JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

أنشأنا الظروف لثقافة الخلايا السلف العصبي من المنطقة دون البطينية و gyrus dentate من الدماغ الكبار من فولز، كدراسة تكميلية في المختبر، لتحليل الاختلافات التي تعتمد على الجنس بين المنافذ العصبية التي يمكن أن تكون جزءا من التغييرات البلاستيكية الوظيفية المرتبطة بالسلوكيات الاجتماعية.

Abstract

المغنطيس العصبي هي مجاميع الخلايا الأولية التي تضم الخلايا الجذعية العصبية والخلايا السلف. هذه الهياكل ثلاثية الأبعاد هي أداة ممتازة لتحديد التمايز واحتمالات الانتشار للخلايا الجذعية العصبية ، وكذلك لتوليد خطوط الخلايا مما يمكن أن يكون مقايسة مع مرور الوقت. أيضا، يمكن أن تخلق neurospheres مكانة (في المختبر) الذي يسمح نموس بيئة متغيرة ديناميكية، مثل عوامل النمو المختلفة، والهرمونات، والناقلات العصبية، من بين أمور أخرى. ميكروتوس ochrogaster (المرج فول) هو نموذج فريد لفهم الأساس العصبي البيولوجي للسلوكيات الاجتماعية والجنسية والإدراك الاجتماعي. ومع ذلك، فإن الآليات الخلوية المشاركة في هذه السلوكيات ليست معروفة جيدا. ويهدف البروتوكول إلى الحصول على خلايا السلف العصبي من محاريب عصبية من فول البراري الكبار، التي يتم استزراعها في ظل ظروف غير منسجمة، لتوليد الخلايا العصبية. يعتمد حجم وعدد الخلايا العصبية على المنطقة (المنطقة دون البطينية أو الجيروسكوبات) وجنس المرج. هذه الطريقة هي أداة رائعة لدراسة الاختلافات المعتمدة على الجنس في المنافذ العصبية في المختبر وتغيرات المرونة العصبية المرتبطة بالسلوكيات الاجتماعية مثل الترابط بين الزوجين والرعاية بين الوالدين. أيضا، يمكن فحص الظروف المعرفية التي تنطوي على العجز في التفاعلات الاجتماعية (اضطرابات طيف التوحد والفصام).

Introduction

و vole المرج(ميكروتوس ochrogaster)، وهو عضو في الأسرة Cricetidae ، هو الثدييات الصغيرة التي تتطور استراتيجية الحياة كنوع أحادية الزواج اجتماعيا ومؤنس للغاية. كل من الذكور والإناث إقامة علاقة الزوج دائم بعد التزاوج أو فترات طويلة من التعايش التي تتميز تقاسم العش، والدفاع عن أراضيهم، وعرض الرعاية بين الوالدين لذريتهم1،2،3،4. وهكذا، فإن المرج فول هو نموذج قيم لفهم الأساس العصبي البيولوجي للسلوك الاجتماعي والجنسي والعاهات في الإدراك الاجتماعي5.

النشوء العصبي للبالغين هي واحدة من العمليات الأكثر أهمية لللدونة العصبية التي تؤدي إلى تغييرات سلوكية. على سبيل المثال، ذكرت مجموعتنا البحثية في ذكور أن التعايش الاجتماعي مع التزاوج يزيد من انتشار الخلايا في المنطقة دون البطينية (VZ) والمنطقة دون الرعية في الجيروسكوب (DG) من قرن آمون، مما يشير إلى أن التكاثر العصبي للبالغين يمكن أن يلعب دورًا في تكوين الترابط الناجم عن التزاوج في البراري (البيانات غير المنشورة). من ناحية أخرى، على الرغم من أن مناطق الدماغ حيث يتم توليد الخلايا العصبية الجديدة ومتكاملة معروفة جيدا، والآليات الجزيئية والخلوية المشاركة في هذه العمليات لا تزال غير محددة بسبب العيوب التقنية في نموذج الدماغ كله6. على سبيل المثال، مسارات الإشارة التي تتحكم في التعبير الجيني والأنشطة الخلوية الأخرى لها فترة تنشيط قصيرة نسبيا (الكشف عن phosphoproteome)7. نموذج بديل واحد هو الخلايا الجذعية العصبية البالغة المعزولة والمزاجة أو الخلايا السلف لتوضيح المكونات الجزيئية المشاركة في تكوين الأعصاب للبالغين.

كان النهج الأول للحفاظ على السلائف العصبية في المختبر من الثدييات البالغة (الفأرة) الدماغ هو مقايسة من الخلايا العصبية ، والتي هي المجاميع الخلوية التي تنمو في ظل ظروف غير مطيعة التي تحافظ على إمكاناتها متعددة القدرات لتوليد الخلايا العصبية ، وكذلك الخلايا الفلكية8،9،10. خلال تطورها، وهناك عملية اختيار حيث السلائف فقط سوف تستجيب لميوجين مثل عامل النمو البشرة (EGF) وعامل النمو الليفي 2 (FGF2) لتكاثر وتوليد الخلايا العصبية8،9،10.

على حد علمنا، لم يتم الإبلاغ عن أي بروتوكول في الأدب للحصول على السلف العصبية الكبار من voles. هنا، أنشأنا ظروف الثقافة لعزل السلف العصبية من المنافذ العصبية وصيانة في المختبر من خلال فحص تشكيل الغلاف العصبي. وهكذا، يمكن تصميم التجارب لتحديد الآليات الجزيئية والخلوية التي تشارك في انتشار وهجرة وتمايز وبقاء الخلايا الجذعية العصبية وذرية، وهي عمليات لا تزال غير معروفة في المرج. وعلاوة على ذلك، يمكن توضيح الاختلافات في المختبر في خصائص الخلايا المستمدة من VZ وDG تقديم معلومات حول دور المنافذ العصبية في اللدونة العصبية المرتبطة بالتغيرات في السلوك الاجتماعي والجنسي والسلوكيات المعرفية، والعجز في التفاعلات الاجتماعية (اضطراب طيف التوحد والفصام)، والتي يمكن أن تكون أيضا تعتمد على الجنس.

Protocol

وقد وافقت على الدراسة لجنة أخلاقيات البحوث التابعة لـ معهد علم الأعصاب، وجامعة المكسيك الوطنية المستقلة، والمكسيك، والمعهد الوطني للبيطن (2018-1-163). وقد أنشئت النهايات الإنجابية والرعاية والإنسانية للحيوانات وفقا للمعيار المكسيكي الرسمي (NOM-062-Z00-1999) القائم على "القانون العام لـ Ley General de Salud en Materia de Investigación para la Salud" (القانون العام للصحة للبحوث الصحية) الذي وضعه الأمين المكسيكي للصحة.

1- الحلول وإعداد المخزونات

  1. إعداد متوسط ثقافة N2 مع 485 مل من Dulbecco معدلة النسر متوسط F12 (DMEM-F12), 5 مل من الملحق N2 (100x), 5 مل من الملحق الجلوتامين (100x) و 5 مل من مضاد للمضادات الحيوية (100x).
  2. إعداد ثقافة B27 المتوسطة مع 480 مل من المتوسط العصبي، 10 مل من ملحق B27 (50x)، 5 مل من الملحق الجلوتامين، و 5 مل من المضادات الحيوية المضادة للحمامي (100x).
  3. إعادة تكوين مسحوق الكولاجين في 1x PBS (الفوسفات المخزنة المالحة) للحصول على aliquots مع نشاط 100 وحدة / μL (1000x) وتخزينها في -20 درجة مئوية. إشعار، والنشاط collagenase يعتمد على عدد الكثير من الشركات.
  4. إعداد الأسهم dispase aliquots عن طريق حل 5 ملغ من مسحوق dispase في 1x PBS (50 ملغ / مل). يُخزن عند -20 درجة مئوية.
  5. إعداد محلول انزيمي مع 100 مل من DMEM-F12 المتوسطة، 50 ميكرولتر من الكولاجيناز المخزون (100 وحدة/ميكرولتر) أن يكون تركيز النهائي من 50 U/ مل و 333 μL من dispase الأسهم (50 ملغ / مل) أن يكون تركيز النهائي من 0.33 ملغ / مل.
  6. لإعداد محلول الغسيل، إلى 1000 مل من 1x PBS، إضافة 0.4766 غرام من HEPES (التركيز النهائي 2 mM)، 3.6 غرام من د-جلوكو (التركيز النهائي 20 مل م) و 2.1 غرام من NAHCO3 (التركيز النهائي 25 mM).
  7. إعداد بولي-L-ornithine الأسهم aliquots (1 ملغ / مل) باستخدام الماء المعقم وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  8. إعداد حل عمل من بولي-L-أورنيثين. تخفيف aliquot الأسهم (1mg / مل) في 49 مل من الماء المعقم لتركيز النهائي من 20 ميكروغرام / مل.
  9. إعداد حل العمل من اللامينين. تخفيف 25 ميكرولتر من اللامينين (1 ملغ / مل المخزون الأصلي) في 5 مل من الماء المعقم لتركيز النهائي من 5 ميكروغرام / مل.
    ملاحظة: بعد التحضير، قم بتصفية وسائل الإعلام الثقافية، وحلول العمل والأسهم لتجنب التلوث. استخدام محاقن أو زجاجة أعلى فراغ مرشحات (غشاء polyethersulfone مع حجم المسام 0.2 μm). يمكن تخزين وسائل الإعلام والثقافة وحلول العمل لمدة تصل إلى 30 يوما في 4 درجة مئوية، في حين يمكن تخزين المخزونات لمدة تصل إلى أربعة أشهر في -20 درجة مئوية.

2. التحضير قبل البدء في microdissection

  1. تعقيم الأدوات الجراحية عن طريق autoclaving أو مع مع تعقيم الزجاج الساخن الخرز الجاف.
  2. تنظيف مساحة سطح microdissection في ظل ظروف مطهرة ومطهرة صارمة (على سبيل المثال، مع المياه ozonized).
    ملاحظة: توقيت microdissection من كل من المنافذ العصبية من كل الدماغ فول هو ما يقرب من 30 دقيقة. ينصح العمل مع 1-4 الحيوانات لإجراء كامل.

3. استخراج الدماغ كله

  1. تخدير فول الكبار (12-16 أسبوعا) مع جرعة زائدة من pentobarbital (6.3 ملغ / حيوان) من خلال الحقن داخل الصفاق. تحقق من عمق التخدير عن طريق عدم وجود رد فعل دواسة ردا على قرصة إصبع القدم شركة.
  2. مرة واحدة vole هو تخدير تماما، والحث القتل الرحيم عن طريق قطع الرأس واستعادة الرأس.
  3. تشريح الجلد من الجمجمة مع مقص، مما يجعل شق السدية -مجرى (15 مم طويلة) لفضح الجمجمة.
  4. قطع العظام القذالي والبطني وتتبع شق في الجمجمة على طول الغرز القوس والجرايلي.
  5. جعل ثقب في الجمجمة عند تقاطع العظام الأمامية والضجيجة باستخدام مقص، مع الحرص الشديد على عدم تلف أنسجة الدماغ.
  6. لفضح الدماغ، وإزالة شظايا الجمجمة المتبقية التي تغطي نصفي الكرة الأرضية في الدماغ مع ملاقط حادة وأشار.
  7. استخدم ملعقة من الفولاذ المقاوم للصدأ لرفع الدماغ بأكمله من قاعدة الجمجمة.
  8. جمع الدماغ في أنبوب الطرد المركزي (50 مل) مع 20 مل من محلول غسل الباردة.
  9. غسل الدماغ مرتين مع محلول غسل الباردة.

4. ميكروديستيكشن من الأنسجة العصبية

  1. ضع طبق بيتري على سطح محاط بالثلج.
  2. إيداع الدماغ على الطبق وإضافة 20 مل من محلول غسل الباردة.
  3. مع مشرط، في الطائرة التاجية، وتقسيم الدماغ إلى كتلتين من الأنسجة (روسترال وcaudal). كمرجع عصبي، تنفيذ قطع التاجية على مستوى Bregma في المحور الأمامي11 (الشكل 1A، خط صلب).
  4. من كتلة rostral، واستخراج VZ الأنسجة (الشكل 1B)، في حين من كتلة السد إزالة DG (الشكل 1C).
  5. تشريح VZ تحت مجهر ستيريو.
    1. مع ملقط دومون، عقد واحد من نصفي الكرة الأرضية. ثم، إدراج، في ذروة البطين، نصائح غرامة من ملقط Dumont الثانية تحت الأنسجة التي خطوط caudate-putamen (الشكل 2A).
    2. فتح ملقط على طول محور دورسوفينتورال لفصل الأنسجة.
    3. جمع VZ الأنسجة للفرد الواحد في أنبوب الطرد المركزي مع 2 مل من محلول غسل الباردة. لا تجمع نسيج أكثر من حيوانين.
    4. كرر microdissection في نصف الكرة الأرضية الأخرى.
    5. تخزين أنبوب يحتوي على أنسجة VZ الثنائية على الجليد ومواصلة تشريح DG.
  6. تشريح DG من كتلة caudal تحت مجهر ستيريو.
    1. مع مشرط، وجعل قطع التاجية في كتلة للحصول على شريحتين، والتي لوحظ تشكيل قرن آمون. كمعلم, يتم قطع في -2 مم Bregma إحداثيات في المحور الأمامي الأمامي وفقا لأطلس دماغ الماوس11 (الشكل 1A, خط منقط والشكل 1C).
    2. مع ملقط Dumont، عقد واحدة من شرائح، ومع غرامة نقطة دومون ملقط جعل قطع أفقي بين DG وCA1 ثم تنفيذ شق عمودي بين DG وCA3 لفصل DG (الشكل 2B).
    3. كرر التشريح في الشريحة الأولى من نصف الكرة الأرضية الآخر.
    4. كرر التشريح في نصفي الكرة الأرضية في الشريحة الثانية.
    5. جمع أربع قطع DG من كل فول في أنبوب الطرد المركزي. لا تجمع أنسجة DG لأكثر من حيوانين.
      ملاحظة: إذا كان هناك حاجة إلى تشريح أكثر من واحد، قم بتخزين أنابيب الطرد المركزي مع أنسجة VZ أو DG على الجليد مع الاستمرار في تشريح بقية الأدمغة. إزالة جميع الأوعية الدموية التي تغطي أنسجة الدماغ أثناء تشريح. إذا لم يتم التخلص من الأوعية ، يمكن خلط الثقافة مع فائض من كريات الدم الحمراء وتشكيل الغلاف العصبي الانزعاج.

5. عزل الخلايا العصبية

  1. ضع أنابيب الطرد المركزي داخل مجلس الوزراء السلامة الحيوية وانتظر حوالي 10 دقائق لشظايا الأنسجة للترسب بالجاذبية.
  2. إزالة محلول غسل وإضافة 1 مل من محلول الأنزيمية الدافئة لكل أنبوب.
  3. احتضان الأنابيب في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  4. تفكيك شظايا الأنسجة؛ ماصة صعودا وهبوطا مع طرف 1 مل. لا الماصات أكثر من 30x.
  5. تنفيذ حضانة ثانية من 10 دقيقة في 37 درجة مئوية.
  6. في نهاية الحضانة الثانية، ماصة لتفريق الأنسجة. لا الماصات أكثر من 30x.
    ملاحظة: بعد الأنابيب، يجب أن تتفكك تماما شظايا الأنسجة؛ إذا لم يتم تفكيكها، احتضان لآخر 10 دقيقة في 37 درجة مئوية وإعادة ماصات. يجب أن لا تتجاوز فترة الهضم 30 دقيقة.
  7. إضافة 9 مل من N2 المتوسطة في أنبوب لتخفيف العلاج الأنزيمية.
  8. الطرد المركزي الأنابيب في 200 × ز لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  9. تجاهل افرا وغسل مع 10 مل من N2 المتوسطة.
  10. أجهزة الطرد المركزي في نفس الظروف التي كانت عليها الخطوة 5-8.
  11. إزالة افرنح من كل أنبوب وإعادة الكريات الخلية من VZ وDG في 2 مل و 1 مل من متوسطة B27، على التوالي.
  12. لإزالة أي أنسجة غير مفككة، قم بتصفية كل تعليق خلوي باستخدام مصفاة خلايا (مقاس 40 ميكرومتر).

6. تشكيل المغنطيس العصبي

  1. الثقافة مرت الخلايا من خلال مصفاة في مرفق منخفضة جدا، لوحة 24-جيدا. استخدام اثنين من الآبار لVZ وبُرّة واحدة لـ DG (1 مل من B27 متوسطة / بئر).
  2. إضافة 20 نانوغرام/مل من FGF2 و 20 نانوغرام/مل من EGF إلى كل بئر (التركيز النهائي 1x).
  3. احتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 والرطوبة العالية (90-95٪). لا تزعج لمدة 48 ساعة (اليوم 1 واليوم 2 من الثقافة، D1-D2).
  4. في اليوم الثالث (D3)، إزالة نصف المتوسط الثقافة واستبدالها بـ B27 المتوسطة الطازجة (500 ميكرولتر في البئر) تستكمل مع تركيز مزدوج (2x) من عوامل النمو.
  5. كرر كل يوم ثالث، وتغيير الوسط الثقافة (نصفه) واستبدالها مع متوسطة B27 جديدة تكملها مع تركيز مزدوج (2x) من عوامل النمو.
  6. في الأيام التي لا يكون فيها من الضروري تغيير الوسط الثقافي، أضف عوامل نمو إلى تركيز نهائي قدره 1x.
  7. تأكد من تشكيل الـ neurospheres حول D8-D10.
  8. في D10، قم بتغيير الوسيلة الكاملة للثقافة لإزالة جميع الحطام.
    1. جمع الوسيط والغلاف العصبي بشكل فردي من كل بئر في أنابيب الطرد المركزي.
    2. احتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. يسمح هذا الإجراء بتساقط الأمطار بواسطة الجاذبية في المناطق العصبية.
    3. إزالة افرا و resuspend في 1 مل من B27 المتوسطة الطازجة تكملها عوامل النمو.
    4. ضع الـ neurospheres مرة أخرى في نفس لوحة المرفق المنخفضة للغاية واحتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
  9. من D10 إلى D15، استمر في تغيير نصف المتوسط وإضافة عوامل النمو.

7- مرور الـ"اعصاب"

  1. في D15 من الثقافة الأولية، وجمع neurospheres في أنابيب الطرد المركزي باستخدام ماصة 1 مل. قطع تلميح ماصة لزيادة حجم فتحة لتجنب تلف في neurospheres.
  2. احتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تترسب المغنطيس العصبي بالجاذبية.
  3. إزالة المتوسطة وإضافة 1 مل من متوسطة مفرزة الخلية لكل أنبوب.
  4. احتضان الأنابيب لمدة 7 دقائق في 37 درجة مئوية.
  5. الماصات صعودا وهبوطا مع طرف 1 مل لتفكيك neurospheres.
  6. تخفيف الخلية مفرزة المتوسطة مع 3 مل من B27 المتوسطة لكل أنبوب.
  7. الطرد المركزي تعليق الخلية لمدة 5 دقائق في 200 × ز.
  8. تجاهل افرا و resuspend كل بيليه الخلية مع متوسطة B27 جديدة تستكمل مع عوامل النمو.
    1. resuspend الخلايا المشتقة من VZ في 4 مل من المتوسطة والخلايا المستمدة من DG في 2 مل من المتوسطة.
  9. زراعة الخلايا (المقطع 1) في لوحة مرفقات جديدة منخفضة للغاية بمضاعفة عدد الآبار التي استخدمت في الثقافة الأولية (4 و 2 بئرين لـ VZ و DG على التوالي).
  10. تغيير نصف المتوسط كل ثلاثة أيام وإضافة عوامل النمو يوميا.
  11. بعد 10 أيام (D10) في مرور 1، تغيير إلى شروط التمسك في المقطع التالي.

8. مرور في شروط مُتَلَكِمَة

  1. قبل تنفيذ الممر 2، إعداد لوحات المغلفة مع بولي-L-أورنيثين واللامينين.
    1. في 24-صحون جيدا، إضافة 500 ميكرولتر من 1x بولي-L-أورنيثين (20 ميكروغرام/مل) في البئر. احتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    2. إزالة بولي-L-ornithine وغسل 4x مع 1X PBS (500 ميكرولتر/ جيدا).
    3. إضافة 200 ميكرولتر (الحد الأدنى لحجم لتغطية سطح بئر واحد) من 1x لامينين (5 ميكروغرام / مل) في البئر واحتضان لمدة 2-3 ساعة في 37 درجة مئوية قبل زراعة الخلايا.
  2. جمع neurospheres مع ماصة 1 مل مع نصائح قطع في أنبوب الطرد المركزي.
  3. احتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لترسب في neurospheres الجاذبية.
  4. تخلص من اابر و اعادة اأطنان الاعصاب في طازج B27 المتوسطة بدون عوامل نمو.
  5. التعرق في laminin من لوحة المغلفة وإيداع الاعصاب في الآبار باستخدام ماصات 1 مل مع نصائح قطع.
    ملاحظة: منع الآبار المغلفة من الجفاف بين إزالة اللامينان والطلاء العصابي.
  6. تقسيم الثقافة إلى شرطين:
    1. الحفاظ على القطاعات العصبية المتمايزة لمدة 6 أيام (D6). تغيير الوسط كل يوم ثالث وإضافة عوامل النمو يوميا.
    2. مراقبة تمايز الخلايا المشتقة من الغلاف العصبي بنسبة 12 يوما (D12). تغيير الوسط كل ثلاثة أيام دون عوامل النمو.
      ملاحظة: في نهاية D6 لD12 أو غير متمايزة لشروط التمايز، يمكن استخدام الخلايا للكيمياء المناعية التقليدية، وتحليل فرز الخلايا، 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) تلطيخ، استخراج RNA، من بين أمور أخرى.

النتائج

تشكلت الخلايا العصبية من الخلايا الجذعية العصبية المعزولة عن VZ وDG لكل من الإناث والذكور الكبار البراري voles. حوالي 8-10 أيام بعد بدء الثقافة، يجب أن تكون الخلايا قد شكلت neurospheres. لاحظ أن اللوحة قد تحتوي على حطام في الثقافة الأولية (الشكل 3A). ومع ذلك، في مرور 1 يجب أن تتكون الثقافة...

Discussion

مرحلة للحصول على ثقافة الخلايا الجذعية العصبية هي فترة الهضم مع محلول انزيمي، والتي يجب ألا تتجاوز أكثر من 30 دقيقة لأنها قد تقلل من صلاحية الخلية. وينبغي أن تظهر في 8-10 أيام من الاستزراع الأولي. إذا لم تظهر في اليوم 12 ، وتجاهل الثقافة وتكرار التجربة ، والحد من فترة الهضم. وثمة مسألة أخرى هي ا?...

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

وقد دعم هذا البحث من المنح الوطنية الوطنية 252756 و253631؛ UNAM-DGAPA-PAPIIT IN202818 و IN203518; INPER 2018-1-163، وNIH P51OD11132. ونشكر ديسي غاسكا، وكارلوس لوزانو، ومارتين غارسيا، وألياندرا كاستيا، ونيديا هرنانديز، وجيسيكا نوريس، وسوزانا كاسترو على مساعدتهم التقنية الممتازة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AntibodiesAntibody ID
Anti-NestinGeneTexGTX30671RRID:AB_625325
Anti-DoublecortinMERCKAB2253RRID:AB_1586992
Anti-Ki67Abcamab66155RRID:AB_1140752
Anti-MAP2GeneTexGTX50810RRID:AB_11170769
Anti-GFAPSIGMAG3893RRID:AB_477010
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-11029RRID:AB_2534088
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA-11036RRID:AB_10563566
Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-11073RRID:AB_2534117
Culture reagents
Antibiotic-AntimycoticThermo Fisher Scientific/Gibco15240062100X
B-27 supplementThermo Fisher Scientific/Gibco1750404450X
Collagenase, Type IVThermo Fisher Scientific/Gibco17104019Powder
DispaseThermo Fisher Scientific/Gibco17105041Powder
DMEM/F12, HEPESThermo Fisher Scientific/Gibco11330032
Glucoseany brandPowder, Cell Culture Grade
GlutaMAXThermo Fisher Scientific/Gibco35050061100X
HEPESany brandPowder, Cell Culture Grade
Mouse LamininCorning3542321 mg/mL
N-2 supplementThermo Fisher Scientific/Gibco17502048100X
NAHCO3any brandPowder, Suitable for Cell Culture
NeurobasalThermo Fisher Scientific/Gibco21103049
Phosphate-Buffered Saline (PBS)Thermo Fisher Scientific/Gibco100100231X
Poly-L-ornithine hydrobromideSigma-AldrichP3655Powder
Recombinant Human EGFPeprotechAF-100-15
Recombinant Human FGF-basicPeprotechAF-100-18B
StemPro Accutase Cell Dissociation ReagentThermo Fisher Scientific/GibcoA1110501100 mL
Disposable material
24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well PlatesCorning/Costar3473
24-well Clear TC-treated Multiple Well PlatesCorning/Costar3526
40 µm Cell StrainerCorning/Falcon352340Blue
Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 µm poreCorning431118PES membrane, 45 mm diameter neck
Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tubeany brandwith conical bottom
Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl.any brand
Sterile cotton gauzes
Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mLany brand
Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mLany brand
Sterile surgical glovesany brand
Syringe Filters, 0.22 µm poreMerk MilliporeSLGPR33RBPolyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter
Equipment and surgical instruments
Biological safety cabinet
Dissecting Scissors
Dumont Forceps
Motorized Pipet Filler/Dispenser
Micropipettes
Petri Dishes
Scalpel Blades
Stainless-steel Spatula

References

  1. Portillo, W., Paredes, R. G. Motivational Drive in Non-copulating and Socially Monogamous Mammals. Frontiers Behavioral Neuroscience. 13, 238 (2019).
  2. Walum, H., Young, L. J. The neural mechanisms and circuitry of the pair bond. Nature Reviews Neurosciences. 19 (11), 643-654 (2018).
  3. Gobrogge, K. L. Sex, drugs, and violence: neuromodulation of attachment and conflict in voles. Current Topics Behavioral Neurosciences. 17, 229-264 (2014).
  4. Perkeybile, A. M., Bales, K. L. Intergenerational transmission of sociality: the role of parents in shaping social behavior in monogamous and non-monogamous species. Journal of Experimental Biology. 220, 114-123 (2017).
  5. McGraw, L. A., Young, L. J. The prairie vole: an emerging model organism for understanding the social brain. Trends in Neuroscience. 33 (2), 103-109 (2010).
  6. Fowler, C. D., Liu, Y., Ouimet, C., Wang, Z. The effects of social environment on adult neurogenesis in the female prairie vole. Journal of Neurobiology. 51 (2), 115-128 (2002).
  7. Yang, P., et al. Multi-omic Profiling Reveals Dynamics of the Phased Progression of Pluripotency. Cell Systems. 8 (5), 427-445 (2019).
  8. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
  9. Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. Journal of Neurosciences. 16 (3), 1091-1100 (1996).
  10. Ostenfeld, T., Svendsen, C. N. Requirement for neurogenesis to proceed through the division of neuronal progenitors following differentiation of epidermal growth factor and fibroblast growth factor-2-responsive human neural stem cells. Stem Cells. 22 (5), 798-811 (2004).
  11. Paxinos, G., Keith, B. J. F. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).
  12. Conti, L., Cattaneo, E. Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities. Nature Reviews Neuroscience. 11 (3), 176-187 (2010).
  13. Lieberwirth, C., Liu, Y., Jia, X., Wang, Z. Social isolation impairs adult neurogenesis in the limbic system and alters behaviors in female prairie voles. Hormones and Behavior. 62 (4), 357-366 (2012).
  14. Ruscio, M. G., et al. Pup exposure elicits hippocampal cell proliferation in the prairie vole. Behavioral Brain Research. 187 (1), 9-16 (2008).
  15. Wojtowicz, J. M., Kee, N. BrdU assay for neurogenesis in rodents. Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).
  16. Eack, S. M., et al. Commonalities in social and non-social cognitive impairments in adults with autism spectrum disorder and schizophrenia. Schizophrenia Research. 148 (1-3), 24-28 (2013).
  17. Pinkham, A. E., et al. Comprehensive comparison of social cognitive performance in autism spectrum disorder and schizophrenia. Psychological Medicine. , 1-9 (2019).
  18. Yirmiya, N., et al. Association between the arginine vasopressin 1a receptor (AVPR1a) gene and autism in a family-based study: mediation by socialization skills. Molecular Psychiatry. 11 (5), 488-494 (2006).
  19. Montag, C., et al. Oxytocin and oxytocin receptor gene polymorphisms and risk for schizophrenia: a case-control study. The World Journal of Biological Psychiatry. 14 (7), 500-508 (2013).
  20. Harony, H., Wagner, S. The contribution of oxytocin and vasopressin to mammalian social behavior: potential role in autism spectrum disorder. Neurosignals. 18 (2), 82-97 (2010).
  21. Bachner-Melman, R., Ebstein, R. P. The role of oxytocin and vasopressin in emotional and social behaviors. Handbook of Clinical Neurology. 124, 53-68 (2014).
  22. Wegiel, J., et al. The neuropathology of autism: defects of neurogenesis and neuronal migration, and dysplastic changes. Acta Neuropathologica. 119 (6), 755-770 (2010).
  23. Kaushik, G., Zarbalis, K. S. Prenatal Neurogenesis in Autism Spectrum Disorders. Frontiers in Chemistry. 4, 12 (2016).
  24. Sheu, J. R., et al. A Critical Period for the Development of Schizophrenia-Like Pathology by Aberrant Postnatal Neurogenesis. Frontiers in Neuroscience. 13, 635 (2019).
  25. Donaldson, Z. R., Young, L. J. The relative contribution of proximal 5' flanking sequence and microsatellite variation on brain vasopressin 1a receptor (Avpr1a) gene expression and behavior. PLoS Genetics. 9 (8), 1003729 (2013).
  26. Rice, M. A., Hobbs, L. E., Wallace, K. J., Ophir, A. G. Cryptic sexual dimorphism in spatial memory and hippocampal oxytocin receptors in prairie voles (Microtus ochrogaster). Hormones and Behavior. 95, 94-102 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

160

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved