Farelerden İzole ve İnkübe Olgun İskelet Kasında İnsülin ve Kasılma ile Uyarılmış Glikoz Alımının Ölçülmesi

Özet

Kas glukoz alımının bozulmamış bir şekilde düzenlenmesi, tüm vücut glikoz homeostazını korumak için önemlidir. Bu protokol, çeşitli fizyolojik müdahalelerin tüm vücut glikoz metabolizması üzerindeki etkisini tanımlarken, izole ve inkübe edilmiş olgun iskelet kasında insülin ve kontraksiyonla uyarılmış glikoz alımının değerlendirilmesini sunar.

Özet

İskelet kası insüline duyarlı bir dokudur ve tipik olarak bir yemekten sonra kana giren glikozun çoğunu alır. Ayrıca, iskelet kasının egzersiz sırasında kandan glikoz ekstraksiyonunu dinlenme koşullarına kıyasla 50 kata kadar artırabileceği bildirilmiştir. Egzersiz ve insülin stimülasyonu sırasında kas glukoz alımındaki artış, glikoz taşıyıcı 4'ün (GLUT4) hücre içi bölmelerden kas hücresi yüzey zarına translokasyonuna ve ayrıca glikozun heksokinaz II tarafından glikoz-6-fosfata fosforilasyonuna bağlıdır. M. soleus ve m . extensor digitorum longus (EDL) gibi fare kaslarının izolasyonu ve inkübasyonu, insülin ve elektriksel olarak indüklenen kontraksiyonun (egzersiz için bir model) olgun iskelet kasında glikoz alımı üzerindeki etkilerini incelemek için uygun bir ex vivo modeldir. Böylece, ex vivo model, kas insülin duyarlılığının değerlendirilmesine izin verir ve kas glikoz alımının ölçümleri sırasında kas liflerinin düzgün bir şekilde alınmasını sağlayan kasılma sırasında kas kuvveti üretimini eşleştirmeyi mümkün kılar. Ayrıca, tarif edilen model, kas insülin duyarlılığı üzerinde etkisi olabilecek veya iskelet kası glikoz alımının düzenleyici karmaşıklığını tanımlamaya çalışırken yardımcı olabilecek farmakolojik bileşik testi için uygundur.

Burada, hücre dışı bir belirteç olarak radyoetiketli [³H]2-deoksi-D-glukoz ve [¹⁴C] mannitol kullanılarak farelerden izole edilmiş ve inkübe edilmiş soleus ve EDL kas preparatlarında insülin ve kasılma ile uyarılmış glikoz alımının nasıl ölçüleceğine dair ayrıntılı bir protokol açıklıyor ve sunuyoruz. Bu, olgun iskelet kasındaki glikoz alımının, bozulmamış hayvan modeline müdahale edebilecek kafa karıştırıcı faktörlerin yokluğunda doğru bir şekilde değerlendirilmesini sağlar. Ek olarak, inkübe edilmiş fare iskelet kasının metabolik canlılığı hakkında bilgi veriyoruz, bu da uygulanan yöntemin kas enerjisi metabolizmasını incelerken belirli koşullar altında bazı uyarılara sahip olduğunu düşündürmektedir.

Giriş

İskelet kası, insülin ve egzersize yanıt olarak hücre dışı boşluktan büyük miktarlarda glikoz çıkarma yeteneğine sahiptir. Bu, tüm vücut glikoz homeostazının korunmasına yardımcı olur ve yüksek enerji talebi zamanlarında glikoz arzını güvence altına alır. İskelet kası glukoz alımının bozulmamış bir şekilde düzenlenmesinin genel sağlık ve fiziksel performans için önemli olduğu gösterildiğinden^1,2, çeşitli koşullar sırasında kas glikozu alımının ölçümleri çok dikkat çekmiştir. İnsanlarda ve hayvanlarda, hiperinsülinemik-öglisemik kelepçe, insülin duyarlılığını in vivo ^3,4 değerlendirmek için altın standart teknik olarak kullanılmıştır. Oral glukoz tolerans testinden elde edilen bulguların aksine, hiperinsülinemik-öglisemik kelepçe tekniği sağlam gastrointestinal fonksiyon veya pankreastan insülin sekresyonu gerektirmez ve bu nedenle insülin yanıtlarının gastro-intestinal ve / veya pankreas fonksiyonunda farklılıklar gösteren denekler arasında karşılaştırılmasına izin verir. İnsanlarda egzersiz sırasında in vivo kas glukozu alımının ölçümleri 1960'lardan beri sıklıkla yapılmaktadır⁵. İlk önce arteriyovenöz denge teknikleri⁶ kullanılarak ve daha sonra pozitron emisyon tomografisi (PET) görüntülemenin pozitron yayan glikoz analoğu ile kombinasyon halinde kullanılmasıyla, örneğin ¹⁸F-Floro-deoksi-glukoz⁷. Kemirgenlerde, egzersizle uyarılan kas glukoz alımı in vivo olarak radyoaktif veya stabil izotop etiketli glikoz analogları ^8,9,10 kullanılarak gerçekleştirilir.

Kas glukoz alımının in vivo ölçümlerine tamamlayıcı bir yöntem, küçük kasları kemirgenlerden izole etmek ve inkübe etmek ve daha sonra radyoaktif veya stabil izotop etiketli glikoz analogları^11,12,13 kullanarak glikoz alımını ölçmektir. Bu yöntem, olgun iskelet kasında glikoz alım oranlarının doğru ve güvenilir bir şekilde ölçülmesini sağlar ve çeşitli insülin konsantrasyonlarının varlığında ve elektriksel stimülasyonun neden olduğu kontraksiyon sırasında gerçekleştirilebilir. Daha da önemlisi, izole edilmiş ve inkübe edilmiş iskelet kasında glikoz alımının ölçümleri, çeşitli müdahalelere (örneğin beslenme, fiziksel aktivite, enfeksiyon, terapötikler) maruz kalan farelerin kas metabolik fenotipini araştırırken önemlidir. İzole iskelet kası modeli aynı zamanda glikoz alımını kendi başına etkileyebilecek ve / veya insülin duyarlılığını değiştirebilecek farmakolojik bileşik testi için uygun bir araçtır^12,14. Bu şekilde, kas glukoz metabolizmasını düzenlemek için tasarlanmış bileşiklerin etkinliği, klinik öncesi hayvan modellerinde daha sonra in vivo testlerden önce oldukça kontrollü bir ortamda test edilebilir ve değerlendirilebilir.

Bazı koşullar altında, metabolik canlılık, izole edilmiş ve inkübe edilmiş iskelet kası model sisteminde bir zorluk oluşturabilir. Gerçekten de, inkübe edilmiş kaslarda dolaşım sisteminin olmaması, substratların (örneğin oksijen ve besinler) verilmesinin tamamen kas lifleri ve çevresindeki ortam arasındaki basit difüzyona bağlı olmasını gerektirir. Bununla ilgili olarak, inkübe edilen kasların küçük ve ince olması ve bu nedenle inkübasyon sırasında oksijen difüzyonu için daha az bariyer oluşturması önemlidir¹⁵. Özellikle birkaç saat boyunca uzun süreli inkübasyonlar sırasında, kas enerjisinin tükenmesine neden olan yetersiz oksijen kaynağı nedeniyle hipoksik durumlar gelişebilir¹⁵. Her ne kadar inkübe edilmiş sıçan kasında metabolik canlılığın çeşitli belirteçleri, sıçan kas canlılığının korunmasına yardımcı olan önemli değişkenlerin tanımlanmasının yanı sıra daha önce bildirilmiş olsa da,¹⁵, küçük inkübe fare kaslarında metabolik canlılığın kapsamlı bir değerlendirmesi hala garanti edilmektedir. Bu nedenle, şu anda, glikojen içeriği esas olarak inkübe edilmiş fare iskelet kası^16,17'de metabolik canlılığın bir belirteci olarak kullanılmıştır.

Burada, hücre dışı bir belirteç olarak radyoetiketli [³H]2-deoksi-D-glukoz ve [¹⁴C] mannitol kullanılarak farelerden izole edilmiş ve inkübe edilmiş soleus ve EDL kasında bazal, insülin ve kasılma ile uyarılmış glikoz alımını ölçmek için ayrıntılı bir protokol tanımlamaktayız. Bu çalışmada, glukoz alımı 10 dakikalık bir süre boyunca ölçülmüş ve yöntem, submaksimal ve maksimal etkili insülin konsantrasyonlarının yanı sıra tek bir kasılma protokolü kullanılarak sunulmuştur. Bununla birlikte, burada açıklanan protokoller inkübasyon süresi, insülin dozu ve elektriksel stimülasyon protokolü açısından kolayca değiştirilebilir. Ayrıca, inkübe soleus ve EDL fare kasında metabolik canlılığın çeşitli belirteçlerinin kapsamlı bir karakterizasyonunu sağlıyoruz. Sonuçlar, inkübasyon tamponuna glikoz takviyesinin, 1 saat boyunca inkübe edilen kasın metabolik canlılığını korumak için gerekli olduğunu göstermektedir.

Protokol

Araştırma hayvanlarını içeren prosedürler, ilgili kılavuzlara ve yerel mevzuata uygun olarak gerçekleştirilmelidir. Bu çalışma için kullanılan tüm hayvan deneyleri, Deneysel ve Diğer Bilimsel Amaçlar için kullanılan Omurgalı Hayvanların Korunmasına İlişkin Avrupa Sözleşmesi'ne uygun ve Danimarka Hayvan Deneyleri Müfettişliği tarafından onaylanmıştır.

1. Deney aparatlarının ve dikiş ilmeklerinin hazırlanması

NOT: Bu çalışma için, izole edilmiş fare iskelet kaslarını inkübe etmek için özelleştirilmiş inkübasyon kancalarına sahip entegre bir kas şeridi miyograf sistemi kullanın (Şekil 1). Bu sistem, kasın sürekli oksijenasyon (% 95_O2 ve% 5 CO₂) ve sabit sıcaklıkta fizyolojik bir çözelti içinde yıkanmasını sağlar. Kas dokusu banyosu, kasılma sırasında kas kuvveti üretiminin ölçülmesi için bir kuvvet dönüştürücüsüne bağlanır. Kasılma sırasında miyo-mekanik tepkileri ortaya çıkarmak ve kaydetmek için, sırasıyla bir elektrik darbe uyarıcısı ve bir veri toplama programı kullanın. Kuluçkaya yatırılan kasları, merkezi olarak ve kasın her iki tarafına yerleştirilmiş platin elektrotlarla kasılmaya teşvik edin.

1. Miyograf sistemini ve sıcak odaları 30 ° C'ye kadar açın. Miyograf sistemi ile uyumlu açık veri toplama yazılımı ve veri kümeleri arasında karşılaştırılabilirliği sağlamak için kuvvet dönüştürücüleri kalibre edin.
2. Emilemeyen cerrahi naylon süürün ~16 cm'lik tellerini keserek başlayın. Tek bir iplikçikten yaklaşık 0,4 cm çapında bir döngü oluşturmak için forseps kullanın. Yeterli döngü üretilene kadar bunu tekrarlayın. Her kasın iki döngüye ihtiyacı vardır - biri proksimal ve diğeri distal tendon için.

2. Çözeltilerin ve inkübasyon ortamının hazırlanması

1. Bazal inkübasyon ortamının hazırlanması
   1. Aşağıdaki stok çözeltilerini hazırlayın: 2,5 M sodyum klorür (NaCl, 250 mL), 0,5 M sodyum bikarbonat (NaHCO₃, 250 mL), 0,5 M potasyum klorür (KCl, 50 mL), 0,25 M kalsiyum klorür (CaCl 2, 50 mL), 0,25 M potasyum dihidrojen fosfat (KH₂ PO 4, 50 mL), 0,25 M magnezyum sülfat (MgSO₄, 50 mL), 110 mM sodyum piruvat (Na-Piruvat, 100 mL), 500 mM D-mannitol (100 mL), 1 M 2-deoksi-D-glikoz (4 mL), Krebs-Ringer-Henseleit (KRH) tamponuna karşı diyalize edilmiş% 15 sığır serum albümini (BSA) çözeltisi (aşağıda adım 4'te açıklanmıştır) (100 mL).
      NOT: İstirahat ve kasılma ile uyarılmış glikoz alımını ölçmek için iki çözüm gereklidir. Ayrıca, insülin ile uyarılmış glikoz alımını değerlendirmek için kullanılan her bir insülin konsantrasyonu iki çözüm gerektirir. Bu nedenle, izole fare iskelet kasında bazal, submaksimal insülin, maksimal insülin ve kasılma ile uyarılmış glikoz alımını ölçmek için toplam altı farklı çözeltiye ihtiyaç vardır. Aşağıda, 'bazal inkübasyon ortamı', insülin veya radyoaktif izleyicileri olmayan ortamları ifade eder. 'İnkübasyon ortamı' insülin içeren medyayı ifade eder. 'Glikoz alım inkübasyon ortamı', 'inkübasyon ortamında' kullanılanla aynı konsantrasyonda insüline ek olarak 2-deoksi-D-glikoz ve radyoaktif izleyiciler içeren medyayı ifade eder.
   2. Ultra saf suyu (ddH 2 O) NaCl (117 mM), NaHCO₃ (24,6 mM), KCl (4,7 mM), CaCl 2 (2,5 mM), KH 2 PO 4 (_1,2mM) ve MgSO₄ (_1,2mM) ile destekleyerek bir KRH tamponu hazırlayın. Daha sonra, KRH tamponunu en az 10 dakika boyunca% 95_O2 ve% 5 CO₂ ile gazlayın. KRH tamponunun istenen pH'ı 30 °C'de 7,35-7,45 arasında olmalıdır. pH ayarı oda sıcaklığında yapılırsa, KRH tamponunun pH'ı 7.25-7.35 arasında olmalıdır.
   3. Bazal inkübasyon ortamını tamamlamak için gazlı ve pH ayarlı KRH tamponuna BSA (% 0.1), Na-Piruvat (2 mM) ve D-mannitol (8 mM) ekleyin. O2 ve CO_2'nin gazdan arındırılmasını en aza indirmek için bazal inkübasyon ortamını kapalı bir kapta saklayın_{ve ortamı} 30 °C'ye yerleştirin.
      NOT: Tipik olarak, KRH takviyelerinin ozmolaritesi (yani Na-Piruvat, D-Mannitol ve D-glikoz), kas hücrelerinin büzülmesini veya genişlemesini önlemek için tüm deney boyunca sabit tutulur. Burada açıklanan protokol, KRH takviyeleri için 10 mM'lik bir ozmolarite kullanır. Glikoz içeren bir tampona ihtiyaç duyulursa, ihtiyaçları karşılamak için KRH takviyelerini değiştirin, örneğin 5 mM D-glikoz ve 5 mM D-mannitol.
   4. Kuluçka tamponunda BSA ile ilişkili olası kirleticileri önlemek için, BSA'yı KRH'ye karşı çevirin.
      1. KRH tamponuna karşı diyalize edilmiş %15'lik bir BSA stok çözeltisi yapmak için, 300 g analitik sınıf yağsız BSA'yı 900 mL KRH tamponunda çözerek başlayın. Daha sonra, diyaliz tüpünü, boru yumuşayana kadar yeniden damıtılmış suda kaynatın.
      2. Boruyu BSA-KRH çözeltisi ile doldurun ve boru uçlarını sabitleyin. BSA-KRH ile boruyu 5 L KRH tamponuna yerleştirin ve gece boyunca 4 ° C'de bırakın. Ertesi gün KRH tamponunu değiştirin ve boruyu BSA-KRH ile birlikte 4 ° C'de gece boyunca KRH tamponunda bırakın.
      3. Son olarak, BSA-KRH çözeltisini borudan toplayın ve KRH tamponunu 2 L'lik bir son hacme ekleyin (yani,% 15 BSA-KRH stok çözeltisi). %15 BSA-KRH stok çözeltisini alikotlara bölün ve ~-20 °C'de dondurucuda saklayın.
2. İnsülin içeren inkübasyon ortamının hazırlanması
   1. Submaksimal olarak etkili bir insülin konsantrasyonu içeren inkübasyon ortamı için, bazal inkübasyon ortamının mL'si (100 μU / mL insülin) başına 100 mU / mL insülin stok çözeltisinden 1 μL ekleyin.
   2. Maksimum etkili bir insülin konsantrasyonu içeren inkübasyon ortamı için, bazal inkübasyon ortamının mL'si (10 mU / mL insülin) başına 10 U / mL insülin stok çözeltisinden 1 μL ekleyin.
3. Glikoz alım inkübasyon ortamının hazırlanması
   DİKKAT: Radyoaktif maddelerin taşınmasına sadece yetkili personel tarafından kısıtlı ve kontrollü bir alanda izin verilmekte olup, bazı üniversiteler, araştırma kurumları ve şirketler "Radyoaktivite Kullanım İzni" alınmasını talep edebilir. Malzeme ve atıklar uygun yerel prosedürlere, yönergelere ve mevzuata göre ele alınmalıdır.
   1. Bölüm 2.1.2'de açıklanan prosedürün aynısını uygulayın.
   2. Gazlı ve pH ayarlı KRH tamponuna BSA (% 0.1), Na-Piruvat (2 mM), D-mannitol (7 mM) ve 2-deoksi-D-glikoz (1 mM) ekleyin.
   3. Glikoz alım inkübasyon ortamını tamamlamak için takviye edilen KRH tamponuna [³H]2-deoksi-D-glukoz (0.028 MBq/mL) ve [¹⁴C]mannitol (0.0083 MBq/mL) ekleyin. 30 °C'de saklayın. [³H]2-deoksi-D-glukoz ve [¹⁴C]mannitol etanol içinde çözülürse, kullanımdan önce_N2 aracılı buharlaşma ile etanol çıkarılır.
   4. Submaksimal olarak etkili bir insülin konsantrasyonu içeren glikoz alım inkübasyon ortamı için, mL glikoz alım inkübasyon ortamı (100 μU / mL insülin) başına 1 μL 100 mU / mL insülin stok çözeltisi ekleyin.
   5. Maksimum etkili bir insülin konsantrasyonu içeren glikoz alım inkübasyon ortamı için, mL glikoz alım inkübasyon ortamı (10 mU / mL insülin) başına 10 U / mL insülin stok çözeltisinden 1 μL ekleyin.

3. Hayvanlar ve kuluçka için fare soleus ve EDL kasının diseksiyonu

NOT: Araştırma hayvanlarını içeren prosedürler, ilgili kılavuzlara ve yerel mevzuata uygun olarak gerçekleştirilmelidir. Tarif edilen prosedür, çeşitli suşlara ve genetik geçmişlere sahip, şirket içinde yetiştirilmiş veya ticari olarak temin edilebilen erkek ve dişi farelerle kullanılabilir. Beslenen dişi C57Bl/6J fareler için aşağıdaki prosedür sağlanmıştır. Ortalama olarak, fareler 19 haftalıktı ve 25 g ağırlığındaydı. Fareler, standart kemirgen chow ve suya serbest erişim ile 12: 12 saatlik bir açık-karanlık döngüsünde tutuldu. Hayvan deneyleri yerel saatle 09:00'da başlatıldı ve tüm hayvanlar 2 saatlik bir süre içinde kurban edildi.

1. Her bir inkübasyon odasına 4 mL önceden ısıtılmış (30 ° C) bazal inkübasyon ortamı ekleyin ve bazal inkübasyon ortamının% 95_O2 ve% 5 CO 2 ile sürekli oksijenlendiğinden emin_olun.
2. Fareleri intraperitoneal pentobarbital enjeksiyon (10 mg / 100 g vücut ağırlığı) veya diğer mevcut anestezi (örneğin tribromoetanol) ile anestezi altına alın.
   NOT: Bazı ülkelerde pentobarbital ve diğer anestezik ilaçları kullanmak için bir lisansın gerekli olabileceğini unutmayın. Kas diseksiyonu başlatılmadan önce, her hayvanın anestezisi uygun şekilde indüklenmelidir. Bunu sağlamak için kuyruk ve bacak refleksleri test edilir. En iyi sonuçlar için, çıkarma sırasında kaslara zarar vermemek için diseksiyon iyi uygulanmalıdır.
3. Anesteziye eğilimli fareleri bir diseksiyon tepsisine (örneğin strafor kapak) yerleştirin ve gerektiğinde bir iğne kullanarak ön ve arka pençeleri sabitleyin.
4. Cildi alt bacaktan çıkarın ve hem Aşil tendonunun hem de diz ekleminin görünür olduğundan emin olun.
   1. Soleus kasının diseksiyonu için, Aşil tendonuna tek bir dikiş halkası bağlayarak başlayın. Dikiş döngüsünün distal olarak Aşil tendonuna bir bezelye forseps sabitleyin ve soleus ve gastroknemius kaslarını pençeden serbest bırakmak için kesin. Bezelye forsepslerini fare boyunca dikkatlice kaydırın, böylece soleus kasını açığa çıkarın.
   2. Bezelye forsepslerini sabitleyin ve soleus kasının proksimal tendonunun etrafına ikinci bir dikiş halkası yerleştirin. Daha sonra, proksimal tendonu kesin ve soleus'u (bağlı iki dikiş halkası dahil) gastroknemius kasından arındırılmış olarak disseke edin. Her bir dikiş halkasını ilgili kancalara bağlayarak soleus kasını inkübasyon odasına hızlı bir şekilde yerleştirin.
5. Forseps kullanarak m. tibialis anterior (TA) kaplayan fasyayı çıkarın. Doğru yapılırsa, TA ve EDL kaslarının distal tendonları açık beyaz ve görünür olmalıdır; ve birbirinden ayrıldı.
6. TA kasının distal tendonunu kesin ve daha sonraki analizler için kası diseke edin (örneğin genotipleme). Forseps kullanarak, EDL kasını çevreleyen dokulardan nazikçe serbest bırakın, ancak kası sağlam bırakın ve tendonları kesmeyin. Distal tendonun etrafına bir sütür döngüsü ve EDL'nin proksimal tendonunun etrafına ikinci bir sütür döngüsü yerleştirin.
7. Daha sonra, EDL kasını serbest bırakan tendonları iki bağlı dikiş ilmeği ile kesin ve her bir dikiş halkasını ilgili kancalara bağlayarak kası inkübasyon odasına hızlı bir şekilde yerleştirin. Kuluçka sırasında ve özellikle soleus ve EDL kaslarının elektriksel olarak indüklenen kasılması sırasında gerginliği kaybetmemek için, tendonların etrafındaki dikiş halkalarının sıkı düğümlerle sabitlenmesi büyük önem taşımaktadır.
8. Son olarak, hayvanı örneğin servikal çıkık ile ötenazileştirin.
9. Kaslar diseke edildiğinde ve inkübasyon odalarına yerleştirildiğinde, her kasın dinlenme gerginliğini ~ 5 mN'ye ayarlayın ve deneysel protokolü başlatmadan önce kasları en az 10 dakika önceden inkübe edin.

4. İzole fare iskelet kasında insülin ile uyarılmış glikoz alımı

1. Adım 3.9'u takiben, bazal inkübasyon ortamını insülin içermeyen (bazal inkübasyon ortamı), submaksimal olarak etkili bir insülin konsantrasyonu veya maksimum etkili bir insülin konsantrasyonu içeren inkübasyon ortamı ile değiştirin ve 20 dakika boyunca inkübasyon odalarında bırakın. Her inkübasyon odasını 1 dakika ayırın, böylece kasların sonraki hasadı için zaman kazanın.
2. 20 dakikalık stimülasyon süresinin sonunda, inkübasyon ortamını aynı konsantrasyonda insülin içeren glikoz alım inkübasyon ortamı ile değiştirin ve yine her bir inkübasyon odası arasında 1 dakikalık boşluk bırakarak 10 dakika boyunca inkübasyon odalarında bırakın.
3. Glikoz alım inkübasyon ortamında 10 dakikalık inkübasyondan sonra, inkübasyon odalarındaki kasları nazikçe çıkarın ve buz gibi soğuk bazal inkübasyon ortamında yıkayın. Daha sonra, dikiş halkaları çıkarılmadan ve kaslar sıvı azotta dondurulmadan önce kasları filtre kağıdı üzerinde hızla kurulayın. Glikoz alımına ek olarak çeşitli hücre içi metabolitleri ve protein sinyallerini araştırmak isteniyorsa, inkübe edilmiş kasların hızlı bir şekilde toplanması zorunludur.
4. Her inkübasyon odasından glikoz alım inkübasyon ortamının 100 μL'sini toplayın ve -20 ° C'de saklayın. Bu örneklerdeki radyoaktivite miktarı, kas glikoz alımının hesaplanmasına dahil edilecektir.

5. İzole fare iskelet kasında kasılma ile uyarılmış glikoz alımı

NOT: İzole edilmiş fare iskelet kasının kasılmasını indüklemek için aşağıdaki protokolü kullanın: 1 tren / 15 s, her tren 1 s uzunluğunda 100 Hz'de verilen 0,2 ms darbelerden oluşur. Bununla birlikte, izole edilmiş fare iskelet kasının kasılmasını sağlayan diğer benzer protokoller de muhtemelen işe yarayacaktır. Önemli olarak, voltaj, deney düzeneğine bağlı olan inkübe edilmiş kasın maksimum kuvvet gelişimini sağlamak için ayarlanmalıdır. Bu sağlanmazsa, kasın tüm liflerinin kasılmaması riskini taşıyabilirsiniz. Buna karşılık, bu veri kümesinde önyargıya neden olabilir.

1. 3.9 adımını takiben, platin elektrotları merkezi olarak ve kasların her iki tarafına yerleştirin. Bazal inkübasyon ortamını glikoz alım inkübasyon ortamı ile değiştirdikten hemen sonra kasların kasılmasını başlatın. Mümkünse, her bir inkübasyon odasını 1 dakika ayırın, böylece kasların sonraki hasadı için zaman kazanın. Her inkübe edilmiş kastan kuvvet üretimini kaydetmeyi unutmayın.
2. Glikoz alım inkübasyon ortamında 10 dakikalık kasılmadan sonra, platin elektrotları çıkarın, kasları inkübasyon odalarından yavaşça toplayın ve buz gibi soğuk bazal inkübasyon ortamında yıkayın. Daha sonra, dikiş halkaları çıkarılmadan ve kaslar sıvı azotta dondurulmadan önce kasları filtre kağıdı üzerinde hızla kurutun. Tüm kas hasadı prosedürü mümkün olduğunca hızlı yapılmalıdır.
3. Her inkübasyon odasından glikoz alım inkübasyon ortamının 100 μL'sini toplayın ve -20 ° C'de saklayın. Bu örneklerdeki radyoaktivite miktarı, kas glikoz alımının hesaplanmasına dahil edilecektir.

6. İskelet kası homojenizasyonu ve işlenmesi

NOT: Kas homojenizasyonu için aşağıda verilen prosedür, aynı kas örnekleri setinde batı lekelenmesi ile hem glikoz alımını hem de miyosellüler sinyalizasyonu belirlemeyi mümkün kılar.

1. Her bir kası, %10 gliserol, 20 mM sodyum-pirofosfat, %1 IGEPAL CA-630 (NP-40), 2 mM fenilmetilsülfonilflorür (izopropanol içinde çözünmüş), 150 mM NaCl, 50 mM HEPES, 20 mM β-gliserofosfat, 10 mM sodyum florür (NaF), 1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 1 mM glikoleteriamintetraasetik asit (EGTA), 10 μg/ml aprotinin içeren pH 7.5 ile 400 μL buz gibi soğuk tamponda homojenize edin, Çelik boncuklar ve bir dokusallaştırıcı (30 Hz'de 2 x 45 s) kullanılarak 10 μg / mL leupeptin, 3 mM benzamidin ve 2mM sodyum-ortovanadat kullanılır. Tüm homojenleri 4 °C'de 1 saat boyunca uçtan uca döndürün, ardından 4 °C'de 20 dakika boyunca 16.000 x g'de santrifüj edilir. Kas glikoz alımını belirlemek için kullanılan lizatı (süpernatant) toplayın.

7. Radyoaktif işaretli 2-deoksiglukoz ve mannitol tayini

1. 2 mL sıvı sintilasyon sıvısı içeren sıvı sintilasyon sayma şişelerini ayırmak için her bir kas lizatının 150 μL'sini ve her bir inkübasyon odasından glikoz alım inkübasyon ortamının 25 μL'sini ekleyin. Ayrıca, sadece 3 mL sıvı sintilasyon sıvısı içeren iki kör kontrol şişesi hazırlayın. Tüm şişeleri kapatın ve her şişeyi ~ 5 s boyunca vorteksleyerek iyice karıştırın.
2. Şişeleri bir sıvı sintilasyon sayacına yerleştirin ve üreticinin yönergelerine göre [³H]2-deoksi-D-glikoz ve [¹⁴C] mannitolün radyoaktivitesini ölçün. Her sıvı sintilasyon şişesi için DPM'yi (dakika başına parçalanma) kaydedin.

8. Kas glukoz alım oranlarının hesaplanması

1. Standart protein niceleme yöntemlerini (örneğin, Bicinchoninic acid veya Bradford tahlilleri) kullanarak her kas örneğindeki toplam protein konsantrasyonunu ölçmek için adım 6.1'den itibaren lizatı kullanın. Her bir sintilasyon şişesine eklenen protein miktarını (mg) hesaplayın.
   NOT: Her kas örneği için glikoz alım hızı, hücre dışı bir belirteç olarak [¹⁴C] mannitol kullanılarak kas numunesindeki toplam [3 H]2-deoksi-D-glikoz miktarından hücre dışı boşlukta ^{bulunan [3}H]2-deoksi-D-glikoz miktarının çıkarılmasıyla hesaplanır. [³H]2-deoksi-D-glukoz ve [¹⁴C]mannitolün inkübasyon sırasında kas dokusunda benzer difüzyon özellikleri sergilediği varsayılmaktadır. Aşağıdaki hesaplamaları gerçekleştirin:
2. Tüm kas ve ortam örneklerinden kör denetim örneklerinin [³H] ve [¹⁴C] DPM'sini çıkararak başlayın.
3. μL (μL-ECS) cinsinden kas hücre dışı boşluğunu belirleyin:
   [¹⁴C] DPM_kası / ([¹⁴C]DPM_ortamı / M_vol)
4. Kas hücre dışı alanındaki [3 H]DPM miktarını hesaplayın ([³H]DPM_ECS):
   μL-ECS × ([³H]DPM_ortamı / M_vol)
5. Kas hücre içi boşluğundaki [3 H]DPM miktarını hesaplayın ([³H]DPM_ICS):
   [³Saat] DPM_kası− [³H]DPM_ECS
6. Kas glikoz alım oranını hesaplayın (μmol / g protein / saat):
   [³Saat] DPM_ICS / ([³H]DPM_ortamı / M_vol) / [2-deoksi-D-glukoz])) / mg protein) / T_h
   NOT: Yukarıdaki tüm denklemler için,
   [¹⁴C] DPM_kası , bir kas örneğindeki [¹⁴C] mannitol radyoaktivitesinin miktarıdır;
   [¹⁴C] DPM_medyası , bir ortam örneğindeki [¹⁴C]mannitol radyoaktivite miktarıdır;
   [³Saat] DPM_{kası, bir kas} örneğindeki [³H]2-deoksi-D-glukoz radyoaktivitesi miktarıdır;
   [³Saat] DPM_ortamı, bir ortam örneğindeki [³H]2-deoksi-D-glukoz radyoaktivitesi miktarıdır;
   [³Saat] DPM_ECS , kas hücre dışı boşluğundaki [³H]2-deoksi-D-glukoz radyoaktivitesi miktarıdır;
   [³Saat] DPM_ICS , kas hücre içi boşluğundaki [³H]2-deoksi-D-glukoz radyoaktivitesi miktarıdır;
   μL-ECS, μL'deki kas hücre dışı boşluğudur;
   M_vol , sintilasyon sayımı için kullanılan inkübasyon ortamının hacmidir (μL) (örneğin, yukarıda belirtildiği gibi '25');
   _{T h}, saat başına alım oranlarını hesaplamak için kullanılan zaman faktörüdür (yani, kasları 10 dakika boyunca glikoz alım ortamı ile inkübe ederken '1/6')
7. Bu örnek hesaplamayı dikkate alın. Kör denetim örneklerinin [³H] ve [¹⁴C] DPM'si (sırasıyla 17 ve 6) aşağıda belirtilen DPM değerlerinden çıkarılmıştır.
   [¹⁴C] DPM_kası: 343
   [¹⁴C] DPM_medyası: 11846
   [³Saat] DPM_kası: 4467
   [³Saat] DPM_medyası: 39814
   M_hacim: 25
   mg protein: 0.396 (150 μL kas proteini lizatında)
   [2-deoksi-D-glukoz]: 1 (mM)
   T h: 1/6 (_h)
   μL-ECS = 343 DPM / (11846 DPM / 25 μL) = 0,724 μL
   [³Saat] DPM_ECS: 0,724 μL × (39814 DPM / 25 μL) = 1153 DPM
   [³Saat] DPM_ICS: 4467 DPM - 1153 DPM = 3314 DPM
   Glikoz alımı: ((3314 DPM / (39814 DPM / 25 μL) / 1 mmol / L) / 0.396 mg protein) / (1/6 saat) = 31.53 μmol / g protein / saat

9. SDS-PAGE ve western blot analizleri

1. Laemmli tamponunda soleus ve EDL kas lizatları hazırlayın ve 96 ° C'de 5 dakika ısıtın.
2. Kendinden dökümlü jeller üzerinde SDS-PAGE ile eşit miktarda kas proteinini ayırın ve proteinleri yarı kuru lekeleme ile poliviniliden florür membranlarına aktarın.
3. Daha sonra, %0.05 Tween 20 ve %2 yağsız süt içeren Tris tamponlu salin içindeki membranları ve ilgili birincil ve ikincil antikorlara sahip prob membranlarını inkübe edin.
4. Kemilüminesanslı proteinleri tespit edin ve dijital bir görüntüleme sistemi ile görselleştirin.

10. Kas glikojeni, nükleotitler, laktat, kreatin ve fosfokreatin

1. EDL ve soleus kas örneklerini çıkarmak için perklorik asit kullanın.
2. Daha sonra, numuneleri nötralize edin ve daha önce tarif edildiği gibi laktat, kreatin ve fosfokreatin için analiz edin¹⁸.
3. EDL ve soleus kasındaki nükleotid içeriğini, perklorik asitte ekstraksiyonu takiben ters fazlı HPLC ile analiz edin.
4. Daha önce tarif edildiği gibi florometrik bir yöntemle asit hidrolizinden sonra tüm kas homojenatındaki kas glikojen içeriğini glikozil birimleri olarak belirleyin¹⁸.

11. İstatistik

1. İstatistiksel analiz yazılımı ile istatistiksel analizler gerçekleştirebilir.
2. Tablo 1'de sunulan değerler arasındaki istatistiksel farklılıkları değerlendirmek için iki yönlü bir varyans analizi (ANOVA) testi kullanın.
3. Şekil 2'de sunulan her grupta EDL ve soleus arasındaki glikoz alımındaki istatistiksel farklılıkları değerlendirmek için eşlenmemiş Student t testlerini kullanın. Verileri ortalamanın standart hatası (SEM) ± araç olarak sunmak. P < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edilir.

Sonuçlar

Şekil 2'de gösterildiği gibi, bazal glikoz alım oranları, dişi farelerden izole soleus ve EDL kası arasında benzerdi. Bu da^{12,13,19,20'den} önce birkaç kez bildirilmiştir. Glikoz alımı, submaksimal olarak etkili bir insülin konsantrasyonuna (100 μU / mL) yanıt olarak, soleus ve EDL kasında sırasıyla 12 ve 9 μmol /...

Tartışmalar

İskelet kasında glikoz alımının bozulmamış bir şekilde düzenlenmesi, genel sağlığın korunması için önemlidir¹. Bu nedenle, kas glukozu alımının araştırılması, çeşitli sağlık değiştirici müdahaleleri değerlendirirken genellikle birincil okuma görevi görür. Burada, insülin ve elektriksel olarak indüklenen kasılmalara yanıt olarak farelerden izole ve inkübe edilmiş soleus ve EDL kasında glikoz alımını ölçmek için bir ex vivo yöntemi tanımlamaktayız. Y...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
[14C]D-mannitol	American Radiolabeled Chemicals, Inc.	ARC 0127
[3H]2-deoxy-D-glucose	American Radiolabeled Chemicals, Inc.	ART 0103A
2-Deoxy-D-glucose	Sigma	D8375
4-0 USP non-sterile surgical nylon suture	Harvard Apparatus	51-7698
Streptavidin/HRP (Conjugate)	DAKO	P0397	Used to detect ACC protein
Akt2 antibody	Cell Signaling	3063
AMPKα2 antibody	Santa Cruz	SC-19131
aprotinin	Sigma	A1153
benzamidine	Sigma	B6505
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A7030
CaCl2	Merck	1020831000
Calibration kit (force)	Danish Myo Technology A/S	300041
Chemiluminescence	Millipore	WBLUF0500
D-Glucose	Merck	1084180100
D-Mannitol	Sigma	M4125
Data collection program	National Instruments	LabVIEW software version 7.1
Dialysis tubing	Visking	DTV.12000.09 Size No.9
Digital imaging system	BioRad	ChemiDoc MP
EDTA	Sigma EDS	E9884
EGTA	Sigma	E4378
Electrical Pulse Stimulator	Digitimer	D330 MultiStim System
Glycerol	Sigma	G7757
HEPES	Sigma	H7637
IGEPAL CA-630	Sigma	I8896
Insulin	Novo Nordisk	Actrapid, 100 IE/mL
KCl	Merck	1049361000
KH2PO4	Merck	104873025
leupeptin	Sigma	L2884
MgSO4	Merck	1058860500
Muscle Strip Myograph System	Danish Myo Technology A/S	Model 820MS
Na-Orthovanadate	Sigma	S6508
Na-Pyrophosphate	Sigma	221368
Na-Pyruvate	Sigma	P2256
NaCl	Merck	106041000
NaF	Sigma	S1504
NaHCO3	VWR	27778260
pACC Ser212 antibody	Cell Signaling	3661
pAkt Thr308 antibody	Cell Signaling	9275
pAMPK Thr172 antibody	Cell Signaling	2531
phenylmethylsulfonylfluoride	Sigma	P7626
Platinum electrodes	Danish Myo Technology A/S	300145
pTBC1D4 Ser588 antibody	Cell Signaling	8730
Scintillation counter	Perkin Elmer	Tri-Carb-2910TR
Scintillation fluid	Perkin Elmer	6013329
Statistical analyses software	Systat	SigmaPlot version 14
TBC1D4 antibody	Abcam	ab189890
TissueLyser II	Qiagen	85300
Ultrapure water	Merck	Milli-Q Reference A+ System
β-glycerophosphate	Sigma	G9422