Cultura de las Neuroesferas Derivadas de los Nichos Neurogénicos en Voles de La Pradera Adulta

Resumen

Establecimos las condiciones para cultivar células progenitoras neuronales de la zona subventricular y dennato gyrus del cerebro adulto de las praderas voles, como un estudio in vitro complementario, para analizar las diferencias dependientes del sexo entre nichos neurogénicos que podrían ser parte de los cambios plásticos funcionales asociados con los comportamientos sociales.

Resumen

Las neuroesferas son agregados de células primarias que comprenden células madre neurales y células progenitoras. Estas estructuras 3D son una excelente herramienta para determinar el potencial de diferenciación y proliferación de las células madre neurales, así como para generar líneas celulares que se pueden probar con el tiempo. Además, las neuroesferas pueden crear un nicho (in vitro) que permite el modelado del entorno de cambio dinámico, como factores de crecimiento variables, hormonas, neurotransmisores, entre otros. Microtus ochrogaster (prairie vole) es un modelo único para entender la base neurobiológica de los comportamientos socio-sexuales y la cognición social. Sin embargo, los mecanismos celulares involucrados en estos comportamientos no son bien conocidos. El protocolo tiene como objetivo obtener células progenitoras neuronales de los nichos neurogénicos de la pradera adulta vole, que se cultivan en condiciones no adherentes, para generar neuroesferas. El tamaño y el número de neuroesferas dependen de la región (zona subventricular o giro dentado) y el sexo de la pradera vole. Este método es una herramienta notable para estudiar las diferencias dependientes del sexo en nichos neurogénicos in vitro y los cambios de neuroplasticidad asociados con comportamientos sociales como la unión de pares y la atención biparental. Además, se podrían examinar las condiciones cognitivas que entrañan déficits en las interacciones sociales (trastornos del espectro autista y esquizofrenia).

Introducción

La pradera vole(Microtus ochrogaster), miembro de la familia Cricetidae, es un pequeño mamífero cuya estrategia de vida se desarrolla como una especie socialmente monógama y altamente sociable. Tanto los machos como las hembras establecen un vínculo de pareja duradero después del apareamiento o largos períodos de convivencia caracterizados por compartir el nido, defender su territorio, y mostrar cuidado biparental para su progenie^1,2,3,4. Por lo tanto, la pradera vole es un modelo valioso para entender la base neurobiológica de la conducta socio-sexual y las deficiencias en la cognición social⁵.

La neurogénesis adulta es uno de los procesos más importantes de plasticidad neuronal que conduce a cambios de comportamiento. Por ejemplo, nuestro grupo de investigación informó en voles masculinos que la cohabitación social con el apareamiento aumentó la proliferación celular en la zona subventricular (VZ) y la zona subgranular en el giro dentado (DG) del hipocampo, lo que sugiere que la neurogénesis adulta puede desempeñar un papel en la formación de la unión de pareja inducida por el apareamiento en voles de praderas (datos inéditos). Por otro lado, aunque las regiones cerebrales donde se generan e integran nuevas neuronas son bien conocidas, los mecanismos moleculares y celulares implicados en estos procesos permanecen indeterminados debido a inconvenientes técnicos en todo el modelo cerebral^6. Por ejemplo, las vías de señalización que controlan la expresión génica y otras actividades celulares tienen un período de activación relativamente corto (detección de fosfoproteoma)⁷. Un modelo alternativo son las células madre neurales adultas aisladas y cultivadas o las células progenitoras para dilucidar los componentes moleculares implicados en la neurogénesis adulta.

El primer enfoque para mantener precursores neuronales in vitro del cerebro de mamíferos adultos (ratón) fue el ensayo de neuroesferas, que son agregados celulares que crecen en condiciones no adherentes que preservan su potencial multipotente para generar neuronas, así como astrocitos^8,9,10. Durante su desarrollo, existe un proceso de selección donde sólo los precursores responderán a mitógenos como el Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF) y el Factor de Crecimiento fibroblasto 2 (FGF2) para proliferar y generar neuroesferas^8,9,10.

Hasta nuestro conocimiento, no se informa de ningún protocolo en la literatura para obtener progenitores neuronales adultos de los voles de las praderas. Aquí, establecimos las condiciones de cultivo para aislar a los progenitores neuronales de nichos neurogénicos y su mantenimiento in vitro a través del ensayo de formación de neurosfera. Por lo tanto, los experimentos pueden ser diseñados para identificar los mecanismos moleculares y celulares involucrados en la proliferación, migración, diferenciación y supervivencia de las células madre neurales y progenitores, procesos que todavía se desconocen en la pradera vole. Además, el esclarecer las diferencias in vitro en las propiedades de las células derivadas de la VZ y la DG podría proporcionar información sobre el papel de los nichos neurogénicos en la plasticidad neuronal asociados con los cambios en el comportamiento socio-sexual y los comportamientos cognitivos, y los déficits en las interacciones sociales (trastorno del espectro autista y esquizofrenia), que también podrían ser sexualmente dependientes.

Protocolo

El estudio fue aprobado por el Comité de ética de la investigación del Instituto de Neurobiología, la Universidad Nacional Autónoma de México, México y el Instituto Nacional de Perinatologia (2018-1-163). La reproducción, cuidado y punto final humano de los animales se estableció siguiendo la Norma Oficial Mexicana (NOM-062-Z00-1999) basada en la Ley General de Salud en Materia de Investigación para la Salud.

1. Preparación de soluciones y existencias

1. Preparar un medio de cultivo N2 con 485 ml de Dulbecco Modified Eagle Medium-F12 (DMEM-F12), 5 ml de suplemento de N2 (100x), 5 ml de suplemento de glutamina (100x) y 5 ml de antibiótico-antimiótico (100x).
2. Preparar un medio de cultivo B27 con 480 ml de medio neurobasal, 10 ml de suplemento B27 (50x), 5 ml de suplemento de glutamina, y 5 ml de antibiótico-antimicótico (100x).
3. Reconstituir el polvo de colagenasa en 1x PBS (solución salina tamponada con fosfato) para obtener alícuotas con una actividad de 100 unidades/L (1000x) y almacenar a -20 oC. Aviso, la actividad de la colagenasa depende del número de lote de las empresas.
4. Preparar alícuotas de stock dispase disolviendo 5 mg de polvo dispase en 1x PBS (50 mg/ml). Conservar a -20oC.
5. Preparar una solución enzimática con 100 ml de medio DMEM-F12, 50 ml de colagenasa (100 unidades/L) para tener una concentración final de 50 U/ml y 333 l de riesgo de stock (50 mg/ml) para tener una concentración final de 0,33 mg/ml.
6. Para preparar una solución de lavado, a 1.000 ml de 1x PBS, añadir 0,4766 g de HEPES (concentración final 2 mM), 3,6 g de D-glucosa (concentración final 20 mM) y 2,1 g de NaHCO₃ (concentración final 25 mM).
7. Preparar alícuotas de poli-L-ornitina (1 mg/ml) con agua estéril y almacenar a -20 oC.
8. Preparar una solución de trabajo de poli-L-ornitina. Diluir una alícuota de stock (1mg/ml) en 49 ml de agua estéril para una concentración final de 20 g/ml.
9. Preparar una solución de trabajo de laminin. Diluir 25 l de laminin (1 mg/ml de stock original) en 5 ml de agua estéril para una concentración final de 5 g/ml.
   NOTA: Después de la preparación, filtre los medios de cultivo, el trabajo y las soluciones de stock para evitar la contaminación. Utilice una jeringa o filtros de vacío de tapa de botella (membrana de poliéermesulfone con un tamaño de poro de 0,2 m). Los medios de cultivo y las soluciones de trabajo se pueden almacenar durante un máximo de 30 días a 4 oC, mientras que las existencias se pueden almacenar durante un máximo de cuatro meses a -20 oC.

2. Preparación antes de iniciar la microdisección

1. Esterilice los instrumentos quirúrgicos mediante autoclaves o con un esterilizador seco con cuentas de vidrio caliente.
2. Limpie la superficie de microdisección bajo estrictas condiciones asépticas y antisépticas (por ejemplo, con agua ozonizada).
   NOTA: El momento de la microdisección de ambos nichos neurogénicos de cada cerebro vole es de aproximadamente 30 min. Se recomienda trabajar con 1-4 animales durante todo el procedimiento.

3. Extracción de todo el cerebro

1. Anestesiar la vole adulta (12-16 semanas) con una sobredosis de pentobarbital (6,3 mg/animal) mediante inyección intraperitoneal. Verifique la profundidad de la anestesia por la ausencia de reflejo del pedal en respuesta a un pellizco firme del dedo.
2. Una vez que el vole está completamente anestesiado, inducir la eutanasia por decapitación y recuperar la cabeza.
3. Disecciona la piel del cráneo con tijeras, haciendo una incisión caudal-rostral (15 mm de largo) para exponer el cráneo.
4. Cortar los huesos occipitales e interparietales y trazar una incisión en el cráneo a lo largo de las suturas sagital y parietal.
5. Hacer un agujero en el cráneo en la unión de los huesos frontales y parietales usando tijeras, teniendo mucho cuidado de no dañar el tejido cerebral.
6. Para exponer el cerebro, retire los fragmentos de cráneo restantes que cubren ambos hemisferios cerebrales con pinzas puntiagudas.
7. Usa una espátula de acero inoxidable para levantar todo el cerebro de la base craneal.
8. Recoger el cerebro en un tubo centrífugo (50 ml) con 20 ml de solución de lavado en frío.
9. Lave el cerebro dos veces con la solución de lavado en frío.

4. Microdisección del tejido neural

1. Coloque un plato de Petri en una superficie rodeada de hielo.
2. Depositar el cerebro en el plato y añadir 20 ml de solución de lavado en frío.
3. Con un bisturí, en el plano coronal, divide el cerebro en dos bloques de tejido (rostral y caudal). Como referencia neuroanatómica, realice el corte coronal a nivel de Bregma en el eje anterior-posterior¹¹ (Figura 1A, línea sólida).
4. Del bloque rostral, extraiga el tejido VZ (Figura 1B), mientras que del bloque caudal retire la DG (Figura 1C).
5. Disecciona el VZ bajo un microscopio estéreo.
   1. Con un fórceps Dumont, sostenga uno de los hemisferios; entonces, inserte, a la altura del ventrículo, las puntas finas de un segundo fórceps Dumont debajo del tejido que recuña el caudate-putamen (Figura 2A).
   2. Abra los fórceps a lo largo del eje dorsoventral para separar el tejido.
   3. Recoger el tejido VZ por individuo en un tubo centrífugo con 2 ml de solución de lavado en frío. No acose el tejido de más de dos animales.
   4. Repita la microdisección en el otro hemisferio.
   5. Almacene el tubo que contiene el tejido bilateral VZ sobre hielo y continúe diseccionando la DG.
6. Diseccionar la DG del bloque caudal bajo un microscopio estéreo.
   1. Con un bisturí, haz un corte coronal en el bloque para obtener dos rodajas, en las que se observa la formación del hipocampo. Como punto de referencia, el corte se realiza en coordenadas Bregma de -2 mm en el eje anterior-posterior de acuerdo con el atlas cerebral del ratón¹¹ (Figura 1A, línea punteada y Figura 1C).
   2. Con un fórceps Dumont, sostenga una de las rodajas, y con fórceps Dumont de punto fino realice un corte horizontal entre DG y CA1 y luego realice una incisión vertical entre la DG y CA3 para separar la DG (Figura 2B).
   3. Repita la disección en la primera porción del otro hemisferio.
   4. Repita la disección en ambos hemisferios en la segunda rebanada.
   5. Recoger las cuatro piezas DG de cada vole en un tubo centrífugo. No acomoda el tejido DG de más de dos animales.
      NOTA: Si se requiere la disección de más de un animal, almacene los tubos centrífugos con el tejido VZ o DG sobre hielo mientras continúa diseccionando el resto de los cerebros. Retire todos los vasos sanguíneos que cubren el tejido cerebral mientras se disecciona. Si los vasos no se desechan, el cultivo podría mezclarse con un exceso de eritrocitos y perturbar la formación de neurosfera.

5. Aislamiento de las células neurales

1. Coloque los tubos centrífugos dentro del gabinete de bioseguridad y espere unos 10 minutos para que los fragmentos de tejido se precipiten por gravedad.
2. Retire la solución de lavado y añada 1 ml de la solución enzimática caliente a cada tubo.
3. Incubar los tubos a 37oC durante 10 min.
4. Desintegrar los fragmentos de tejido; pipeta arriba y abajo con una punta de 1 ml. No pipetee más de 30x.
5. Realizar una segunda incubación de 10 min a 37oC.
6. Al final de la segunda incubación, pipeta para romper los tejidos. No pipetee más de 30x.
   NOTA: Después del pipeteo, los fragmentos de tejido deben desintegrarse por completo; si no se desintegran, incubar durante otros 10 minutos a 37oC y volver a pipetear. El período de digestión no debe exceder de 30 min.
7. Añadir 9 ml de medio N2 por tubo para diluir el tratamiento enzimático.
8. Centrifugar los tubos a 200 x g durante 4 min a temperatura ambiente.
9. Deseche el sobrenadante y lave con 10 ml de N2 medio.
10. Centrifugar en las mismas condiciones que el paso 5.8.
11. Retire el sobrenadante de cada tubo y resusppend los pellets celulares del VZ y DG en 2 ml y 1 ml del medio B27, respectivamente.
12. Para eliminar cualquier tejido no desintegrado, filtre cada suspensión celular con un colador celular (tamaño 40 m).

6. Formación de neuroesferas

1. Cultivo de las células pasaron a través del colador en un accesorio ultra bajo, placa de 24 pozos. Utilice dos pozos para el VZ y uno para la DG (1 mL de B27 medio/pozo).
2. Añadir 20 ng/ml de FGF2 y 20 ng/mL de EGF a cada pozo (concentración final 1x).
3. Incubar a 37oC, 5% CO₂ y alta humedad (90-95%). No molestar durante 48 h (día 1 y día 2 de la cultura, D1-D2).
4. En el tercer día (D3), retirar la mitad del medio de cultivo y reemplazarlo con un medio B27 fresco (500 ml por pozo) complementado con doble concentración (2x) de factores de crecimiento.
5. Repetir cada tercer día, cambiar el medio de cultivo (la mitad de él) y reemplazarlo con un medio B27 fresco complementado con doble concentración (2x) de factores de crecimiento.
6. En los días en que no es necesario cambiar el medio de cultivo, añadir factores de crecimiento a una concentración final de 1x.
7. Asegúrese de que las neuroesferas se forman alrededor de D8-D10.
8. En el D10, cambie el medio de cultivo completo para eliminar todos los desechos.
   1. Recoger el medio y las neuroesferas individualmente de cada pozo en tubos centrífugos.
   2. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente. Este procedimiento permite a las neuroesferas precipitar por gravedad.
   3. Retire el sobrenadante y resuspend en 1 ml de medio B27 fresco complementado con factores de crecimiento.
   4. Colocar las neuroesferas de nuevo en la misma placa de fijación ultrabaja e incubar a 37 oC, 5% CO₂.
9. De D10 a D15, continúe cambiando la mitad del medio y añadiendo factores de crecimiento.

7. Pasaje de las neuroesferas

1. En D15 del cultivo primario, recoger las neuroesferas en tubos de centrífuga utilizando pipeta de 1 ml. Corte la punta de la pipeta para aumentar el tamaño de la abertura para evitar daños a las neuroesferas.
2. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente. Las neuroesferas se precipitan por gravedad.
3. Retire el medio y agregue 1 ml del medio de desprendimiento de la célula por tubo.
4. Incubar los tubos durante 7 min a 37oC.
5. Pipetear hacia arriba y hacia abajo con una punta de 1 ml para desmantelar las neuroesferas.
6. Diluir el medio de desprendimiento celular con 3 ml de medio B27 por tubo.
7. Centrifugar la suspensión celular durante 5 min a 200 x g.
8. Deseche el sobrenadante y resusppend cada pellet celular con un medio B27 fresco complementado con factores de crecimiento.
   1. Resuspender las células derivadas de VZ en 4 ml de células medianas y las células derivadas DG en 2 ml de medio.
9. Cultivo de las células (paso 1) en una nueva placa de fijación ultrabajo duplicando el número de pozos que se utilizaron en el cultivo primario (4 y 2 pozos para VZ y DG, respectivamente).
10. Cambia la mitad del medio cada tercer día y añade factores de crecimiento diariamente.
11. Después de 10 días (D10) en el pasaje 1, cambie a las condiciones adherentes en el siguiente pasaje.

8. El paso en condiciones adherentes

1. Antes de llevar a cabo el pasaje 2, preparar las placas recubiertas con poli-L-ornitina y laminina.
   1. En placas de 24 pocillos, agregue 500 l de 1x de poli-l-ornitina (20 g/ml) por pozo. Incubar a 37oC durante la noche.
   2. Retire la poli-L-ornitina y lave 4x con 1 pbS (500 l/pozo).
   3. Añadir 200 l (volumen mínimo para cubrir la superficie de un solo pozo) de 1x laminin (5 g/ml) por pozo e incubar durante 2-3 h a 37 oC antes de cultivar las células.
2. Recoger las neuroesferas con 1 mL pipeta con puntas cortadas en un tubo de centrífuga.
3. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente para precipitar las neuroesferas por gravedad.
4. Deseche el sobrenadante y resuspender las neuroesferas en medio B27 fresco sin factores de crecimiento.
5. Aspirar la laminina de la placa recubierta y depositar las neuroesferas en los pozos utilizando pipetas de 1 ml con puntas cortadas.
   NOTA: Evite que los pozos recubiertos se sequen entre la extracción de laminina y las neuroesferas de chapado.
6. Divida la cultura en dos condiciones:
   1. Mantener neuroesferas diferenciadas durante 6 días (D6). Cambiar el medio cada tercer día y añadir factores de crecimiento todos los días.
   2. Observe la diferenciación de las células derivadas de la neurosfera por 12 días (D12). Cambiar el medio cada tercer día sin factores de crecimiento.
      NOTA: Al final de D6 para indiferenciadas o D12 para condiciones de diferenciación, las células se pueden utilizar para inmunohistoquímica convencional, análisis de clasificación celular, tinción de 5-Ethynyl-2'-desoxiuridina (EdU), extracción de ARN, entre otros.

Resultados

Las neuroesferas se formaron a partir de células madre neurales aisladas del VZ y DG de los voles de las praderas adultas femeninas y masculinas. Alrededor de 8-10 días después de iniciar el cultivo, las células deben haber formado las neuroesferas. Tenga en cuenta que la placa puede contener residuos en el cultivo primario (Figura 3A). Sin embargo, en el paso 1 el cultivo sólo debe consistir en neuroesferas(Figura 3B).

Se obtuvo...

Discusión

Una etapa para obtener un cultivo de células madre neurales es el período de digestión con la solución enzimática, que no debe exceder más de 30 min porque podría disminuir la viabilidad celular. Las neuroesferas deben emerger a los 8-10 días después del cultivo inicial; si no emergen en el día 12, deseche el cultivo y repita el experimento, reduciendo el período de digestión. Otro problema son los vasos sanguíneos que cubren el tejido cerebral. Deben eliminarse por completo durante la disección porque el e...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies			Antibody ID
Anti-Nestin	GeneTex	GTX30671	RRID:AB_625325
Anti-Doublecortin	MERCK	AB2253	RRID:AB_1586992
Anti-Ki67	Abcam	ab66155	RRID:AB_1140752
Anti-MAP2	GeneTex	GTX50810	RRID:AB_11170769
Anti-GFAP	SIGMA	G3893	RRID:AB_477010
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11029	RRID:AB_2534088
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A-11036	RRID:AB_10563566
Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11073	RRID:AB_2534117
Culture reagents
Antibiotic-Antimycotic	Thermo Fisher Scientific/Gibco	15240062	100X
B-27 supplement	Thermo Fisher Scientific/Gibco	17504044	50X
Collagenase, Type IV	Thermo Fisher Scientific/Gibco	17104019	Powder
Dispase	Thermo Fisher Scientific/Gibco	17105041	Powder
DMEM/F12, HEPES	Thermo Fisher Scientific/Gibco	11330032
Glucose	any brand		Powder, Cell Culture Grade
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific/Gibco	35050061	100X
HEPES	any brand		Powder, Cell Culture Grade
Mouse Laminin	Corning	354232	1 mg/mL
N-2 supplement	Thermo Fisher Scientific/Gibco	17502048	100X
NAHCO3	any brand		Powder, Suitable for Cell Culture
Neurobasal	Thermo Fisher Scientific/Gibco	21103049
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific/Gibco	10010023	1X
Poly-L-ornithine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P3655	Powder
Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15
Recombinant Human FGF-basic	Peprotech	AF-100-18B
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Thermo Fisher Scientific/Gibco	A1110501	100 mL
Disposable material
24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates	Corning/Costar	3473
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates	Corning/Costar	3526
40 µm Cell Strainer	Corning/Falcon	352340	Blue
Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 µm pore	Corning	431118	PES membrane, 45 mm diameter neck
Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube	any brand		with conical bottom
Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl.	any brand
Sterile cotton gauzes
Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL	any brand
Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL	any brand
Sterile surgical gloves	any brand
Syringe Filters, 0.22 µm pore	Merk Millipore	SLGPR33RB	Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter
Equipment and surgical instruments
Biological safety cabinet
Dissecting Scissors
Dumont Forceps
Motorized Pipet Filler/Dispenser
Micropipettes
Petri Dishes
Scalpel Blades
Stainless-steel Spatula