Cultura delle Neurosfere Derivate dalle Nicchie Neurogeniche nelle Arvicole Della Prateria Adulta

Riepilogo

Abbiamo stabilito le condizioni per coltura delle cellule progenitrici neurali dalla zona subventricolare e dentare il giro del cervello adulto delle arvicole della prateria, come studio complementare in vitro, per analizzare le differenze dipendenti dal sesso tra nicchie neurogeniche che potrebbero far parte dei cambiamenti plastici funzionali associati ai comportamenti sociali.

Abstract

Le neurosfere sono aggregati cellulari primari che comprendono cellule staminali neurali e cellule progenitrici. Queste strutture 3D sono uno strumento eccellente per determinare il potenziale di differenziazione e proliferazione delle cellule staminali neurali, nonché per generare linee cellulari di quanto possa essere analizzato nel tempo. Inoltre, le neurosfere possono creare una nicchia (in vitro) che consente la modellazione dell'ambiente dinamico che cambia, come diversi fattori di crescita, ormoni, neurotrasmettitori, tra gli altri. Microtus ochrogaster (prateria arvicola) è un modello unico per comprendere le basi neurobiologiche dei comportamenti socio-sessuali e della cognizione sociale. Tuttavia, i meccanismi cellulari coinvolti in questi comportamenti non sono ben noti. Il protocollo mira ad ottenere cellule progenitrici neurali dalle nicchie neurogeniche della prateria adulta, che sono coltivate in condizioni non aderenti, per generare neurosfere. Le dimensioni e il numero di neurosfere dipendono dalla regione (zona subventricolare o giro dentato) e dal sesso dell'arvicola della prateria. Questo metodo è uno strumento notevole per studiare le differenze dipendenti dal sesso nelle nicchie neurogeniche in vitro e i cambiamenti di neuroplasticità associati a comportamenti sociali come il legame tra coppie e la cura biparentale. Inoltre, potrebbero essere esaminate le condizioni cognitive che comportano deficit nelle interazioni sociali (disturbi dello spettro autistico e schizofrenia).

Introduzione

La prateria(Microtus ochrogaster),un membro della famiglia Cricetidae, è un piccolo mammifero la cui strategia di vita si sviluppa come specie socialmente monogama e altamente socievole. Sia i maschi che le femmine stabiliscono un legame duraturo di coppia dopo l'accoppiamento o lunghi periodi di convivenza caratterizzati dalla condivisione del nido, dalla difesa del loro territorio e dall'esposizione di cure biparentali per la loro progenie^1,2,3,4. Pertanto, l'arvicola della prateria è un modello prezioso per comprendere le basi neurobiologiche del comportamento socio-sessuale e delle menomazioni nella cognizione sociale⁵.

La neurogenesi adulta è uno dei processi più importanti della plasticità neurale che porta a cambiamenti comportamentali. Ad esempio, il nostro gruppo di ricerca ha riferito nelle arvicole maschili che la convivenza sociale con accoppiamento ha aumentato la proliferazione cellulare nella zona subventricolare (VZ) e nella zona subgranulare nel giro dentato (DG) dell'ippocampo, suggerendo che la neurogenesi adulta può svolgere un ruolo nella formazione del legame di coppia indotto dall'accoppiamento nelle arvicole della prateria (dati inediti). D'altra parte, sebbene le regioni cerebrali in cui vengono generati e integrati nuovi neuroni siano ben note, i meccanismi molecolari e cellulari coinvolti in questi processi rimangono indeterminati a causa di inconvenienti tecnici nell'intero modello^{cerebrale 6}. Ad esempio, le vie di segnalazione che controllano l'espressione genica e altre attività cellulari hanno un periodo di attivazione relativamente breve (rilevamento del fosfoproteoma)⁷. Un modello alternativo è le cellule staminali neurali adulte isolate e coltivate o le cellule progenitrici per chiarire i componenti molecolari coinvolti nella neurogenesi adulta.

Il primo approccio per mantenere i precursori neurali in vitro del cervello di mammiferi adulti (topo) è stato il test delle neurosfere, che sono aggregati cellulari che crescono in condizioni non aderenti che preservano il loro potenziale multipotente per generare neuroni, così come gli astrociti^8,9,10. Durante il loro sviluppo, c'è un processo di selezione in cui solo i precursori risponderanno a mitogeni come il fattore di crescita epidermico (EGF) e il fattore di crescita dei fibroblasti 2 (FGF2) per proliferare e generare neurosfere^8,9,10.

A nostra conoscenza, nessun protocollo è riportato in letteratura per ottenere progenitori neurali adulti dalle arvicole della prateria. Qui, abbiamo stabilito le condizioni di coltura per isolare i progenitori neuronali dalle nicchie neurogeniche e il loro mantenimento in vitro attraverso il test di formazione della neurosfera. Pertanto, gli esperimenti possono essere progettati per identificare i meccanismi molecolari e cellulari coinvolti nella proliferazione, migrazione, differenziazione e sopravvivenza delle cellule staminali neurali e dei progenitori, processi che sono ancora sconosciuti nell'arvicola della prateria. Inoltre, chiarire le differenze in vitro nelle proprietà delle cellule derivate dalla VZ e dalla DG potrebbe fornire informazioni sul ruolo delle nicchie neurogeniche nella plasticità neurale associate ai cambiamenti nel comportamento socio-sessuale e nei comportamenti cognitivi e ai deficit nelle interazioni sociali (disturbo dello spettro autistico e schizofrenia), che potrebbero anche dipendere dal sesso.

Protocollo

Lo studio è stato approvato dal Comitato etico della ricerca dell'Instituto de Neurobiología, universidad nacional autónoma de México, Messico e Instituto Nacional de Perinatologia (2018-1-163). La riproduzione, la cura e gli endpoint umani degli animali sono stati stabiliti seguendo lo standard ufficiale messicano (NOM-062-Z00-1999) basato sul "Ley General de Salud en Materia de Investigación para la Salud" (Legge generale sulla salute per la ricerca sanitaria) della Secretaria della Salute messicana.

1. Soluzioni e preparazione delle scorte

1. Preparare un mezzo di coltura N2 con 485 mL di Dulbecco's Modified Eagle Medium-F12 (DMEM-F12), 5 mL di integratore N2 (100x), 5 mL di integratore di glutammina (100x) e 5 mL di antibiotico-antimicotico (100x).
2. Preparare un mezzo di coltura B27 con 480 mL di mezzo neurobasale, 10 mL di integratore B27 (50x), 5 mL di integratore di glutammina e 5 mL di antibiotico-antimicotico (100x).
3. Ricostituire la polvere di collagenasi in 1x PBS (soluzione salina tamponata da fosfati) per ottenere aliquote con un'attività di 100 unità/μL (1000x) e conservare a -20 °C. Nota, l'attività della collagenasi dipende dal numero di lotto delle aziende.
4. Preparare le aliquote delle scorte di dispasi sciogliendo 5 mg di polvere dispasi in 1x PBS (50 mg/mL). Conservare a -20 °C.
5. Preparare una soluzione enzimatica con 100 mL di mezzo DMEM-F12, 50 μL di collagenasi stock (100 unità/μL) per avere una concentrazione finale di 50 U/mL e 333 μL di dispasi stock (50 mg/mL) per avere una concentrazione finale di 0,33 mg/mL.
6. Per preparare una soluzione di lavaggio, a 1.000 mL di 1x PBS, aggiungere 0,4766 g di HEPES (concentrazione finale 2 mM), 3,6 g di D-glucosio (concentrazione finale 20 mM) e 2,1 g di NaHCO₃ (concentrazione finale 25 mM).
7. Preparare aliquote di poli-L-ornitina (1 mg/mL) utilizzando acqua sterile e conservare a -20 °C.
8. Preparare una soluzione funzionante di poli-L-ornitina. Diluire un'aliquota di stock (1mg/mL) in 49 mL di acqua sterile per una concentrazione finale di 20 μg/mL.
9. Preparare una soluzione funzionante di laminina. Diluire 25 μL di laminina (1 mg/mL di stock originale) in 5 mL di acqua sterile per una concentrazione finale di 5 μg/mL.
   NOTA: Dopo la preparazione, filtrare i mezzi di coltura, le soluzioni di lavoro e di magazzino per evitare la contaminazione. Utilizzare una siringa o filtri per vuoto bottle-top (membrana in polieteresolfone con una dimensione del poro di 0,2 μm). I supporti di coltura e le soluzioni di lavoro possono essere conservati fino a 30 giorni a 4 °C, mentre le scorte possono essere conservate fino a quattro mesi a -20 °C.

2. Preparazione prima di iniziare la microdisezione

1. Sterilizzare gli strumenti chirurgici mediante autoclave o con uno sterilizzatore secco di perline di vetro caldo.
2. Pulire la superficie della microdisezione in condizioni asettiche e antisettiche rigorose (ad esempio, con acqua ozonizzata).
   NOTA: La tempistica della microdisezione di entrambe le nicchie neurogeniche da ogni cervello di arvicola è di circa 30 minuti. Si consiglia di lavorare con 1-4 animali per l'intera procedura.

3. Estrazione di tutto il cervello

1. Anestetizzare l'arvicola adulta (12-16 settimane) con un sovradosaggio di pentobarbital (6,3 mg/animale) attraverso iniezione intraperitoneale. Verificare la profondità dell'anestesia dall'assenza di riflesso del pedale in risposta a un dito fermo.
2. Una volta che l'arvicola è completamente anestetizzata, indurre l'eutanasia per decapitazione e recuperare la testa.
3. Sezionare la pelle dal cranio con le forbici, facendo un'incisione caudale-rostrale (lunga 15 mm) per esporre il cranio.
4. Tagliare le ossa occipitali e interparietali e rintracciare un'incisione nel cranio lungo le suture sagittali e parietali.
5. Fai un buco nel cranio alla giunzione delle ossa frontali e parietali usando le forbici, facendo molta attenzione a non danneggiare il tessuto cerebrale.
6. Per esporre il cervello, rimuovere i frammenti di cranio rimanenti che coprono entrambi gli emisferi cerebrali con pinzette appuntite.
7. Utilizzare una spatola in acciaio inossidabile per sollevare l'intero cervello dalla base cranale.
8. Raccogliere il cervello in un tubo di centrifuga (50 ml) con 20 ml di soluzione di lavaggio a freddo.
9. Lavare il cervello due volte con la soluzione di lavaggio a freddo.

4. Microdisezione del tessuto neurale

1. Posizionare una piastra di Petri su una superficie circondata da ghiaccio.
2. Depositare il cervello sul piatto e aggiungere 20 mL di soluzione di lavaggio a freddo.
3. Con un bisturi, nel piano coronale, dividere il cervello in due blocchi di tessuto (rostrale e caudale). Come riferimento neuroanatomonico, eseguire il taglio coronale a livello di Bregma nell'asse anteriore-posteriore¹¹ (Figura 1A,linea continua).
4. Dal blocco rostrale estrarre il tessuto VZ (Figura 1B), mentre dal blocco caudale rimuovere la DG (Figura 1C).
5. Sezionare il VZ al microscopio stereo.
   1. Con una forza di Dumont, tenere uno degli emisferi; quindi, inserire, all'altezza del ventricolo, le punte fini di un secondo Dumont forza sotto il tessuto che rivestisce il caudato-putamen (Figura 2A).
   2. Aprire le forcep lungo l'asse dorsoventrale per separare il tessuto.
   3. Raccogliere il tessuto VZ per individuo in un tubo di centrifuga con 2 ml di soluzione di lavaggio a freddo. Non mettere in comune il tessuto di più di due animali.
   4. Ripetere la microdisezione nell'altro emisfero.
   5. Conservare il tubo contenente il tessuto VZ bilaterale sul ghiaccio e continuare a sezionare la DG.
6. Sezionare la DG dal blocco caudale al microscopio stereo.
   1. Con un bisturi, fare un taglio coronale nel blocco per ottenere due fette, in cui si osserva la formazione ippocampale. Come punto di riferimento, il taglio viene effettuato a -2 mm di coordinate Bregma nell'asse anteriore-posteriore secondo l'atlante cerebrale del mouse¹¹ (Figura 1A,linea tratteggiata e Figura 1C).
   2. Con una flessione Dumont, tenere una delle fette, e con forcep Dumont a punto fine fare un taglio orizzontale tra DG e CA1 e quindi eseguire un'incisione verticale tra la DG e CA3 per separare la DG (Figura 2B).
   3. Ripetere la dissezione nella prima fetta dell'altro emisfero.
   4. Ripetere la dissezione in entrambi gli emisferi nella seconda fetta.
   5. Raccogli i quattro pezzi DG di ogni arvicola in un tubo di centrifuga. Non mettere in comune il tessuto DG di più di due animali.
      NOTA: Se è richiesta la dissezione di più di un animale, conservare i tubi di centrifuga con il tessuto VZ o DG sul ghiaccio continuando a sezionare il resto del cervello. Rimuovere tutti i vasi sanguigni che coprono il tessuto cerebrale durante la sezionazione. Se i vasi non vengono scartati, la coltura potrebbe essere mescolata con un eccesso di etitrociti e disturbare la formazione della neurosfera.

5. Isolamento delle cellule neurali

1. Posizionare i tubi di centrifuga all'interno dell'armadio di biosicurezza e attendere circa 10 minuti che i frammenti di tessuto precipitino per gravità.
2. Rimuovere la soluzione di lavaggio e aggiungere 1 ml della soluzione enzimatica calda ad ogni tubo.
3. Incubare i tubi a 37 °C per 10 minuti.
4. Disintegrare i frammenti di tessuto; pipetta su e giù con una punta da 1 mL. Non pipettare più di 30x.
5. Effettuare una seconda incubazione di 10 min a 37 °C.
6. Alla fine della seconda incubazione, pipetta per rompere i tessuti. Non pipettare più di 30x.
   NOTA: Dopo la pipettazione, i frammenti di tessuto devono essere completamente disintegrati; se non sono disintegrati, incubare per altri 10 minuti a 37 °C e ri-pipettare. Il periodo di digestione non deve superare i 30 minuti.
7. Aggiungere 9 ml di mezzo N2 per tubo per diluire il trattamento enzimatico.
8. Centrifugare i tubi a 200 x g per 4 minuti a temperatura ambiente.
9. Scartare il supernatante e lavare con 10 mL di mezzo N2.
10. Centrifuga alle stesse condizioni del passaggio 5.8.
11. Rimuovere il supernatante da ciascun tubo e rimescolare i pellet cellulari del VZ e della DG rispettivamente in 2 mL e 1 mL del mezzo B27.
12. Per rimuovere qualsiasi tessuto non disintegrato, filtrare ogni sospensione cellulare utilizzando un filtro cellulare (dimensione 40 μm).

6. Formazione di neurosfere

1. Coltura le cellule passate attraverso il colino in un attacco ultra-basso, piastra da 24 pozzi. Utilizzare due pozzali per la VZ e un pozzo per la DG (1 mL di B27 medio/pozzo).
2. Aggiungere 20 ng/mL di FGF2 e 20 ng/mL di FEG ad ogni pozzo (concentrazione finale 1x).
3. Incubare a 37 °C, 5% CO₂ e alta umidità (90-95%). Non disturbare per 48 ore (giorno 1 e giorno 2 di cultura, D1-D2).
4. Il terzo giorno (D3), rimuovere metà del mezzo di coltura e sostituirlo con un mezzo B27 fresco (500 μL per pozzo) integrato con doppia concentrazione (2x) di fattori di crescita.
5. Ripetere ogni terzo giorno, cambiare il mezzo di coltura (metà di esso) e sostituirlo con un nuovo mezzo B27 integrato con doppia concentrazione (2x) di fattori di crescita.
6. Nei giorni in cui non è necessario cambiare il mezzo di coltura, aggiungere fattori di crescita a una concentrazione finale di 1x.
7. Assicurarsi che le neurosfere si formano intorno al D8-D10.
8. Al D10, cambiare il mezzo di coltura completo per rimuovere tutti i detriti.
   1. Raccogliere il mezzo e le neurosfere singolarmente di ogni pozzo in tubi di centrifuga.
   2. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Questa procedura consente alle neurosfere di precipitazioni per gravità.
   3. Rimuovere il supernatante e resuspend in 1 mL di mezzo B27 fresco integrato con fattori di crescita.
   4. Riposizionare le neurosfere nella stessa piastra di attacco ultra-bassa e incubare a 37 °C, 5% CO₂.
9. Da D10 a D15, continua a cambiare metà del mezzo e ad aggiungere fattori di crescita.

7. Passaggio delle neurosfere

1. Al D15 della coltura primaria, raccogliere le neurosfere in tubi di centrifuga utilizzando pipetta da 1 ml. Tagliare la punta della pipetta per aumentare le dimensioni dell'apertura per evitare danni alle neurosfere.
2. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Le neurosfere precipitano per gravità.
3. Rimuovere il mezzo e aggiungere 1 ml del mezzo di distacco cellulare per tubo.
4. Incubare i tubi per 7 min a 37 °C.
5. Pipetta su e giù con una punta da 1 mL per smantellare le neurosfere.
6. Diluire il mezzo di distacco cellulare con 3 ml di mezzo B27 per tubo.
7. Centrifugare la sospensione cellulare per 5 min a 200 x g.
8. Scartare il supernatante e rimescolare ogni pellet cellulare con un mezzo B27 fresco integrato con fattori di crescita.
   1. Rimospendare le cellule derivate da VZ in 4 mL di medie e le cellule derivate da DG in 2 mL di mezzo.
9. Coltura delle cellule (passaggio 1) in una nuova piastra di attacco ultra-bassa raddoppiando il numero di pozzi utilizzati nella coltura primaria (4 e 2 pozzi rispettivamente per VZ e DG).
10. Cambia metà del mezzo ogni terzo giorno e aggiungi fattori di crescita ogni giorno.
11. Dopo 10 giorni (D10) nel passaggio 1, cambiare le condizioni aderenti nel passaggio successivo.

8. Il passaggio in condizioni di adesione

1. Prima di effettuare il passaggio 2, preparare piastre rivestite con poli-L-ornitina e laminina.
   1. Nelle piastre a 24 polietilene aggiungere 500 μL di 1x poli-L-ornitina (20 μg/mL) per pozzo. Incubare a 37 °C durante la notte.
   2. Rimuovere la poli-L-ornitina e lavare 4 volte con 1x PBS (500 μL/pozzo).
   3. Aggiungere 200 μL (volume minimo per coprire la superficie di un singolo pozzo) di 1 laminina (5 μg/mL) per pozzo e incubare per 2-3 h a 37 °C prima di coltivare le cellule.
2. Raccogliere le neurosfere con pipetta da 1 ml con punte tagliate in un tubo di centrifuga.
3. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente per far precipitare le neurosfere per gravità.
4. Scartare il supernatante e rimescolare le neurosfere in un mezzo B27 fresco senza fattori di crescita.
5. Aspirare la laminina dalla piastra rivestita e depositare le neurosfere nei pozzi utilizzando pipette da 1 mL con punte tagliate.
   NOTA: Evitare che i pozzi rivestiti si asciughino tra la rimozione della laminina e la placcatura delle neurosfere.
6. Dividere la cultura in due condizioni:
   1. Mantenere neurosfere differenziate per 6 giorni (D6). Cambia il mezzo ogni tre giorni e aggiungi fattori di crescita ogni giorno.
   2. Osservare la differenziazione delle cellule derivate dalla neurosfera di 12 giorni (D12). Cambia il mezzo ogni tre giorni senza fattori di crescita.
      NOTA: Alla fine di D6 per condizioni di differenziazione indifferenziate o D12, le cellule possono essere utilizzate per l'immunoistochimica convenzionale, l'analisi di smistamento cellulare, la colorazione 5-etynyl-2'-deossiuridina (EdU), l'estrazione dell'RNA, tra gli altri.

Risultati

Le neurosfere erano formate da cellule staminali neurali isolate dalla VZ e dalla DG di arvicole di prateria adulta sia femminile che maschile. Circa 8-10 giorni dopo aver iniziato la coltura, le cellule avrebbero dovuto formare le neurosfere. Si noti che la piastra può contenere detriti nella coltura primaria (Figura 3A). Tuttavia, nel passaggio 1 la coltura dovrebbe consistere solo di neurosfere (Figura 3B).

Un numero maggiore di n...

Discussione

Uno stadio per ottenere una coltura di cellule staminali neurali è il periodo di digestione con la soluzione enzimatica, che non dovrebbe superare i 30 minuti perché potrebbe diminuire la vitalità cellulare. Le neurosfere dovrebbero emergere a 8-10 giorni dopo la cultura iniziale; se non emergono entro il giorno 12, scartare la coltura e ripetere l'esperimento, riducendo il periodo di digestione. Un altro problema sono i vasi sanguigni che coprono il tessuto cerebrale. Dovrebbero essere completamente rimossi durante l...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies			Antibody ID
Anti-Nestin	GeneTex	GTX30671	RRID:AB_625325
Anti-Doublecortin	MERCK	AB2253	RRID:AB_1586992
Anti-Ki67	Abcam	ab66155	RRID:AB_1140752
Anti-MAP2	GeneTex	GTX50810	RRID:AB_11170769
Anti-GFAP	SIGMA	G3893	RRID:AB_477010
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11029	RRID:AB_2534088
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A-11036	RRID:AB_10563566
Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11073	RRID:AB_2534117
Culture reagents
Antibiotic-Antimycotic	Thermo Fisher Scientific/Gibco	15240062	100X
B-27 supplement	Thermo Fisher Scientific/Gibco	17504044	50X
Collagenase, Type IV	Thermo Fisher Scientific/Gibco	17104019	Powder
Dispase	Thermo Fisher Scientific/Gibco	17105041	Powder
DMEM/F12, HEPES	Thermo Fisher Scientific/Gibco	11330032
Glucose	any brand		Powder, Cell Culture Grade
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific/Gibco	35050061	100X
HEPES	any brand		Powder, Cell Culture Grade
Mouse Laminin	Corning	354232	1 mg/mL
N-2 supplement	Thermo Fisher Scientific/Gibco	17502048	100X
NAHCO3	any brand		Powder, Suitable for Cell Culture
Neurobasal	Thermo Fisher Scientific/Gibco	21103049
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific/Gibco	10010023	1X
Poly-L-ornithine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P3655	Powder
Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15
Recombinant Human FGF-basic	Peprotech	AF-100-18B
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Thermo Fisher Scientific/Gibco	A1110501	100 mL
Disposable material
24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates	Corning/Costar	3473
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates	Corning/Costar	3526
40 µm Cell Strainer	Corning/Falcon	352340	Blue
Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 µm pore	Corning	431118	PES membrane, 45 mm diameter neck
Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube	any brand		with conical bottom
Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl.	any brand
Sterile cotton gauzes
Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL	any brand
Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL	any brand
Sterile surgical gloves	any brand
Syringe Filters, 0.22 µm pore	Merk Millipore	SLGPR33RB	Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter
Equipment and surgical instruments
Biological safety cabinet
Dissecting Scissors
Dumont Forceps
Motorized Pipet Filler/Dispenser
Micropipettes
Petri Dishes
Scalpel Blades
Stainless-steel Spatula