Mesure de l’absorption de glucose stimulée par l’insuline et la contraction dans le muscle squelettique mature isolé et incubé de souris

Résumé

Une régulation intacte de l’absorption du glucose musculaire est importante pour maintenir l’homéostasie du glucose dans tout le corps. Ce protocole présente une évaluation de l’absorption de glucose stimulée par l’insuline et la contraction dans les muscles squelettiques matures isolés et incubés lors de la délimitation de l’impact de diverses interventions physiologiques sur le métabolisme du glucose dans tout le corps.

Résumé

Le muscle squelettique est un tissu sensible à l’insuline et absorbe généralement la majeure partie du glucose qui pénètre dans le sang après un repas. De plus, il a été rapporté que le muscle squelettique peut augmenter l’extraction du glucose du sang jusqu’à 50 fois pendant l’exercice par rapport aux conditions de repos. L’augmentation de l’absorption de glucose musculaire pendant l’exercice et la stimulation de l’insuline dépend de la translocation du transporteur de glucose 4 (GLUT4) des compartiments intracellulaires vers la membrane de surface des cellules musculaires, ainsi que de la phosphorylation du glucose en glucose-6-phosphate par l’hexokinase II. L’isolement et l’incubation des muscles de souris tels que m. soleus et m. extensor digitorum longus (EDL) est un modèle ex vivo approprié pour étudier les effets de l’insuline et de la contraction induite électriquement (un modèle pour l’exercice) sur l’absorption du glucose dans les muscles squelettiques matures. Ainsi, le modèle ex vivo permet d’évaluer la sensibilité musculaire à l’insuline et permet d’adapter la production de force musculaire pendant la contraction assurant un recrutement uniforme des fibres musculaires lors des mesures de l’absorption de glucose musculaire. De plus, le modèle décrit convient aux tests de composés pharmacologiques qui peuvent avoir un impact sur la sensibilité musculaire à l’insuline ou peuvent être utiles pour tenter de délimiter la complexité régulatrice de l’absorption du glucose dans les muscles squelettiques.

Ici, nous décrivons et fournissons un protocole détaillé sur la façon de mesurer l’absorption de glucose stimulée par l’insuline et la contraction dans les préparations musculaires isolées et incubées de soleus et d’EDL de souris utilisant le [³H]2-désoxy-D-glucose radiomarqué et le [¹⁴C]mannitol comme marqueur extracellulaire. Cela permet une évaluation précise de l’absorption du glucose dans le muscle squelettique mature en l’absence de facteurs de confusion pouvant interférer dans le modèle animal intact. En outre, nous fournissons des informations sur la viabilité métabolique du muscle squelettique de souris incubé, suggérant que la méthode appliquée possède certaines mises en garde dans certaines conditions lors de l’étude du métabolisme énergétique musculaire.

Introduction

Le muscle squelettique possède la capacité d’extraire de grandes quantités de glucose de l’espace extracellulaire en réponse à l’insuline et à l’exercice. Cela aide à maintenir l’homéostasie du glucose dans tout le corps et sécurise l’approvisionnement en glucose pendant les périodes de forte demande d’énergie. Étant donné qu’une régulation intacte de l’absorption du glucose dans les muscles squelettiques s’est avérée importante pour la santé globale et la performance physique ^1,2, les mesures de l’absorption du glucose musculaire dans diverses conditions ont reçu beaucoup d’attention. Chez l’homme et l’animal, la pince hyperinsulinémique-euglycémique a été utilisée comme technique de référence pour évaluer la sensibilité à l’insuline in vivo ^3,4. Contrairement aux résultats obtenus lors d’un test de tolérance au glucose par voie orale, la technique de la pince hyperinsulinémique-euglycémique ne nécessite pas de fonction gastro-intestinale intacte ou de sécrétion d’insuline par le pancréas et permet donc de comparer les réponses à l’insuline entre les sujets présentant des variations de la fonction gastro-intestinale et / ou pancréatique. Des mesures de l’absorption du glucose musculaire in vivo pendant l’exercice chez l’homme ont été effectuées fréquemment depuis les années 1960⁵. D’abord par l’utilisation de techniques d’équilibre artérioveineux⁶ et plus tard par l’utilisation de l’imagerie par émission de positons (TEP) en combinaison avec un analogue du glucose émettant des positons, par exemple ¹⁸F-Fluoro-désoxy-glucose⁷. Chez les rongeurs, l’absorption de glucose musculaire stimulée par l’exercice in vivo est généralement réalisée par l’utilisation d’analogues du glucose marqués par des isotopes radioactifs ou stables ^8,9,10.

Une méthode complémentaire aux mesures de l’absorption du glucose musculaire in vivo consiste à isoler et à incuber de petits muscles de rongeurs, puis à mesurer l’absorption de glucose à l’aide d’analogues du glucose marqués par des isotopes radioactifs ou stables 11,12,13. Cette méthode permet une quantification précise et fiable des taux d’absorption du glucose dans le muscle squelettique mature et peut être réalisée en présence de diverses concentrations d’insuline et lors de la contraction provoquée par stimulation électrique. Plus important encore, les mesures de l’absorption du glucose dans les muscles squelettiques isolés et incubés sont pertinentes lors de l’étude du phénotype métabolique musculaire de souris ayant subi diverses interventions (par exemple, nutrition, activité physique, infection, thérapeutique). Le modèle de muscle squelettique isolé est également un outil approprié pour les tests de composés pharmacologiques qui peuvent affecter l’absorption du glucose en soi et / ou modifier la sensibilité à l’insuline^12,14. De cette façon, l’efficacité des composés conçus pour réguler le métabolisme du glucose musculaire peut être testée et évaluée dans un milieu hautement contrôlé avant des tests in vivo ultérieurs sur des modèles animaux précliniques.

Dans certaines conditions, la viabilité métabolique peut poser un défi dans le système de modèle musculaire squelettique isolé et incubé. En effet, l’absence de système circulatoire dans les muscles incubés implique que la livraison de substrats (par exemple l’oxygène et les nutriments) dépend entièrement de la simple diffusion entre les fibres musculaires et l’environnement environnant. À cet égard, il est important que les muscles incubés soient petits et minces et représentent donc moins une barrière pour la diffusion de l’oxygène pendant l’incubation¹⁵. Surtout pendant les incubations prolongées pendant plusieurs heures, des états hypoxiques peuvent se développer en raison d’un apport insuffisant en oxygène entraînant un épuisement de l’énergie musculaire¹⁵. Bien que divers marqueurs de la viabilité métabolique dans le muscle du rat incubé aient été rapportés précédemment parallèlement à l’identification de variables importantes qui aident à maintenir la viabilité du muscle du rat¹⁵, une évaluation complète de la viabilité métabolique dans les petits muscles de souris incubés est toujours justifiée. Par conséquent, à l’heure actuelle, la teneur en glycogène a principalement été utilisée comme marqueur de la viabilité métabolique dans le muscle squelettique de souris incubé^16,17.

Nous décrivons ici un protocole détaillé pour mesurer l’absorption basale, insulinique et stimulée par la contraction du glucose dans le soléus isolé et incubé et le muscle EDL de souris en utilisant le [³H]2-désoxy-D-glucose radiomarqué et le [¹⁴C]mannitol comme marqueur extracellulaire. Dans la présente étude, l’absorption de glucose a été mesurée pendant une période de 10 minutes et la méthode est présentée avec l’utilisation de concentrations d’insuline sous-maximales et maximalement efficaces ainsi que d’un seul protocole de contraction. Cependant, les protocoles décrits ici peuvent facilement être modifiés en ce qui concerne le temps d’incubation, le dosage de l’insuline et le protocole de stimulation électrique. En outre, nous fournissons une caractérisation approfondie de divers marqueurs de la viabilité métabolique dans le soléaire incubé et le muscle de la souris EDL. Les résultats indiquent que la supplémentation en glucose du tampon d’incubation est essentielle pour préserver la viabilité métabolique du muscle incubé pendant 1 heure.

Protocole

Les procédures impliquant des animaux de recherche doivent être effectuées conformément aux lignes directrices pertinentes et à la législation locale. Toutes les expériences sur les animaux utilisées pour cette étude étaient conformes à la Convention européenne pour la protection des animaux vertébrés utilisés à des fins expérimentales et à d’autres fins scientifiques et ont été approuvées par l’Inspection danoise de l’expérimentation animale.

1. Préparation de l’appareil expérimental et des boucles de suture

REMARQUE: Pour cette étude, utilisez un système de myographe à bande musculaire intégré avec des crochets d’incubation personnalisés pour incuber les muscles squelettiques isolés de la souris (Figure 1). Ce système permet au muscle de se baigner dans une solution physiologique avec oxygénation continue (95% O₂ et 5% CO₂) et à température constante. Le bain de tissu musculaire est couplé à un transducteur de force pour la mesure de la production de force musculaire pendant la contraction. Pour obtenir et enregistrer les réponses myomécaniques pendant la contraction, utilisez respectivement un stimulateur d’impulsions électriques et un programme de collecte de données. Stimulez les muscles incubés à se contracter par des électrodes de platine positionnées au centre et des deux côtés du muscle.

1. Allumez le système myographique et les chambres chaudes à 30 °C. Logiciel de collecte de données ouvert compatible avec le système myographique et étalonner les capteurs de force pour assurer la comparabilité entre les ensembles de données.
2. Commencez par couper des brins d’environ 16 cm de suture chirurgicale en nylon non résorbable. Utilisez des pinces pour créer une boucle d’environ 0,4 cm de diamètre à partir d’un seul brin. Répétez cette opération jusqu’à ce que suffisamment de boucles aient été produites. Chaque muscle a besoin de deux boucles - une pour le tendon proximal et une pour le tendon distal.

2. Préparation des solutions et des milieux d’incubation

1. Préparation des milieux d’incubation basaux
   1. Préparer les solutions mères suivantes : 2,5 M de chlorure de sodium (NaCl, 250 mL), 0,5 M de bicarbonate de sodium (NaHCO₃, 250 mL), 0,5 M de chlorure de potassium (KCl, 50 mL), 0,25 M de chlorure de calcium (CaCl₂, 50 mL), 0,25 M de dihydrogénophosphate de potassium (KH₂PO₄, 50 mL), 0,25 M de sulfate de magnésium (MgSO₄, 50 mL), 110 mM de pyruvate de sodium (Na-Pyruvate, 100 mL), 500 mM de D-mannitol (100 mL), 1 M 2-désoxy-D-glucose (4 mL), solution à 15 % d’albumine sérique bovine (BSA) dialysée contre un tampon krebs-Ringer-Henseleit (KRH) (décrit ci-dessous à l’étape 4) (100 mL).
      REMARQUE: Deux solutions sont nécessaires pour mesurer l’absorption de glucose stimulée par le repos et la contraction. De plus, chaque concentration d’insuline utilisée pour évaluer l’absorption de glucose stimulée par l’insuline nécessite deux solutions. Ainsi, au total, six solutions différentes sont nécessaires pour mesurer l’absorption basale, sous-maximale de l’insuline, de l’insuline maximale et de la contraction dans le muscle squelettique isolé de la souris. Dans ce qui suit, le terme « milieu d’incubation basal » désigne les milieux sans insuline ni traceurs radioactifs. Les « milieux d’incubation » désignent les milieux contenant de l’insuline. Les « milieux d’incubation d’absorption du glucose » désignent les milieux contenant du 2-désoxy-D-glucose et des traceurs radioactifs en plus de l’insuline à une concentration identique à celle utilisée dans les « milieux d’incubation ».
   2. Préparer un tampon KRH en complétant l’eau ultrapure (ddH₂O) avec du NaCl (117 mM), du NaHCO₃ (24,6 mM), du KCl (4,7 mM), du CaCl₂ (2,5 mM), du KH₂PO₄ (1,2 mM) et du MgSO₄ (1,2 mM). Par la suite, gazez le tampon KRH avec 95% O₂ et 5% co₂ pendant au moins 10 min. Le pH souhaité du tampon KRH doit être compris entre 7,35 et 7,45 à 30 °C. Si le réglage du pH est effectué à température ambiante, le pH du tampon KRH doit être compris entre 7,25 et 7,35.
   3. Ajouter le BSA (0,1 %), le Na-Pyruvate (2 mM) et le D-mannitol (8 mM) au tampon KRH gazé et ajusté au pH pour compléter le milieu d’incubation basal. Entreposer les milieux d’incubation basaux dans un récipient scellé pour minimiser le dégazage de l’O2 et du_CO2 et placer les milieux à 30 °C.
      REMARQUE: En règle générale, l’osmolarité des suppléments de KRH (c’est-à-dire Na-Pyruvate, D-Mannitol et D-glucose) est maintenue constante tout au long d’une expérience pour éviter le rétrécissement ou l’expansion des cellules musculaires. Le protocole décrit ici utilise une osmolarité de 10 mM pour les suppléments krH. Si un tampon contenant du glucose est nécessaire, remplacez les suppléments de KRH pour répondre aux besoins, par exemple 5 mM de D-glucose et 5 mM de D-mannitol.
   4. Pour éviter d’éventuels contaminants associés à la BSA dans le tampon d’incubation, dialyze BSA contre KRH.
      1. Pour obtenir une solution mère de BSA à 15 % dialysée contre un tampon KRH, commencez par dissoudre 300 g de BSA sans gras de qualité analytique dans 900 mL de tampon KRH. Ensuite, faites bouillir le tube de dialyse dans de l’eau redistillée jusqu’à ce que le tube soit mou.
      2. Remplissez le tube avec la solution BSA-KRH et fixez les extrémités du tube. Placez le tube avec BSA-KRH dans 5 L de tampon KRH et laissez-le toute la nuit à 4 °C. Le lendemain, remplacez le tampon KRH et laissez le tube avec BSA-KRH dans le tampon KRH pendant la nuit à 4 °C.
      3. Enfin, prélever la solution BSA-KRH du tube et ajouter le tampon KRH à un volume final de 2 L (c’est-à-dire une solution mère BSA-KRH à 15 %). Diviser la solution mère à 15 % de BSA-KRH en aliquotes et conserver au congélateur à ~-20 °C.
2. Préparation de milieux d’incubation contenant de l’insuline
   1. Pour les milieux d’incubation contenant une concentration d’insuline sous-maximale efficace, ajouter 1 μL d’une solution mère d’insuline de 100 mU/mL par mL de milieu d’incubation basal (100 μU/mL d’insuline).
   2. Pour les milieux d’incubation contenant une concentration d’insuline efficace maximale, ajouter 1 μL d’une solution mère d’insuline de 10 U/mL par mL de milieu d’incubation basal (10 mU/mL d’insuline).
3. Préparation des milieux d’incubation d’absorption du glucose
   ATTENTION : La manipulation de matières radioactives n’est autorisée que dans une zone restreinte et contrôlée par le personnel autorisé et certaines universités, instituts de recherche et entreprises peuvent exiger l’acquisition d’un « permis d’utilisation de la radioactivité ». Les matériaux et les déchets doivent être manipulés conformément aux procédures, directives et législations locales appropriées.
   1. Suivez la même procédure que celle décrite à la section 2.1.2.
   2. Ajouter le BSA (0,1 %), le Na-Pyruvate (2 mM), le D-mannitol (7 mM) et le 2-désoxy-D-glucose (1 mM) au tampon KRH gazé et ajusté au pH.
   3. Ajouter [³H]2-désoxy-D-glucose (0,028 MBq/mL) et [¹⁴C]mannitol (0,0083 MBq/mL) au tampon KRH supplémenté pour compléter le milieu d’incubation de l’absorption du glucose. Conserver à 30 °C. Si [³H]2-désoxy-D-glucose et [¹⁴C]mannitol sont dissous dans l’éthanol, retirez l’éthanol par évaporation médiée par_N2 avant utilisation.
   4. Pour les milieux d’incubation d’absorption du glucose contenant une concentration d’insuline sous-maximale efficace, ajouter 1 μL d’une solution mère d’insuline de 100 mU/mL par mL de milieu d’incubation absorbant le glucose (100 μU/mL d’insuline).
   5. Pour les milieux d’incubation d’absorption du glucose contenant une concentration d’insuline d’efficacité maximale, ajouter 1 μL d’une solution mère d’insuline de 10 U/mL par mL de milieu d’incubation d’absorption du glucose (10 mU/mL d’insuline).

3. Animaux et dissection du soléaire de la souris et du muscle EDL pour l’incubation

REMARQUE: Les procédures impliquant des animaux de recherche doivent être effectuées conformément aux lignes directrices pertinentes et à la législation locale. La procédure décrite peut être utilisée avec des souris mâles et femelles élevées en interne ou disponibles dans le commerce de diverses souches et origines génétiques. La procédure suivante est prévue pour les souris femelles C57Bl/6J nourries. En moyenne, les souris avaient 19 semaines et pesaient 25 g. Les souris ont été maintenues sur un cycle clair-sombre de 12:12 h avec un accès libre au chow et à l’eau standard des rongeurs. Les expériences sur les animaux ont été lancées à ~ 9h00 heure locale et tous les animaux ont été sacrifiés dans un délai de 2 h.

1. Ajouter 4 mL de milieu d’incubation basal préchauffé (30 °C) à chaque chambre d’incubation et s’assurer que le milieu d’incubation basal est continuellement oxygéné avec 95 % O₂ et 5 % de CO₂.
2. Anesthésier les souris avec une injection intrapéritonéale de pentobarbital (10 mg/100 g de poids corporel) ou d’autres anesthésies disponibles (p. ex. tribromoéthanol).
   REMARQUE: Sachez que dans certains pays, une licence pour manipuler le pentobarbital et d’autres médicaments anesthésiques peut être requise. Avant que la dissection musculaire puisse être initiée, l’anesthésie de chaque animal doit être correctement induite. Pour s’en assurer, les réflexes de la queue et des jambes sont testés. Pour des résultats optimaux, la dissection doit être bien pratiquée pour éviter d’endommager les muscles lors du retrait.
3. Placez les souris anesthésiées sujettes sur un plateau de dissection (p. ex. couvercle en polystyrène) et épinglez les pattes avant et postérieures, au besoin, à l’aide d’une aiguille.
4. Retirez la peau de la jambe inférieure et assurez-vous que le tendon d’Achille et l’articulation du genou sont visibles.
   1. Pour la dissection du muscle soléaire, commencez par attacher une seule boucle de suture au tendon d’Achille. Fixez une pince pean au tendon d’Achille distalement de la boucle de suture et coupez pour libérer les muscles soléaire et gastrocnémien de la patte. Faites glisser délicatement la pince pean sur la souris, exposant ainsi le muscle soléaire.
   2. Épinglez les pinces pean et placez une deuxième boucle de suture autour du tendon proximal du muscle soléaire. Ensuite, coupez le tendon proximal et disséquez le soléaire (y compris les deux boucles de suture attachées) sans muscle gastrocnémien. Placez rapidement le muscle soléaire dans la chambre d’incubation en attachant chaque boucle de suture aux crochets respectifs.
5. Retirer le fascia recouvrant le m. tibialis antérieur (TA) à l’aide d’une pince. Si cela est fait correctement, les tendons distaux des muscles TA et EDL doivent être blancs clairs et visibles; et séparés les uns des autres.
6. Coupez le tendon distal du muscle TA et disséquez le muscle pour des analyses ultérieures (par exemple, génotypage). À l’aide d’une pince, libérez doucement le muscle EDL des tissus environnants, mais laissez le muscle intact et ne coupez pas les tendons. Placez une boucle de suture autour du tendon distal et une deuxième boucle de suture autour du tendon proximal de l’EDL.
7. Ensuite, coupez les tendons libérant le muscle EDL avec deux boucles de suture attachées et placez rapidement le muscle dans la chambre d’incubation en attachant chaque boucle de suture aux crochets respectifs. Afin de ne pas perdre de tension pendant l’incubation et en particulier lors de la contraction électrique des muscles soléaire et EDL, il est d’une grande importance de fixer les boucles de suture autour des tendons avec des nœuds serrés.
8. Enfin, euthanasier l’animal par exemple par luxation cervicale.
9. Lorsque les muscles ont été disséqués et placés dans des chambres d’incubation, ajuster la tension au repos de chaque muscle à ~5 mN et pré-incuber les muscles pendant au moins 10 minutes avant d’initier le protocole expérimental.

4. Absorption de glucose stimulée par l’insuline dans le muscle squelettique isolé de la souris

1. Après l’étape 3.9, remplacer le milieu d’incubation basal par un milieu d’incubation ne contenant pas d’insuline (milieu d’incubation basal), une concentration d’insuline sous-maximale efficace ou une concentration d’insuline d’efficacité maximale et laisser dans les chambres d’incubation pendant 20 min. Espacez chaque chambre d’incubation de 1 min, ce qui laisse le temps pour la récolte ultérieure des muscles.
2. À la fin de la période de stimulation de 20 minutes, remplacez le milieu d’incubation par le milieu d’incubation d’absorption du glucose contenant une concentration identique d’insuline et laissez dans les chambres d’incubation pendant 10 minutes, toujours avec un espacement de 1 minute entre chaque chambre d’incubation.
3. Après 10 min d’incubation dans le milieu d’incubation de l’absorption du glucose, retirez doucement les muscles des chambres d’incubation et lavez-les dans un milieu d’incubation basal glacé. Par la suite, séchez rapidement les muscles sur du papier filtre avant que les boucles de suture ne soient retirées et que les muscles ne soient congelés dans de l’azote liquide. Il est impératif que les muscles incubés soient récoltés rapidement si l’on souhaite également étudier divers métabolites intracellulaires et la signalisation des protéines en plus de l’absorption du glucose.
4. Prélever 100 μL du milieu d’incubation de l’absorption du glucose dans chaque chambre d’incubation et le stocker à -20 °C. La quantité de radioactivité dans ces échantillons sera incluse dans le calcul de l’absorption de glucose musculaire.

5. Absorption de glucose stimulée par la contraction dans le muscle squelettique isolé de la souris

REMARQUE: Pour induire la contraction du muscle squelettique isolé de la souris, utilisez le protocole suivant: 1 train / 15 s, chaque train de 1 s de long composé d’impulsions de 0,2 ms délivrées à 100 Hz. Cependant, d’autres protocoles similaires provoquant la contraction du muscle squelettique isolé de la souris fonctionneront probablement aussi bien. Il est important de noter que la tension doit être ajustée pour générer un développement maximal de la force du muscle incubé, qui dépend de la configuration expérimentale. Si cela n’est pas assuré, vous risquez que toutes les fibres du muscle ne se contractent pas. À son tour, cela peut induire un biais dans l’ensemble de données.

1. Après l’étape 3.9, placez les électrodes de platine au centre et des deux côtés des muscles. Initier la contraction des muscles immédiatement après avoir remplacé le milieu d’incubation basal par le milieu d’incubation d’absorption du glucose. Si possible, espacez chaque chambre d’incubation de 1 min, ce qui laisse le temps pour la récolte ultérieure des muscles. N’oubliez pas d’enregistrer la production de force de chaque muscle incubé.
2. Après 10 min de contraction dans le milieu d’incubation de l’absorption du glucose, retirez les électrodes de platine, recueillez doucement les muscles des chambres d’incubation et lavez-les dans des milieux d’incubation basaux glacés. Par la suite, séchez rapidement les muscles sur du papier filtre avant que les boucles de suture ne soient enlevées et que les muscles ne soient congelés dans de l’azote liquide. Toute la procédure de récolte musculaire doit être effectuée le plus rapidement possible.
3. Prélever 100 μL du milieu d’incubation de l’absorption du glucose dans chaque chambre d’incubation et le stocker à -20 °C. La quantité de radioactivité dans ces échantillons sera incluse dans le calcul de l’absorption de glucose musculaire.

6. Homogénéisation et traitement des muscles squelettiques

REMARQUE: La procédure donnée ci-dessous pour l’homogénéisation musculaire permet de déterminer à la fois l’absorption du glucose et la signalisation myocellulaire par transfert western dans le même ensemble d’échantillons musculaires.

1. Homogénéiser chaque muscle dans 400 μL de tampon glacé avec un pH de 7,5 contenant 10 % de glycérol, 20 mM de pyrophosphate de sodium, 1 % d’IGEPAL CA-630 (NP-40), 2 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (dissous dans de l’isopropanol), 150 mM de NaCl, 50 mM d’HEPES, 20 mM de β-glycérophosphate, 10 mM de fluorure de sodium (NaF), 1 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), 1 mM d’acide glycolétherdiaminetétraacétique (EGTA), 10 μg/ml d’aprotinine, 10 μg/mL de leupéptine, 3 mM de benzamidine et 2 mM d’orthovanadate de sodium à l’aide de billes d’acier et d’un tissu (2 x 45 s à 30 Hz). Faire pivoter tous les homogénats bout à bout pendant 1 h à 4 °C, après quoi ils sont centrifugés à 16 000 x g pendant 20 min à 4 °C. Recueillir le lysat (surnageant) qui est utilisé pour déterminer l’absorption du glucose musculaire.

7. Dosage du 2-désoxyglucose radiomarqué et du mannitol

1. Ajouter 150 μL de chaque lysat musculaire et 25 μL du milieu d’incubation de l’absorption du glucose de chaque chambre d’incubation pour séparer les flacons de comptage de scintillation liquide contenant 2 mL de liquide de scintillation. De plus, préparez deux flacons de contrôle aveugles ne contenant que 3 mL de liquide de scintillation liquide. Fermez tous les flacons et mélangez bien en tourbillonnant chaque flacon pendant environ 5 s.
2. Placer les flacons dans un compteur de scintillation liquide et mesurer la radioactivité de [³H]2-désoxy-D-glucose et [¹⁴C]mannitol conformément aux directives du fabricant. Enregistrer les DPM (désintégrations par minute) pour chaque flacon de scintillation liquide.

8. Calcul des taux d’absorption du glucose musculaire

1. Utilisez le lysat de l’étape 6.1 pour mesurer la concentration totale de protéines dans chaque échantillon musculaire à l’aide de méthodes standard de quantification des protéines (p. ex., acide bicinchoninique ou essais de Bradford). Calculez la quantité de protéines (mg) ajoutée à chaque flacon de scintillation.
   REMARQUE: Le taux d’absorption du glucose pour chaque échantillon musculaire est calculé en soustrayant la quantité de [³H]2-désoxy-D-glucose située dans l’espace extracellulaire de la quantité totale de [³H]2-désoxy-D-glucose dans l’échantillon musculaire en utilisant [¹⁴C]mannitol comme marqueur extracellulaire. On suppose que le [³H]2-désoxy-D-glucose et le [¹⁴C]mannitol présentent des propriétés de diffusion similaires dans le tissu musculaire pendant l’incubation. Effectuez les calculs suivants :
2. Commencez par soustraire le [³H] et [¹⁴C] DPM des échantillons de contrôle aveugles de tous les échantillons de muscles et de milieux.
3. Déterminer l’espace extracellulaire musculaire en μL (μL-ECS) :
   [¹⁴C] Muscle_{DPM /} ([¹⁴C]DPM_media / M_vol)
4. Calculer la quantité de [³H]DPM dans l’espace extracellulaire musculaire ([³H]DPM_ECS) :
   μL-ECS × ([³H]DPM_media / M_vol)
5. Calculer la quantité de [³H]DPM dans l’espace intracellulaire musculaire ([³H]DPM_ICS) :
   [³H] Muscle_DPM− [³H]DPM_ECS
6. Calculer le taux d’absorption du glucose musculaire (μmol / g de protéines / heure):
   [³H] DPM_ICS / ([³H]DPM_media / M_vol) / [2-désoxy-D-glucose])) / mg protéine) / T_h
   REMARQUE: Pour toutes les équations ci-dessus,
   [¹⁴C] Le_muscle DPM est la quantité de radioactivité du [¹⁴C]mannitol dans un échantillon musculaire;
   [¹⁴C] Le_milieu DPM est la quantité de radioactivité du mannitol [¹⁴C] dans un échantillon de milieu;
   [³H] Le_muscle DPM est la quantité de radioactivité [³H]2-désoxy-D-glucose dans un échantillon musculaire;
   [³H] Le_milieuDPM est la quantité de radioactivité [³H]2-désoxy-D-glucose dans un échantillon de milieu;
   [³H] DPM_ECS est la quantité de radioactivité [³H]2-désoxy-D-glucose dans l’espace extracellulaire musculaire;
   [³H] DPM_ICS est la quantité de radioactivité [³H]2-désoxy-D-glucose dans l’espace intracellulaire musculaire;
   μL-ECS est l’espace extracellulaire musculaire en μL;
   M_vol est le volume (μL) des milieux d’incubation utilisés pour le comptage de la scintillation (par exemple, « 25 » comme mentionné ci-dessus);
   T_h est le facteur de temps utilisé pour calculer les taux d’absorption par heure (c.-à-d. « 1/6 » lors de l’incubation des muscles avec un milieu absorbant le glucose pendant 10 minutes)
7. Prenez en considération cet exemple de calcul. Les [³H] et [¹⁴C] DPM des échantillons témoins aveugles (17 et 6, respectivement) ont été soustraits des valeurs DPM mentionnées ci-dessous.
   [¹⁴C] Muscle_DPM: 343
   [¹⁴C] Supports_{DPM :} 11846
   [³H] Muscle_DPM: 4467
   [³H] Média_{DPM :} 39814
   M_vol: 25
   mg de protéines : 0,396 (dans 150 μL de lysat de protéines musculaires)
   [2-désoxy-D-glucose]: 1 (mM)
   T_h: 1/6 (h)
   μL-ECS = 343 DPM / (11846 DPM / 25 μL) = 0,724 μL
   [³H] ECS DPM : 0,724 μL × (39814 DPM / 25 μL) = 1153 DPM
   [³H] DPM_ICS: 4467 DPM - 1153 DPM = 3314 DPM
   Absorption de glucose: ((3314 DPM / (39814 DPM / 25 μL) / 1 mmol / L) / 0,396 mg de protéines) / (1/6 heure) = 31,53 μmol / g de protéines / heure

9. Analyses SDS-PAGE et Western Blot

1. Préparer les lysats musculaires soléaire et EDL dans un tampon laemmli et chauffer pendant 5 min à 96 °C.
2. Séparez des quantités égales de protéines musculaires par SDS-PAGE sur des gels auto-moulés et transférez les protéines dans les membranes de fluorure de polyvinylidène par buvard semi-sec.
3. Par la suite, incuber des membranes dans une solution saline tamponnée Tris contenant 0,05 % de lait écrémé Tween 20 et 2 % et des membranes sondeuses avec des anticorps primaires et secondaires pertinents.
4. Détectez les protéines avec chimiluminescence et visualisez-les par un système d’imagerie numérique.

10. Glycogène musculaire, nucléotides, lactate, créatine et phosphocréatine

1. Utilisez de l’acide perchlorique pour extraire des échantillons de muscle EDL et soleus.
2. Par la suite, neutralisez les échantillons et analysez-les pour le lactate, la créatine et la phosphocréatine comme décrit précédemment¹⁸.
3. Analyser la teneur en nucléotides dans l’EDL et le muscle soléaire par CLHP en phase inverse après extraction dans l’acide perchlorique.
4. Déterminer la teneur en glycogène musculaire dans l’homogénat musculaire entier sous forme d’unités glycosyliques après hydrolyse acide par une méthode fluorométrique décrite précédemment¹⁸.

11. Statistiques

1. Effectuer des analyses statistiques avec un logiciel d’analyses statistiques.
2. Utilisez un test d’analyse bidirectionnelle de la variance (ANOVA) pour évaluer les différences statistiques entre les valeurs présentées dans le tableau 1.
3. Utilisez des tests t d’étudiant non appariés pour évaluer les différences statistiques dans l’absorption du glucose entre l’EDL et le soléaire au sein de chaque groupe présenté à la figure 2. Présenter les données comme moyens ±'erreur-type de la moyenne (SEM). P < 0,05 est considéré comme statistiquement significatif.

Résultats

Comme le montre la figure 2, les taux d’absorption du glucose basal étaient similaires entre le soléaire isolé et le muscle EDL de souris femelles. Cela a également été signalé plusieurs fois avant 12,13,19,20. L’absorption de glucose a augmenté d’environ 0,8 et ~0,6 fois, atteignant 12 et 9 μmol / g de protéines / h...

Discussion

Une régulation intacte de l’absorption du glucose dans le muscle squelettique est importante pour préserver la santé globale¹. Ainsi, l’étude de l’absorption du glucose musculaire sert souvent de lecture primaire lors de l’évaluation de diverses interventions altérant la santé. Nous décrivons ici une méthode ex vivo pour mesurer l’absorption du glucose dans le soléus isolé et incubé et le muscle EDL de souris en réponse à l’insuline et aux contractions induites électriqu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
[14C]D-mannitol	American Radiolabeled Chemicals, Inc.	ARC 0127
[3H]2-deoxy-D-glucose	American Radiolabeled Chemicals, Inc.	ART 0103A
2-Deoxy-D-glucose	Sigma	D8375
4-0 USP non-sterile surgical nylon suture	Harvard Apparatus	51-7698
Streptavidin/HRP (Conjugate)	DAKO	P0397	Used to detect ACC protein
Akt2 antibody	Cell Signaling	3063
AMPKα2 antibody	Santa Cruz	SC-19131
aprotinin	Sigma	A1153
benzamidine	Sigma	B6505
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A7030
CaCl2	Merck	1020831000
Calibration kit (force)	Danish Myo Technology A/S	300041
Chemiluminescence	Millipore	WBLUF0500
D-Glucose	Merck	1084180100
D-Mannitol	Sigma	M4125
Data collection program	National Instruments	LabVIEW software version 7.1
Dialysis tubing	Visking	DTV.12000.09 Size No.9
Digital imaging system	BioRad	ChemiDoc MP
EDTA	Sigma EDS	E9884
EGTA	Sigma	E4378
Electrical Pulse Stimulator	Digitimer	D330 MultiStim System
Glycerol	Sigma	G7757
HEPES	Sigma	H7637
IGEPAL CA-630	Sigma	I8896
Insulin	Novo Nordisk	Actrapid, 100 IE/mL
KCl	Merck	1049361000
KH2PO4	Merck	104873025
leupeptin	Sigma	L2884
MgSO4	Merck	1058860500
Muscle Strip Myograph System	Danish Myo Technology A/S	Model 820MS
Na-Orthovanadate	Sigma	S6508
Na-Pyrophosphate	Sigma	221368
Na-Pyruvate	Sigma	P2256
NaCl	Merck	106041000
NaF	Sigma	S1504
NaHCO3	VWR	27778260
pACC Ser212 antibody	Cell Signaling	3661
pAkt Thr308 antibody	Cell Signaling	9275
pAMPK Thr172 antibody	Cell Signaling	2531
phenylmethylsulfonylfluoride	Sigma	P7626
Platinum electrodes	Danish Myo Technology A/S	300145
pTBC1D4 Ser588 antibody	Cell Signaling	8730
Scintillation counter	Perkin Elmer	Tri-Carb-2910TR
Scintillation fluid	Perkin Elmer	6013329
Statistical analyses software	Systat	SigmaPlot version 14
TBC1D4 antibody	Abcam	ab189890
TissueLyser II	Qiagen	85300
Ultrapure water	Merck	Milli-Q Reference A+ System
β-glycerophosphate	Sigma	G9422