerdo con las directrices pertinentes y la legislación local. El procedimiento descrito se puede utilizar con ratones machos y hembras criados internamente o disponibles comercialmente de diversas cepas y antecedentes genéticos. El siguiente procedimiento se proporciona para ratones hembra C57Bl / 6J alimentados. En promedio, los ratones tenían 19 semanas de edad y pesaban 25 g. Los ratones se mantuvieron en un ciclo de luz-oscuridad de 12:12 h con acceso gratuito a chow de roedores estándar y agua. Los experimentos con animales se iniciaron a ~ 9:00 AM hora local y todos los animales fueron sacrificados en un período de 2 h.

1. Agregue 4 ml de medios de incubación basal precalentados (30 ° C) a cada cámara de incubación y asegúrese de que los medios de incubación basal estén continuamente oxigenados con 95% de O₂ y 5% de CO₂.
2. Anestesiar ratones con una inyección intraperitoneal de pentobarbital (10 mg/100 g de peso corporal) u otra anestesia disponible (por ejemplo, tribromoetanol).
   NOTA: Tenga en cuenta que en algunos países se puede requerir una licencia para manejar pentobarbital y otros medicamentos anestésicos. Antes de que se pueda iniciar la disección muscular, se debe inducir adecuadamente la anestesia de cada animal. Para garantizar esto, se prueban los reflejos de la cola y las piernas. Para obtener resultados óptimos, la disección debe practicarse bien para evitar dañar los músculos durante la extracción.
3. Coloque los ratones anestesiados propensos en una bandeja de disección (por ejemplo, tapa de espuma de poliestireno) y fije las patas delanteras y traseras, según sea necesario, con una aguja.
4. Retire la piel de la parte inferior de la pierna y asegúrese de que tanto el tendón de Aquiles como la articulación de la rodilla sean visibles.
   1. Para la disección del músculo sóleo, comience uniendo un solo asa de sutura al tendón de Aquiles. Asegure un pinza de guisante al tendón de Aquiles distalmente del asa de sutura y corte para liberar los músculos sóleo y gastrocnemio de la pata. Deslice cuidadosamente las pinzas de guisantes a través del ratón, exponiendo así el músculo sóleo.
   2. Fije las pinzas de guisantes y coloque un segundo lazo de sutura alrededor del tendón proximal del músculo sóleo. A continuación, corte el tendón proximal y diseccione el sóleo (incluidos los dos asas de sutura unidos) libre de músculo gastrocnemio. Coloque rápidamente el músculo sóleo en la cámara de incubación uniendo cada lazo de sutura a los ganchos respectivos.
5. Retire la fascia que cubre el m. tibialis anterior (TA) con fórceps. Si se hace correctamente, los tendones distales de los músculos TA y EDL deben ser blancos claros y visibles; y separados el uno del otro.
6. Cortar el tendón distal del músculo TA y diseccionar el músculo para análisis posteriores (por ejemplo, genotipado). Usando fórceps, libere suavemente el músculo EDL de los tejidos circundantes, pero deje el músculo intacto y no corte los tendones. Coloque un bucle de sutura alrededor del tendón distal y un segundo bucle de sutura alrededor del tendón proximal de EDL.
7. A continuación, corte los tendones liberando el músculo EDL con dos asas de sutura unidas y coloque rápidamente el músculo en la cámara de incubación uniendo cada lazo de sutura a los ganchos respectivos. Para no perder tensión durante la incubación y especialmente durante la contracción inducida eléctricamente de los músculos sóleo y EDL, es de gran importancia fijar los bucles de sutura alrededor de los tendones con nudos apretados.
8. Por último, sacrificar al animal mediante, por ejemplo, dislocación cervical.
9. Cuando los músculos hayan sido diseccionados y colocados en cámaras de incubación, ajuste la tensión en reposo de cada músculo a ~ 5 mN y predicuba los músculos durante al menos 10 minutos antes de iniciar el protocolo experimental.

4. Absorción de glucosa estimulada por insulina en músculo esquelético aislado de ratón

1. Después del paso 3.9, reemplace los medios de incubación basales con medios de incubación que no contengan insulina (medios de incubación basal), una concentración de insulina submáximamente efectiva o una concentración de insulina máximamente efectiva y déjelos en las cámaras de incubación durante 20 min. Espaciar cada cámara de incubación por 1 min, haciendo así tiempo para la posterior cosecha de músculos.
2. Al final del período de estimulación de 20 minutos, reemplace el medio de incubación con el medio de incubación de absorción de glucosa que contiene una concentración idéntica de insulina y déjelo en las cámaras de incubación durante 10 minutos, nuevamente con un espacio de 1 minuto entre cada cámara de incubación.
3. Después de 10 minutos de incubación en los medios de incubación de captación de glucosa, retire suavemente los músculos de las cámaras de incubación y lávelos en medios de incubación basales helados. Posteriormente, seque rápidamente los músculos en papel de filtro antes de que se eliminen los bucles de sutura y los músculos se congelen en nitrógeno líquido. Es imperativo que los músculos incubados se recolecten rápidamente si también se desea investigar varios metabolitos intracelulares y la señalización de proteínas, además de la absorción de glucosa.
4. Recoger 100 μL del medio de incubación de captación de glucosa de cada cámara de incubación y almacenarlo a -20 °C. La cantidad de radiactividad en estas muestras se incluirá en el cálculo de la absorción de glucosa muscular.

5. Absorción de glucosa estimulada por contracción en músculo esquelético aislado de ratón

NOTA: Para inducir la contracción del músculo esquelético aislado del ratón utilice el siguiente protocolo: 1 tren/15 s, cada tren de 1 s de largo que consiste en pulsos de 0,2 ms entregados a 100 Hz. Sin embargo, otros protocolos similares que provocan la contracción del músculo esquelético aislado del ratón probablemente también funcionarán. Es importante destacar que el voltaje debe ajustarse para generar el máximo desarrollo de fuerza del músculo incubado, que depende de la configuración experimental. Si esto no está asegurado, puede correr el riesgo de que no todas las fibras del músculo se contraigan. A su vez, esto puede inducir sesgo en el conjunto de datos.

1. Siguiendo el paso 3.9 coloque los electrodos de platino centralmente y a ambos lados de los músculos. Iniciar la contracción de los músculos inmediatamente después de reemplazar los medios de incubación basales con los medios de incubación de captación de glucosa. Si es posible, espacie cada cámara de incubación por 1 minuto, haciendo así tiempo para la posterior cosecha de músculos. Recuerde registrar la producción de fuerza de cada músculo incubado.
2. Después de 10 minutos de contracción en el medio de incubación de captación de glucosa, retire los electrodos de platino, recoja suavemente los músculos de las cámaras de incubación y lávelos en medios de incubación basal helados. Posteriormente, seque rápidamente los músculos en papel de filtro antes de que se eliminen los bucles de sutura y los músculos se congelen en nitrógeno líquido. Todo el procedimiento de cosecha muscular debe realizarse lo más rápido posible.
3. Recoger 100 μL del medio de incubación de captación de glucosa de cada cámara de incubación y almacenarlo a -20 °C. La cantidad de radiactividad en estas muestras se incluirá en el cálculo de la absorción de glucosa muscular.

6. Homogeneización y procesamiento del músculo esquelético

NOTA: El procedimiento que se da a continuación para la homogeneización muscular permite determinar tanto la absorción de glucosa como la señalización miocelular mediante western blotting en el mismo conjunto de muestras musculares.

1. Homogeneizar cada músculo en 400 μL de tampón helado con pH 7,5 que contiene 10% de glicerol, 20 mM de sodio-pirofosfato, 1% de IGEPAL CA-630 (NP-40), 2 mM de fenilmetilsulfonilfluoruro (disuelto en isopropanol), 150 mM de NaCl, 50 mM de HEPES, 20 mM de β-glicerofosfato, 10 mM de fluoruro de sodio (NaF), 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 1 mM de ácido glicoleterdiaminatetraacético (EGTA), 10 μg/ml de aprotinina, 10 μg/ml de leupeptina, 3 mM de benzamidina y 2 mM de ortovanadato de sodio utilizando perlas de acero y un alisador tisular (2 x 45 s a 30 Hz). Gire todos los homogeneizados de extremo a extremo durante 1 h a 4 °C, después de lo cual se centrifugan a 16.000 x g durante 20 min a 4 °C. Recoger el lisado (sobrenadante) que se utiliza para determinar la absorción de glucosa muscular.

7. Determinación de 2-desoxiglucosa radiomarcada y manitol

1. Agregue 150 μL de cada lisado muscular y 25 μL de los medios de incubación de captación de glucosa de cada cámara de incubación para separar los viales de conteo de centelleo líquido que contienen 2 ml de líquido de centelleo líquido. Además, prepare dos viales de control ciegos que solo contengan 3 ml de líquido de centelleo. Cierre todos los viales y mezcle bien vórtice cada vial durante ~5 s.
2. Coloque los viales en un contador de centelleo líquido y mida la radiactividad de [³H]2-desoxi-D-glucosa y [¹⁴C]manitol de acuerdo con las directrices del fabricante. Registre DPM (desintegraciones por minuto) para cada vial de centelleo líquido.

8. Cálculo de las tasas de absorción de glucosa muscular

1. Use el lisado del paso 6.1 para medir la concentración total de proteínas en cada muestra muscular utilizando métodos estándar de cuantificación de proteínas (por ejemplo, ácido bicinconinico o ensayos de Bradford). Calcule la cantidad de proteína (mg) añadida a cada vial de centelleo.
   NOTA: La tasa de absorción de glucosa para cada muestra muscular se calcula restando la cantidad de [³H]2-desoxi-D-glucosa localizada en el espacio extracelular de la cantidad total de [³H]2-desoxi-D-glucosa en la muestra muscular utilizando [¹⁴C]manitol como marcador extracelular. Se supone que [³H]2-desoxi-D-glucosa y [¹⁴C]manitol exhiben propiedades de difusión similares dentro del tejido muscular durante la incubación. Realice los siguientes cálculos:
2. Comience restando el DPM [³H] y [¹⁴C] de las muestras de control ciego de todas las muestras de músculos y medios.
3. Determinar el espacio extracelular muscular en μL (μL-ECS):
   [¹⁴C] Músculo_{DPM /} ([¹⁴C]DPM_media / M_vol)
4. Calcule la cantidad de [³H]DPM en el espacio extracelular muscular ([³H]DPM_ECS):
   μL-ECS × ([³H]DPM_media / M_vol)
5. Calcule la cantidad de [³H]DPM en el espacio intracelular muscular ([³H]DPM_ICS):
   [³H] Músculo_DPM− [³H]DPM_ECS
6. Calcular la tasa de absorción de glucosa muscular (μmol / g de proteína / hora):
   [³H] DPM_ICS / ([³H]DPM_media / M_vol) / [2-desoxi-D-glucosa])) / mg de proteína) / T_h
   NOTA: Para todas las ecuaciones anteriores,
   [¹⁴C] El_músculo DPM es la cantidad de [¹⁴C]radiactividad de manitol en una muestra muscular;
   [¹⁴C] El_medio DPM es la cantidad de [¹⁴C]radiactividad de manitol en una muestra de medios;
   [³H] El_músculo DPM es la cantidad de [³H]2-desoxi-D-glucosa radiactividad en una muestra muscular;
   [³H] El_medioDPM es la cantidad de [³H]2-desoxi-D-glucosa radiactividad en una muestra de medios;
   [³H] DPM_ECS es la cantidad de [³H]2-desoxi-D-glucosa radiactividad en el espacio extracelular muscular;
   [³H] DPM_ICS es la cantidad de [³H]2-desoxi-D-glucosa radiactividad en el espacio intracelular muscular;
   μL-ECS es el espacio extracelular muscular en μL;
   M_vol es el volumen (μL) de los medios de incubación utilizados para el conteo de centelleo (por ejemplo, '25' como se mencionó anteriormente);
   T_h es el factor de tiempo utilizado para calcular las tasas de absorción por hora (es decir, '1/6' al incubar músculos con medios de absorción de glucosa durante 10 min)
7. Tenga en cuenta este cálculo de ejemplo. El DPM [³H] y [¹⁴C] de las muestras de control ciego (17 y 6, respectivamente) se han restado de los valores de DPM mencionados a continuación.
   [¹⁴C] Músculo_DPM: 343
   [¹⁴C] Medios_DPM: 11846
   [³H] Músculo_DPM: 4467
   [³H] Medios_DPM: 39814
   M_vol: 25
   mg de proteína: 0,396 (en lisado de proteína muscular de 150 μL)
   [2-desoxi-D-glucosa]: 1 (mM)
   T_h: 1/6 (h)
   μL-ECS = 343 DPM / (11846 DPM / 25 μL) = 0,724 μL
   [³H] DPM_ECS: 0,724 μL × (39814 DPM / 25 μL) = 1153 DPM
   [³H] DPM_ICS: 4467 DPM - 1153 DPM = 3314 DPM
   Absorción de glucosa: ((3314 DPM / (39814 DPM / 25 μL) / 1 mmol / L) / 0.396 mg de proteína) / (1/6 hora) = 31.53 μmol / g de proteína / hora

9. Análisis SDS-PAGE y western blot

1. Preparar lisados musculares sóleo y EDL en tampón Laemmli y calentar durante 5 min a 96 °C.
2. Separe cantidades iguales de proteína muscular por SDS-PAGE en geles auto-fundidos y transfiera las proteínas a las membranas de fluoruro de polivinilideno por sequedad semidry.
3. Posteriormente, incubar membranas en solución salina tamponada con Tris que contenga 0,05% de tween 20 y 2% de leche descremada y sondear membranas con anticuerpos primarios y secundarios relevantes.
4. Detectar proteínas con quimioluminiscencia y visualizarlas mediante un sistema de imagen digital.

10. Glucógeno muscular, nucleótidos, lactato, creatina y fosfocreatina

1. Use ácido perclórico para extraer muestras de EDL y músculo sóleo.
2. Posteriormente, neutralice las muestras y analícelas en busca de lactato, creatina y fosfocreatina como se describió anteriormente¹⁸.
3. Analizar el contenido de nucleótidos en EDL y músculo sóleo mediante HPLC de fase inversa después de la extracción en ácido perclórico.
4. Determinar el contenido de glucógeno muscular en el homogeneizado de todo el músculo como unidades de glicosilo después de la hidrólisis ácida por un método fluorométrico como se describió anteriormente¹⁸.

11. Estadísticas

1. Realizar análisis estadísticos con software de análisis estadísticos.
2. Utilice una prueba de análisis bidireccional de varianza (ANOVA) para evaluar las diferencias estadísticas entre los valores presentados en la Tabla 1.
3. Utilice pruebas t de Student no emparejadas para evaluar las diferencias estadísticas en la absorción de glucosa entre EDL y soleus dentro de cada grupo presentado en la Figura 2. Presentar los datos como medias ± error estándar de la media (SEM). P < 0,05 se considera estadísticamente significativo.

Resultados

Como se muestra en la Figura 2, las tasas de absorción de glucosa basal fueron similares entre el sóleo aislado y el músculo EDL de ratones hembra. Esto también se ha reportado varias veces antes^de 12,13,19,20. La absorción de glucosa aumentó en ~ 0.8 y ~ 0.6 veces alcanzando 12 y 9 μmol / g de proteína / h en el músculo s?...

Discusión

La regulación intacta de la absorción de glucosa en el músculo esquelético es importante para preservar la salud general¹. Por lo tanto, la investigación de la absorción de glucosa muscular a menudo sirve como una lectura primaria al evaluar varias intervenciones que alteran la salud. Aquí describimos un método ex vivo para medir la absorción de glucosa en el músculo sóleo y EDL aislado e incubado de ratones en respuesta a la insulina y las contracciones inducidas eléctricamente. El m?...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
[14C]D-mannitol	American Radiolabeled Chemicals, Inc.	ARC 0127
[3H]2-deoxy-D-glucose	American Radiolabeled Chemicals, Inc.	ART 0103A
2-Deoxy-D-glucose	Sigma	D8375
4-0 USP non-sterile surgical nylon suture	Harvard Apparatus	51-7698
Streptavidin/HRP (Conjugate)	DAKO	P0397	Used to detect ACC protein
Akt2 antibody	Cell Signaling	3063
AMPKα2 antibody	Santa Cruz	SC-19131
aprotinin	Sigma	A1153
benzamidine	Sigma	B6505
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A7030
CaCl2	Merck	1020831000
Calibration kit (force)	Danish Myo Technology A/S	300041
Chemiluminescence	Millipore	WBLUF0500
D-Glucose	Merck	1084180100
D-Mannitol	Sigma	M4125
Data collection program	National Instruments	LabVIEW software version 7.1
Dialysis tubing	Visking	DTV.12000.09 Size No.9
Digital imaging system	BioRad	ChemiDoc MP
EDTA	Sigma EDS	E9884
EGTA	Sigma	E4378
Electrical Pulse Stimulator	Digitimer	D330 MultiStim System
Glycerol	Sigma	G7757
HEPES	Sigma	H7637
IGEPAL CA-630	Sigma	I8896
Insulin	Novo Nordisk	Actrapid, 100 IE/mL
KCl	Merck	1049361000
KH2PO4	Merck	104873025
leupeptin	Sigma	L2884
MgSO4	Merck	1058860500
Muscle Strip Myograph System	Danish Myo Technology A/S	Model 820MS
Na-Orthovanadate	Sigma	S6508
Na-Pyrophosphate	Sigma	221368
Na-Pyruvate	Sigma	P2256
NaCl	Merck	106041000
NaF	Sigma	S1504
NaHCO3	VWR	27778260
pACC Ser212 antibody	Cell Signaling	3661
pAkt Thr308 antibody	Cell Signaling	9275
pAMPK Thr172 antibody	Cell Signaling	2531
phenylmethylsulfonylfluoride	Sigma	P7626
Platinum electrodes	Danish Myo Technology A/S	300145
pTBC1D4 Ser588 antibody	Cell Signaling	8730
Scintillation counter	Perkin Elmer	Tri-Carb-2910TR
Scintillation fluid	Perkin Elmer	6013329
Statistical analyses software	Systat	SigmaPlot version 14
TBC1D4 antibody	Abcam	ab189890
TissueLyser II	Qiagen	85300
Ultrapure water	Merck	Milli-Q Reference A+ System
β-glycerophosphate	Sigma	G9422