Misurazione dell'assorbimento di glucosio stimolato da insulina e contrazione in muscolo scheletrico maturo isolato e incubato da topi

Riepilogo

La regolazione intatta dell'assorbimento del glucosio muscolare è importante per mantenere l'omeostasi del glucosio in tutto il corpo. Questo protocollo presenta la valutazione dell'assorbimento di glucosio stimolato dall'insulina e dalla contrazione nel muscolo scheletrico maturo isolato e incubato quando delinea l'impatto di vari interventi fisiologici sul metabolismo del glucosio di tutto il corpo.

Abstract

Il muscolo scheletrico è un tessuto insulino-responsivo e in genere assorbe la maggior parte del glucosio che entra nel sangue dopo un pasto. Inoltre, è stato riportato che il muscolo scheletrico può aumentare l'estrazione di glucosio dal sangue fino a 50 volte durante l'esercizio rispetto alle condizioni di riposo. L'aumento dell'assorbimento del glucosio muscolare durante l'esercizio fisico e la stimolazione dell'insulina dipende dalla traslocazione del trasportatore di glucosio 4 (GLUT4) dai compartimenti intracellulari alla membrana della superficie delle cellule muscolari, nonché dalla fosforilazione del glucosio in glucosio-6-fosfato da parte dell'esochinasi II. L'isolamento e l'incubazione di muscoli di topo come m. soleus e m. extensor digitorum longus (EDL) è un modello ex vivo appropriato per studiare gli effetti dell'insulina e della contrazione indotta elettricamente (un modello per l'esercizio) sull'assorbimento del glucosio nel muscolo scheletrico maturo. Pertanto, il modello ex vivo consente la valutazione della sensibilità all'insulina muscolare e consente di abbinare la produzione di forza muscolare durante la contrazione garantendo un reclutamento uniforme delle fibre muscolari durante le misurazioni dell'assorbimento del glucosio muscolare. Inoltre, il modello descritto è adatto per i test farmacologici dei composti che possono avere un impatto sulla sensibilità all'insulina muscolare o possono essere di aiuto quando si cerca di delineare la complessità regolatoria dell'assorbimento del glucosio nel muscolo scheletrico.

Qui descriviamo e forniamo un protocollo dettagliato su come misurare l'assorbimento di glucosio stimolato dall'insulina e dalla contrazione in preparati muscolari isolati e incubati di soleo ed EDL da topi usando radiomarcato [³H]2-deossi-D-glucosio e [¹⁴C]mannitolo come marcatore extracellulare. Ciò consente una valutazione accurata dell'assorbimento di glucosio nel muscolo scheletrico maturo in assenza di fattori confondenti che possono interferire nel modello animale intatto. Inoltre, forniamo informazioni sulla vitalità metabolica del muscolo scheletrico del topo incubato suggerendo che il metodo applicato possiede alcuni avvertimenti in determinate condizioni quando si studia il metabolismo energetico muscolare.

Introduzione

Il muscolo scheletrico possiede la capacità di estrarre grandi quantità di glucosio dallo spazio extracellulare in risposta all'insulina e all'esercizio fisico. Questo aiuta a mantenere l'omeostasi del glucosio in tutto il corpo e assicura l'approvvigionamento di glucosio durante i periodi di elevata domanda di energia. Poiché la regolazione intatta dell'assorbimento del glucosio nei muscoli scheletrici ha dimostrato di essere importante per la salute generale e le prestazioni fisiche ^1,2, le misurazioni dell'assorbimento del glucosio muscolare durante varie condizioni hanno ricevuto molta attenzione. Nell'uomo e negli animali, il morsetto iperinsulinemico-euglicemico è stato utilizzato come tecnica gold standard per valutare la sensibilità all'insulina in vivo ^3,4. In contrasto con i risultati ottenuti da un test di tolleranza al glucosio orale, la tecnica del morsetto iperinsulinemico-euglycemic non richiede una funzione gastrointestinale intatta o la secrezione di insulina dal pancreas e consente quindi di confrontare le risposte insuliniche tra soggetti che presentano variazioni nella funzione gastro-intestinale e/o pancreatica. Le misurazioni dell'assorbimento di glucosio muscolare in vivo durante l'esercizio negli esseri umani sono state eseguite frequentemente dal 1960⁵. Prima con l'uso di tecniche di equilibrio artero-venoso⁶ e successivamente con l'uso della tomografia ad emissione di positroni (PET) in combinazione con un analogo del glucosio che emette positroni, ad esempio ¹⁸F-Fluoro-deossi-glucosio⁷. Nei roditori, l'assorbimento di glucosio muscolare stimolato dall'esercizio in vivo viene tipicamente eseguito mediante l'uso di analoghi del glucosio radioattivi o isotopici stabili ^8,9,10.

Un metodo complementare alle misurazioni dell'assorbimento muscolare di glucosio in vivo consiste nell'isolare e incubare piccoli muscoli dai roditori e successivamente misurare l'assorbimento del glucosio utilizzando analoghi del glucosio radioattivi o stabili marcati con isotopi 11,12,13. Questo metodo consente una quantificazione accurata e affidabile dei tassi di assorbimento del glucosio nel muscolo scheletrico maturo e può essere eseguito in presenza di varie concentrazioni di insulina e durante la contrazione suscitata dalla stimolazione elettrica. Ancora più importante, le misurazioni dell'assorbimento di glucosio nel muscolo scheletrico isolato e incubato sono rilevanti quando si studia il fenotipo metabolico muscolare di topi che hanno subito vari interventi (ad esempio nutrizione, attività fisica, infezioni, terapie). Il modello di muscolo scheletrico isolato è anche uno strumento adatto per i test farmacologici dei composti che possono influenzare l'assorbimento del glucosio di per sé e / o modificare la sensibilità all'insulina^12,14. In questo modo, l'efficacia dei composti progettati per regolare il metabolismo del glucosio muscolare può essere testata e valutata in un ambiente altamente controllato prima di successivi test in vivo in modelli animali pre-clinici.

In alcune condizioni, la vitalità metabolica può rappresentare una sfida nel sistema modello muscolare scheletrico isolato e incubato. Infatti, la mancanza di un sistema circolatorio nei muscoli incubati comporta che l'erogazione di substrati (ad esempio ossigeno e sostanze nutritive) dipenda completamente dalla semplice diffusione tra le fibre muscolari e l'ambiente circostante. A questo proposito, è importante che i muscoli incubati siano piccoli e sottili e quindi rappresentino meno di una barriera per la diffusione dell'ossigeno durante l'incubazione¹⁵. Soprattutto durante le incubazioni prolungate per diverse ore, possono svilupparsi stati ipossici a causa di un insufficiente apporto di ossigeno con conseguente esaurimento dell'energia muscolare¹⁵. Sebbene in precedenza siano stati riportati vari marcatori di vitalità metabolica nel muscolo di ratto incubato insieme all'identificazione di importanti variabili che aiutano a mantenere la vitalità muscolare del ratto¹⁵, una valutazione completa della vitalità metabolica nei piccoli muscoli di topo incubati è ancora giustificata. Quindi, allo stato attuale, il contenuto di glicogeno è stato utilizzato principalmente come marcatore di vitalità metabolica nel muscolo scheletrico del topo incubato^16,17.

Qui descriviamo un protocollo dettagliato per misurare l'assorbimento di glucosio basale, insulino-stimolato e contrazione nel soleo isolato e incubato e nel muscolo EDL dai topi usando il [³H]2-deossi-D-glucosio radiomarcato e [¹⁴C]mannitolo come marcatore extracellulare. Nel presente studio, l'assorbimento di glucosio è stato misurato durante un periodo di 10 minuti e il metodo è presentato con l'uso di concentrazioni di insulina submassimili e massimamente efficaci, nonché un singolo protocollo di contrazione. Tuttavia, i protocolli qui descritti possono essere facilmente modificati per quanto riguarda il tempo di incubazione, il dosaggio dell'insulina e il protocollo di stimolazione elettrica. Inoltre, forniamo una caratterizzazione approfondita di vari marcatori di vitalità metabolica nel soleo incubato e nel muscolo di topo EDL. I risultati indicano che l'integrazione di glucosio nel tampone di incubazione è essenziale per preservare la vitalità metabolica del muscolo incubato per 1 ora.

Protocollo

Le procedure che coinvolgono animali da ricerca dovrebbero essere eseguite in conformità con le linee guida pertinenti e la legislazione locale. Tutti gli esperimenti sugli animali utilizzati per questo studio sono conformi alla Convenzione europea per la protezione degli animali vertebrati utilizzati a fini sperimentali e ad altri scopi scientifici e sono stati approvati dall'Ispettorato danese degli esperimenti sugli animali.

1. Preparazione dell'apparato sperimentale e dei circuiti di sutura

NOTA: Per questo studio, utilizzare un sistema miografico a striscia muscolare integrato con ganci di incubazione personalizzati per incubare i muscoli scheletrici isolati del topo (Figura 1). Questo sistema permette al muscolo di fare il bagno in una soluzione fisiologica con ossigenazione continua (95% O₂ e 5% CO₂) e a temperatura costante. Il bagno del tessuto muscolare è accoppiato ad un trasduttore di forza per la misurazione della produzione di forza muscolare durante la contrazione. Per suscitare e registrare le risposte mio-meccaniche durante la contrazione, utilizzare rispettivamente uno stimolatore di impulsi elettrico e un programma di raccolta dati. Stimolare i muscoli incubati a contrarsi con elettrodi di platino posizionati centralmente e su entrambi i lati del muscolo.

1. Accendere il sistema miografico e riscaldare le camere a 30 °C. Software di raccolta dati aperto compatibile con il sistema miografico e calibrare i trasduttori di forza per garantire la comparabilità tra i set di dati.
2. Inizia tagliando fili di ~ 16 cm di sutura chirurgica in nylon non assorbibile. Utilizzare una pinza per creare un anello di circa 0,4 cm di diametro da un singolo filo. Ripeti questa operazione fino a quando non sono stati prodotti abbastanza loop. Ogni muscolo ha bisogno di due anelli: uno per il prossimo e uno per il tendine distale.

2. Preparazione di soluzioni e mezzi di incubazione

1. Preparazione dei mezzi di incubazione basale
   1. Preparare le seguenti soluzioni madre: cloruro di sodio 2,5 M (NaCl, 250 mL), bicarbonato di sodio 0,5 M (NaHCO₃, 250 mL), cloruro di potassio 0,5 M (KCl, 50 mL), cloruro di calcio 0,25 M (CaCl₂, 50 mL), 0,25 M fosfato di diidrogeno di potassio (KH₂PO₄, 50 mL), solfato di magnesio 0,25 M (MgSO₄, 50 mL), piruvato di sodio 110 mM (Na-piruvato, 100 mL), 500 mM di D-mannitolo (100 mL), 1 M 2-deossi-D-glucosio (4 mL), soluzione al 15% di albumina sierica bovina (BSA) dializzata contro il tampone Krebs-Ringer-Henseleit (KRH) (descritto di seguito nella fase 4) (100 mL).
      NOTA: sono necessarie due soluzioni per misurare l'assorbimento di glucosio a riposo e stimolato dalla contrazione. Inoltre, ogni singola concentrazione di insulina utilizzata per valutare l'assorbimento di glucosio stimolato dall'insulina richiede due soluzioni. Pertanto, in totale sono necessarie sei diverse soluzioni per misurare l'assorbimento basale, submassimale di insulina, insulina massimale e glucosio stimolato dalla contrazione nel muscolo scheletrico di topo isolato. Di seguito, "mezzi di incubazione basale" si riferisce a mezzi senza insulina o traccianti radioattivi. "Mezzi di incubazione" si riferisce a mezzi contenenti insulina. Per «mezzi di incubazione per assorbimento del glucosio» si intendono i mezzi contenenti 2-deossi-D-glucosio e traccianti radioattivi oltre all'insulina ad una concentrazione identica a quella utilizzata nei «mezzi di incubazione».
   2. Preparare un tampone KRH integrando acqua ultrapura (ddH₂O) con NaCl (117 mM), NaHCO₃ (24,6 mM), KCl (4,7 mM), CaCl₂ (2,5 mM), KH₂PO₄ (1,2 mM) e MgSO₄ (1,2 mM). Successivamente, gasare il tampone KRH con il 95% O₂ e il 5% di CO₂ per almeno 10 min. Il pH desiderato del tampone KRH deve essere compreso tra 7,35-7,45 a 30 °C. Se la regolazione del pH viene eseguita a temperatura ambiente, il pH del tampone KRH deve essere compreso tra 7,25 e 7,35.
   3. Aggiungere BSA (0,1%), Na-piruvato (2 mM) e D-mannitolo (8 mM) al tampone KRH gassato e regolato a pH per completare il mezzo di incubazione basale. Conservare i mezzi di incubazione basale in un contenitore sigillato per ridurre al minimo la degassificazione di O₂ e CO₂ e posizionare i mezzi a 30 °C.
      NOTA: Tipicamente, l'osmolarità degli integratori KRH (cioè Na-piruvato, D-mannitolo e D-glucosio) viene mantenuta costante in un intero esperimento per evitare il restringimento o l'espansione delle cellule muscolari. Il protocollo qui descritto utilizza un'osmolarità di 10 mM per gli integratori KRH. Se è necessario un tampone contenente glucosio, sostituire gli integratori krH per soddisfare le esigenze, ad esempio 5 mM di D-glucosio e 5 mM di D-mannitolo.
   4. Per evitare possibili contaminanti associati a BSA nel tampone di incubazione, dializzare BSA contro KRH.
      1. Per realizzare una soluzione madre BSA al 15% dializzata contro il tampone KRH, iniziare sciogliendo 300 g di BSA senza grassi di grado analitico in 900 mL di tampone KRH. Quindi, far bollire il tubo di dialisi in acqua ridistillata fino a quando il tubo è morbido.
      2. Riempire il tubo con la soluzione BSA-KRH e fissare le estremità del tubo. Posizionare il tubo con BSA-KRH in 5 L di tampone KRH e lasciarlo per una notte a 4 °C. Il giorno seguente sostituire il tampone KRH e lasciare il tubo con BSA-KRH nel tampone KRH durante la notte a 4 °C.
      3. Infine, raccogliere la soluzione BSA-KRH dal tubo e aggiungere il tampone KRH a un volume finale di 2 L (cioè soluzione madre BSA-KRH al 15%). Dividere la soluzione madre BSA-KRH al 15% in aliquote e conservare in congelatore a ~-20 °C.
2. Preparazione di mezzi di incubazione contenenti insulina
   1. Per i mezzi di incubazione contenenti una concentrazione di insulina submutilmente efficace, aggiungere 1 μL di una soluzione madre insulinica da 100 mU/mL per mL di mezzo di incubazione basale (100 μU/mL di insulina).
   2. Per i mezzi di incubazione contenenti una concentrazione massima di insulina efficace, aggiungere 1 μL di una soluzione madre di insulina da 10 U/mL per mL di mezzo di incubazione basale (10 mU/mL di insulina).
3. Preparazione dei mezzi di incubazione dell'assorbimento del glucosio
   ATTENZIONE: La manipolazione di materiale radioattivo è consentita solo in un'area ristretta e controllata da personale autorizzato e alcune università, istituti di ricerca e aziende potrebbero richiedere l'acquisizione di un "Permesso di uso radioattivo". Il materiale e i rifiuti devono essere gestiti secondo procedure, linee guida e legislazioni locali appropriate.
   1. Seguire la stessa procedura descritta al punto 2.1.2.
   2. Aggiungere BSA (0,1%), Na-piruvato (2 mM), D-mannitolo (7 mM) e 2-deossi-D-glucosio (1 mM) al tampone KRH gassato e regolato a pH.
   3. Aggiungere [³H]2-deossi-D-glucosio (0,028 MBq/mL) e [¹⁴C]mannitolo (0,0083 MBq/mL) al tampone KRH integrato per completare il mezzo di incubazione dell'assorbimento del glucosio. Conservare a 30 °C. Se [³H]2-deossi-D-glucosio e [¹⁴C]mannitolo sono disciolti in etanolo, rimuovere l'etanolo mediante evaporazione mediata da N₂ prima dell'uso.
   4. Per il mezzo di incubazione dell'assorbimento del glucosio contenente una concentrazione di insulina submaximalmente efficace, aggiungere 1 μL di una soluzione madre di insulina da 100 mU/mL per mL di mezzo di incubazione dell'assorbimento del glucosio (100 μU/mL di insulina).
   5. Per il mezzo di incubazione dell'assorbimento del glucosio contenente una concentrazione di insulina massimamente efficace, aggiungere 1 μL di una soluzione madre di insulina da 10 U/mL per mL di mezzo di incubazione dell'assorbimento del glucosio (10 mU/mL di insulina).

3. Animali e dissezione del soleo di topo e del muscolo EDL per l'incubazione

NOTA: le procedure che coinvolgono animali da ricerca devono essere eseguite in conformità con le linee guida pertinenti e la legislazione locale. La procedura descritta può essere utilizzata con topi maschi e femmine allevati internamente o disponibili in commercio di vari ceppi e background genetici. La seguente procedura è prevista per topi femmina C57Bl/6J alimentati. In media, i topi avevano 19 settimane e pesavano 25 g. I topi sono stati mantenuti su un ciclo luce-buio di 12:12 h con libero accesso al chow e all'acqua dei roditori standard. Gli esperimenti sugli animali sono stati avviati alle ~ 9:00 AM ora locale e tutti gli animali sono stati sacrificati entro un periodo di 2 ore.

1. Aggiungere 4 mL di mezzi di incubazione basali preriscaldati (30 °C) a ciascuna camera di incubazione e assicurarsi che il mezzo di incubazione basale sia continuamente ossigenato con il 95% di O₂ e il 5% di CO₂.
2. Anestetizzare i topi con un'iniezione intraperitoneale di pentobarbital (10 mg/100 g di peso corporeo) o altra anestesia disponibile (ad es. tribromoetanolo).
   NOTA: Essere consapevoli del fatto che in alcuni paesi può essere richiesta una licenza per maneggiare pentobarbital e altri farmaci anestetici. Prima che la dissezione muscolare possa essere iniziata, l'anestesia di ciascun animale deve essere indotta correttamente. Per garantire questo, vengono testati i riflessi della coda e delle gambe. Per risultati ottimali la dissezione dovrebbe essere ben praticata per evitare di danneggiare i muscoli durante la rimozione.
3. Posizionare topi anestetizzati inclini su un vassoio di dissezione (ad esempio coperchio in polistirolo) e appuntare le zampe anteriori e posteriori, se necessario, usando un ago.
4. Rimuovere la pelle dalla parte inferiore della gamba e assicurarsi che sia il tendine di Achille che l'articolazione del ginocchio siano visibili.
   1. Per la dissezione del muscolo soleo, iniziare attaccando un singolo anello di sutura al tendine di Achille. Fissare una pinza peana al tendine di Achille distalmente dell'ansa di sutura e tagliare per rilasciare i muscoli soleo e gastrocnemio dalla zampa. Far scorrere con attenzione la pinza pean attraverso il mouse esponendo così il muscolo soleo.
   2. Fissare la pinza pean e posizionare un secondo anello di sutura attorno al tendine prossimale del muscolo soleo. Quindi, tagliare il tendine prossimale e sezionare il soleo (compresi i due anelli di sutura attaccati) privo di muscolo gastrocnemio. Posizionare rapidamente il muscolo soleo nella camera di incubazione attaccando ogni anello di sutura ai rispettivi ganci.
5. Rimuovere la fascia che copre il m. tibialis anteriore (TA) usando una pinza. Se fatto correttamente, i tendini distali dei muscoli TA ed EDL dovrebbero essere chiari bianchi e visibili; e separati l'uno dall'altro.
6. Tagliare il tendine distale del muscolo TA e sezionare il muscolo per analisi successive (ad es. genotipizzazione). Usando la pinza, libera delicatamente il muscolo EDL dai tessuti circostanti, ma lascia intatto il muscolo e non tagliare i tendini. Posizionare un anello di sutura attorno al tendine distale e un secondo anello di sutura attorno al tendine prossimale dell'EDL.
7. Quindi, tagliare i tendini rilasciando il muscolo EDL con due anelli di sutura attaccati e posizionare rapidamente il muscolo nella camera di incubazione attaccando ogni anello di sutura ai rispettivi ganci. Per non perdere tensione durante l'incubazione e soprattutto durante la contrazione indotta elettricamente dei muscoli soleo ed EDL, è di grande importanza fissare gli anelli di sutura attorno ai tendini con nodi stretti.
8. Infine, l'eutanasia dell'animale ad esempio con lussazione cervicale.
9. Quando i muscoli sono stati sezionati e collocati in camere di incubazione, regolare la tensione di riposo di ciascun muscolo a ~ 5 mN e pre-incubare i muscoli per almeno 10 minuti prima di iniziare il protocollo sperimentale.

4. Assorbimento di glucosio stimolato dall'insulina nel muscolo scheletrico isolato del topo

1. Seguendo la fase 3.9 sostituire il mezzo di incubazione basale con mezzi di incubazione non contenenti insulina (mezzi di incubazione basale), una concentrazione di insulina efficace sulmidale o una concentrazione di insulina massimamente efficace e lasciare nelle camere di incubazione per 20 minuti. Distanziare ogni camera di incubazione di 1 minuto, creando così il tempo per la successiva raccolta dei muscoli.
2. Alla fine del periodo di stimolazione di 20 minuti, sostituire il mezzo di incubazione con il mezzo di incubazione dell'assorbimento del glucosio contenente un'identica concentrazione di insulina e lasciare nelle camere di incubazione per 10 minuti, sempre con una distanza di 1 minuto tra ciascuna camera di incubazione.
3. Dopo 10 minuti di incubazione nel mezzo di incubazione dell'assorbimento del glucosio rimuovere delicatamente i muscoli dalle camere di incubazione e lavarli in mezzi di incubazione basale ghiacciati. Successivamente, asciugare rapidamente i muscoli su carta da filtro prima che i loop di sutura vengano rimossi e i muscoli congelati in azoto liquido. È imperativo che i muscoli incubati vengano raccolti rapidamente se si desidera anche studiare vari metaboliti intracellulari e la segnalazione proteica oltre all'assorbimento del glucosio.
4. Raccogliere 100 μL del mezzo di incubazione dell'assorbimento del glucosio da ciascuna camera di incubazione e conservarlo a -20 °C. La quantità di radioattività in questi campioni sarà inclusa nel calcolo dell'assorbimento del glucosio muscolare.

5. Assorbimento di glucosio stimolato dalla contrazione nel muscolo scheletrico isolato del topo

NOTA: Per indurre la contrazione del muscolo scheletrico isolato del topo utilizzare il seguente protocollo: 1 treno/15 s, ogni treno lungo 1 s costituito da impulsi di 0,2 ms erogati a 100 Hz. Tuttavia, anche altri protocolli simili che suscitano la contrazione del muscolo scheletrico isolato del topo probabilmente funzioneranno. È importante sottolineare che la tensione deve essere regolata per generare lo sviluppo della forza massima del muscolo incubato, che dipende dalla configurazione sperimentale. Se questo non è garantito, si può rischiare che non tutte le fibre del muscolo si contraggano. A sua volta, ciò può indurre distorsioni nel set di dati.

1. Seguendo il passaggio 3.9 posizionare gli elettrodi di platino centralmente e su entrambi i lati dei muscoli. Iniziare la contrazione dei muscoli immediatamente dopo aver sostituito il mezzo di incubazione basale con il mezzo di incubazione dell'assorbimento del glucosio. Se possibile, distanziare ogni camera di incubazione di 1 minuto, creando così il tempo per la successiva raccolta dei muscoli. Ricorda di registrare la produzione di forza da ciascun muscolo incubato.
2. Dopo 10 minuti di contrazione nel mezzo di incubazione dell'assorbimento del glucosio, rimuovere gli elettrodi di platino, raccogliere delicatamente i muscoli dalle camere di incubazione e lavarli in mezzi di incubazione basale ghiacciati. Successivamente, asciugare rapidamente i muscoli su carta da filtro prima che i loop di sutura vengano rimossi e i muscoli congelati in azoto liquido. L'intera procedura di raccolta muscolare deve essere eseguita il più velocemente possibile.
3. Raccogliere 100 μL del mezzo di incubazione dell'assorbimento del glucosio da ciascuna camera di incubazione e conservarlo a -20 °C. La quantità di radioattività in questi campioni sarà inclusa nel calcolo dell'assorbimento del glucosio muscolare.

6. Omogeneizzazione ed elaborazione del muscolo scheletrico

NOTA: La procedura indicata di seguito per l'omogeneizzazione muscolare consente di determinare sia l'assorbimento del glucosio che la segnalazione miocellulare mediante western blotting nello stesso set di campioni muscolari.

1. Omogeneizzare ogni muscolo in 400 μL di tampone ghiacciato con pH 7,5 contenente 10% glicerolo, 20 mM sodio-pirofosfato, 1% IGEPAL CA-630 (NP-40), 2 mM fenilmetilsulfonifluoruro (disciolto in isopropanolo), 150 mM NaCl, 50 mM HEPES, 20 mM β-glicerofosfato, 10 mM fluoruro di sodio (NaF), 1 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 1 mM di acido glicoleterdiaminatetraacetico (EGTA), 10 μg/ml di aprotinina, 10 μg/mL di leupeptina, 3 mM di benzamidina e 2mM di sodio-ortovanadato utilizzando perline di acciaio e un listalizzatore (2 x 45 s a 30 Hz). Ruotare tutti gli omogeneizzati end-over-end per 1 ora a 4 °C dopodiché vengono centrifugati a 16.000 x g per 20 min a 4 °C. Raccogliere il lisato (surnatante) che viene utilizzato per determinare l'assorbimento del glucosio muscolare.

7. Determinazione del 2-desossiglucosio e del mannitolo radiomarcati

1. Aggiungere 150 μL di ciascun lisato muscolare e 25 μL del mezzo di incubazione dell'assorbimento del glucosio da ciascuna camera di incubazione per separare i flaconcini di conteggio a scintillazione liquida contenenti 2 mL di liquido di scintillazione liquida. Inoltre, preparare due flaconcini di controllo ciechi contenenti solo 3 ml di liquido a scintillazione liquida. Chiudere tutti i flaconcini e mescolare accuratamente vorticosamente ogni flaconcino per ~5 s.
2. Posizionare i flaconcini in un contatore di scintillazione liquida e misurare la radioattività di [³H]2-deossi-D-glucosio e [¹⁴C]mannitolo secondo le linee guida del produttore. Registrare DPM (disintegrazioni al minuto) per ogni flaconcino di scintillazione liquida.

8. Calcolo dei tassi di assorbimento del glucosio muscolare

1. Utilizzare il lisato dal punto 6.1 per misurare la concentrazione totale di proteine in ciascun campione muscolare utilizzando metodi standard di quantificazione delle proteine (ad esempio, acido bicinchoninico o saggi di Bradford). Calcolare la quantità di proteine (mg) aggiunte a ciascun flaconcino di scintillazione.
   NOTA: Il tasso di assorbimento del glucosio per ciascun campione muscolare viene calcolato sottraendo la quantità di [³H]2-deossi-D-glucosio situata nello spazio extracellulare dalla quantità totale di [³H]2-deossi-D-glucosio nel campione muscolare utilizzando [¹⁴C]mannitolo come marcatore extracellulare. Si presume che [³H]2-deossi-D-glucosio e [¹⁴C]mannitolo mostrino proprietà di diffusione simili all'interno del tessuto muscolare durante l'incubazione. Eseguire i calcoli seguenti:
2. Inizia sottraendo il DPM [³H] e [¹⁴C] dei campioni di controllo cieco da tutti i campioni muscolari e mediali.
3. Determinare lo spazio extracellulare muscolare in μL (μL-ECS):
   [¹⁴C] Muscolo_{DPM /} ([¹⁴C]DPM_media / M_vol)
4. Calcolare la quantità di [³H]DPM nello spazio extracellulare muscolare ([³H]DPM_ECS):
   μL-ECS × ([³H]DPM_media / M_vol)
5. Calcolare la quantità di [³H]DPM nello spazio intracellulare muscolare ([³H]DPM_ICS):
   [³ore] Muscolo_DPM− [³H]DPM_ECS
6. Calcola il tasso di assorbimento del glucosio muscolare (μmol / g di proteine / ora):
   [³ore] DPM_ICS / ([³H]DPM_media / M_vol) / [2-deossi-D-glucosio])) / mg di proteine) / T_h
   NOTA: per tutte le equazioni di cui sopra,
   [¹⁴C] Il_muscolo DPM è la quantità di radioattività [¹⁴C]mannitolo in un campione muscolare;
   [¹⁴C] Il supporto_{DPM è} la quantità di radioattività di [¹⁴C]mannitolo in un campione di supporto;
   [³ore] Il_muscolo DPM è la quantità di radioattività [³H]2-deossi-D-glucosio in un campione muscolare;
   [³ore] Il mezzo_{DPM è}la quantità di radioattività [³H]2-deossi-D-glucosio in un campione di media;
   [³ore] DPM_ECS è la quantità di radioattività [³H]2-deossi-D-glucosio nello spazio extracellulare muscolare;
   [³ore] DPM_ICS è la quantità di radioattività [³H]2-deossi-D-glucosio nello spazio intracellulare muscolare;
   μL-ECS è lo spazio extracellulare muscolare in μL;
   M_vol è il volume (μL) dei mezzi di incubazione utilizzati per il conteggio della scintillazione (ad esempio '25' come menzionato sopra);
   T_h è il fattore temporale utilizzato per calcolare i tassi di assorbimento all'ora (cioè "1/6" quando si incubano i muscoli con mezzi di assorbimento del glucosio per 10 minuti)
7. Prendi in considerazione questo esempio di calcolo. Il DPM [³H] e [¹⁴C] dei campioni di controllo ciechi (rispettivamente 17 e 6) sono stati sottratti dai valori DPM indicati di seguito.
   [¹⁴C] Muscolo_DPM: 343
   [¹⁴C] Supporti DPM: 11846
   [³ore] Muscolo_DPM: 4467
   [³ore] Supporti DPM: 39814
   M_vol: 25
   mg di proteine: 0,396 (in 150 μL di lisato proteico muscolare)
   [2-deossi-D-glucosio]: 1 (mM)
   T_h: 1/6 (h)
   μL-ECS = 343 DPM / (11846 DPM / 25 μL) = 0,724 μL
   [³ore] DPM_ECS: 0,724 μL × (39814 DPM / 25 μL) = 1153 DPM
   [³ore] DPM_ICS: 4467 DPM - 1153 DPM = 3314 DPM
   Assorbimento di glucosio: ((3314 DPM / (39814 DPM / 25 μL) / 1 mmol / L) / 0,396 mg di proteine) / (1/6 ora) = 31,53 μmol / g di proteine / ora

9. Analisi SDS-PAGE e Western Blot

1. Preparare i lisati muscolari soleus ed EDL in tampone Laemmli e riscaldare per 5 minuti a 96 °C.
2. Separare quantità uguali di proteine muscolari da SDS-PAGE su gel auto-colati e trasferire le proteine alle membrane di fluoruro di polivinilidene mediante semidry blotting.
3. Successivamente, incubare membrane in soluzione salina tamponata tris contenente lo 0,05% di latte scremato Tween 20 e il 2% e membrane sonda con anticorpi primari e secondari rilevanti.
4. Rileva le proteine con chemiluminescenza e visualizzale tramite un sistema di imaging digitale.

10. Glicogeno muscolare, nucleotidi, lattato, creatina e fosfocreatina

1. Utilizzare l'acido perclorico per estrarre campioni di EDL e muscoli soleus.
2. Successivamente, neutralizzare i campioni e analizzarli per lattato, creatina e fosfocreatina come precedentemente descritto¹⁸.
3. Analizzare il contenuto di nucleotidi nell'EDL e nel muscolo soleo mediante HPLC in fase inversa dopo l'estrazione in acido perclorico.
4. Determinare il contenuto di glicogeno muscolare nell'omogeneizzato muscolare intero come unità glicosiliche dopo idrolisi acida con un metodo fluorometrico come descritto in precedenza¹⁸.

11. Statistiche

1. Esegui analisi statistiche con software di analisi statistiche.
2. Utilizzare un test ANOVA (Double-Way Analysis of Variance) per valutare le differenze statistiche tra i valori presentati nella Tabella 1.
3. Utilizzare test Student t non accoppiati per valutare le differenze statistiche nell'assorbimento di glucosio tra EDL e soleo all'interno di ciascun gruppo presentato nella Figura 2. Presentare i dati come mezzi ± errore standard della media (SEM). P < 0,05 è considerato statisticamente significativo.

Risultati

Come mostrato nella Figura 2, i tassi di assorbimento basale del glucosio erano simili tra soleo isolato e muscolo EDL di topi femmina. Questo è stato anche riportato più volte prima di 12,13,19,20. L'assorbimento di glucosio è aumentato di ~ 0,8 e ~ 0,6 volte raggiungendo 12 e 9 μmol / g di proteine / h nel soleo e nel muscolo ...

Discussione

La regolazione intatta dell'assorbimento del glucosio nel muscolo scheletrico è importante per preservare la salute generale¹. Pertanto, l'indagine sull'assorbimento del glucosio muscolare spesso funge da lettura primaria quando si valutano vari interventi che alterano la salute. Qui descriviamo un metodo ex vivo per misurare l'assorbimento di glucosio nel soleo isolato e incubato e nel muscolo EDL dai topi in risposta all'insulina e alle contrazioni indotte elettricamente. Il metodo è rapido e ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
[14C]D-mannitol	American Radiolabeled Chemicals, Inc.	ARC 0127
[3H]2-deoxy-D-glucose	American Radiolabeled Chemicals, Inc.	ART 0103A
2-Deoxy-D-glucose	Sigma	D8375
4-0 USP non-sterile surgical nylon suture	Harvard Apparatus	51-7698
Streptavidin/HRP (Conjugate)	DAKO	P0397	Used to detect ACC protein
Akt2 antibody	Cell Signaling	3063
AMPKα2 antibody	Santa Cruz	SC-19131
aprotinin	Sigma	A1153
benzamidine	Sigma	B6505
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A7030
CaCl2	Merck	1020831000
Calibration kit (force)	Danish Myo Technology A/S	300041
Chemiluminescence	Millipore	WBLUF0500
D-Glucose	Merck	1084180100
D-Mannitol	Sigma	M4125
Data collection program	National Instruments	LabVIEW software version 7.1
Dialysis tubing	Visking	DTV.12000.09 Size No.9
Digital imaging system	BioRad	ChemiDoc MP
EDTA	Sigma EDS	E9884
EGTA	Sigma	E4378
Electrical Pulse Stimulator	Digitimer	D330 MultiStim System
Glycerol	Sigma	G7757
HEPES	Sigma	H7637
IGEPAL CA-630	Sigma	I8896
Insulin	Novo Nordisk	Actrapid, 100 IE/mL
KCl	Merck	1049361000
KH2PO4	Merck	104873025
leupeptin	Sigma	L2884
MgSO4	Merck	1058860500
Muscle Strip Myograph System	Danish Myo Technology A/S	Model 820MS
Na-Orthovanadate	Sigma	S6508
Na-Pyrophosphate	Sigma	221368
Na-Pyruvate	Sigma	P2256
NaCl	Merck	106041000
NaF	Sigma	S1504
NaHCO3	VWR	27778260
pACC Ser212 antibody	Cell Signaling	3661
pAkt Thr308 antibody	Cell Signaling	9275
pAMPK Thr172 antibody	Cell Signaling	2531
phenylmethylsulfonylfluoride	Sigma	P7626
Platinum electrodes	Danish Myo Technology A/S	300145
pTBC1D4 Ser588 antibody	Cell Signaling	8730
Scintillation counter	Perkin Elmer	Tri-Carb-2910TR
Scintillation fluid	Perkin Elmer	6013329
Statistical analyses software	Systat	SigmaPlot version 14
TBC1D4 antibody	Abcam	ab189890
TissueLyser II	Qiagen	85300
Ultrapure water	Merck	Milli-Q Reference A+ System
β-glycerophosphate	Sigma	G9422