Cultura das Neurosferas Derivadas dos Nichos Neurogênicos em Voles de Pradaria Adulta

Resumo

Estabelecemos as condições para cultivar células progenitoras neurais da zona subventricular e do giro dento do cérebro adulto de voles de pradaria, como um estudo in vitro complementar, para analisar as diferenças sex-dependentes entre nichos neurogênicos que poderiam fazer parte de mudanças plásticas funcionais associadas aos comportamentos sociais.

Resumo

Neurosferas são agregados de células primárias que compreendem células-tronco neurais e células progenitoras. Essas estruturas 3D são uma excelente ferramenta para determinar o potencial de diferenciação e proliferação de células-tronco neurais, bem como para gerar linhas celulares do que pode ser avaliado ao longo do tempo. Além disso, as neurosferas podem criar um nicho (in vitro) que permite a modelagem do ambiente de mudança dinâmica, como diferentes fatores de crescimento, hormônios, neurotransmissores, entre outros. Microtus ochrogaster (pradaria vole) é um modelo único para compreender a base neurobiológica dos comportamentos sociosexual e da cognição social. No entanto, os mecanismos celulares envolvidos nesses comportamentos não são bem conhecidos. O protocolo visa obter células progenitoras neurais dos nichos neurogênicos do vole da pradaria adulta, que são cultivadas sob condições não aderentes, para gerar neurosferas. O tamanho e o número de neurosferas dependem da região (zona subventricular ou giro dento) e sexo do vole da pradaria. Este método é uma ferramenta notável para estudar diferenças dependentes do sexo em nichos neurogênicos in vitro e as mudanças de neuroplasticidade associadas a comportamentos sociais como a união de pares e cuidados biparentais. Além disso, poderiam ser examinadas condições cognitivas que acarretam déficits nas interações sociais (transtornos do espectro autista e esquizofrenia).

Introdução

O vole da pradaria (Microtus ochrogaster), um membro da família Cricetidae, é um pequeno mamífero cuja estratégia de vida se desenvolve como uma espécie socialmente monogâmous e altamente sociável. Tanto os machos quanto as fêmeas estabelecem um vínculo de par duradouro após o acasalamento ou longos períodos de convivência caracterizados pela partilha do ninho, pela defesa de seu território e pela exibição de cuidados biparentais para sua prole^1,2,3,4. Assim, o vole pradaria é um modelo valioso para a compreensão da base neurobiológica do comportamento sociosexual e das deficiências na cognição social⁵.

Neurogênese adulta é um dos processos mais primordiais da plasticidade neural que leva a mudanças comportamentais. Por exemplo, nosso grupo de pesquisa relatou em voles masculinos que a coabitação social com o acasalamento aumentou a proliferação celular na zona subventricular (VZ) e na zona subgranular no giro dentado (DG) do hipocampo, sugerindo que a neurogênese adulta pode desempenhar um papel na formação de laços induzidos pelo acasalamento em voles de pradaria (dados inéditos). Por outro lado, embora as regiões cerebrais onde novos neurônios são gerados e integrados sejam bem conhecidas, os mecanismos moleculares e celulares envolvidos nesses processos permanecem indeterminados devido a desvantagens técnicas em todo o modelo cerebral⁶. Por exemplo, as vias de sinalização que controlam a expressão genética e outras atividades celulares têm um período de ativação relativamente curto (detecção de fosfoproteome)⁷. Um modelo alternativo são células-tronco neurais adultas isoladas e cultivadas ou células progenitoras para elucidar componentes moleculares envolvidos na neurogênese adulta.

A primeira abordagem para manter precursores neurais in vitro do cérebro de mamíferos adultos (camundongos) foi o ensaio das neurosferas, que são agregados celulares crescendo sob condições não aderentes que preservam seu potencial multipotente para gerar neurônios, bem como astrócitos^8,9,10. Durante seu desenvolvimento, há um processo seletivo onde apenas os precursores responderão a mitogênios como o Fator de Crescimento Epidérmico (EGF) e o Fator de Crescimento do Fibroblasto 2 (FGF2) para proliferar e gerar neuroesferas^8,9,10.

Pelo que sabemos, nenhum protocolo é relatado na literatura para obter progenitores neurais adultos de voles pradarias. Aqui, estabelecemos as condições de cultura para isolar progenitores neuronais de nichos neurogênicos e sua manutenção in vitro através do ensaio de formação da neurosfera. Assim, os experimentos podem ser projetados para identificar os mecanismos moleculares e celulares envolvidos na proliferação, migração, diferenciação e sobrevivência das células-tronco neurais e progenitores, processos que ainda são desconhecidos na pradaria. Além disso, a elucidação de diferenças in vitro nas propriedades das células derivadas do VZ e DG poderia fornecer informações sobre o papel dos nichos neurogênicos na plasticidade neural associados a mudanças no comportamento sociosexual e comportamentos cognitivos, e déficits nas interações sociais (transtorno do espectro autista e esquizofrenia), que também poderiam ser dependentes do sexo.

Protocolo

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto de Neurobiología, Universidad Nacional Autónoma de México, México e Instituto Nacional de Perinatologia (2018-1-163). A reprodução, o cuidado e os pontos finais humanos dos animais foram estabelecidos seguindo a Norma Oficial Mexicana (NOM-062-Z00-1999) com base no "Ley General de Salud en Materia de Investigación para la Salud" (Lei Geral de Saúde para Pesquisa em Saúde) da Secretaria de Saúde mexicana.

1. Preparação de soluções e ações

1. Prepare um meio de cultura N2 com 485 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium-F12 (DMEM-F12), 5 mL de suplemento N2 (100x), 5 mL de suplemento de glutamina (100x) e 5 mL de antibiótico-antimicomicotico (100x).
2. Prepare um meio de cultura B27 com 480 mL de neurobásico médio, 10 mL de suplemento B27 (50x), 5 mL de suplemento de glutamina e 5 mL de antibiótico-antimíctico (100x).
3. Reconstituir pó de colagenase em 1x PBS (salina tamponada com fosfato) para obter alíquotas com uma atividade de 100 unidades/μL (1000x) e armazenar a -20 °C. Observe que a atividade de colagem depende do número de lotes das empresas.
4. Prepare as alíquotas de estoque desaparo dissolvendo 5 mg de pó despase em 1x PBS (50 mg/mL). Armazenar a -20 °C.
5. Prepare uma solução enzimática com 100 mL de média DMEM-F12, 50 μL de colagem de estoque (100 unidades/μL) para ter uma concentração final de 50 U/mL e 333 μL de dispase de estoque (50 mg/mL) para ter uma concentração final de 0,33 mg/mL.
6. Para preparar uma solução de lavagem, a 1.000 mL de 1x PBS, adicione 0,4766 g de HEPES (concentração final de 2 mM), 3,6 g de D-glicose (concentração final de 20 mM) e 2,1 g de NaHCO₃ (concentração final de 25 mM).
7. Prepare alíquotas de estoque poli-L-ornithine (1 mg/mL) usando água estéril e armazene a -20 °C.
8. Prepare uma solução de trabalho de poli-L-ornithine. Diluir uma alíquota de estoque (1mg/mL) em 49 mL de água estéril para uma concentração final de 20 μg/mL.
9. Prepare uma solução de trabalho de laminina. Diluir 25 μL de laminina (1 mg/mL de estoque original) em 5 mL de água estéril para uma concentração final de 5 μg/mL.
   NOTA: Após a preparação, filtre as soluções de mídia de cultura, trabalho e estoque para evitar contaminação. Use uma seringa ou filtros de vácuo de tampa de garrafa (membrana polietroésulfone com um tamanho de poro de 0,2 μm). Os meios de cultura e as soluções de trabalho podem ser armazenados por até 30 dias a 4 °C, enquanto os estoques podem ser armazenados por até quatro meses a -20 °C.

2. Preparação antes de iniciar a microdisseção

1. Esterilize os instrumentos cirúrgicos por autoclaving ou com um esterilizador seco de contas de vidro quente.
2. Limpe a área da superfície de microdisseção sob rigorosas condições assépticas e antissépticas (por exemplo, com água ozonizada).
   NOTA: O tempo de microdisseção de ambos os nichos neurogênicos de cada cérebro de vole é de aproximadamente 30 minutos. Recomenda-se trabalhar com 1-4 animais para todo o procedimento.

3. Extração de todo o cérebro

1. Anestesiar o vole adulto (12-16 semanas) com uma overdose de pentobarbital (6,3 mg/animal) através de injeção intraperitoneal. Verifique a profundidade da anestesia pela ausência de reflexo do pedal em resposta a uma pitada firme do dedo do pé.
2. Uma vez que o vole é inteiramente anestesiado, induzir eutanásia por decapitação e recuperar a cabeça.
3. Dissecar a pele do crânio com uma tesoura, fazendo uma incisão caudal-rostral (15 mm de comprimento) para expor o crânio.
4. Corte os ossos occipital e interparietal e trace uma incisão no crânio ao longo das suturas sagital e parietal.
5. Faça um buraco no crânio na junção de ossos frontais e parietal usando uma tesoura, tendo muito cuidado para não danificar o tecido cerebral.
6. Para expor o cérebro, remova os fragmentos de crânio restantes que cobrem ambos os hemisférios cerebrais com pinças afiadas.
7. Use uma espátula de aço inoxidável para levantar todo o cérebro da base craniana.
8. Colete o cérebro em um tubo de centrífuga (50 mL) com 20 mL de solução de lavagem a frio.
9. Lave o cérebro duas vezes com a solução de lavagem a frio.

4. Microdisseção do tecido neural

1. Coloque uma placa de Petri em uma superfície cercada de gelo.
2. Deposite o cérebro no prato e adicione 20 mL de solução de lavagem a frio.
3. Com um bisturi, no plano coronal, divida o cérebro em dois blocos de tecido (rostral e caudal). Como referência neuroanatomética, realize o corte coronal no nível de Bregma no eixo anterior-posterior¹¹ (Figura 1A, linha sólida).
4. Do bloco rostral, extraia o tecido VZ(Figura 1B),enquanto do bloco caudal remover o DG(Figura 1C).
5. Dissecar o VZ sob um microscópio estéreo.
   1. Com um fórceps Dumont, segure um dos hemisférios; em seguida, insira, na altura do ventrículo, as pontas finas de um segundo fórceps Dumont sob o tecido que reveste o caudate-putamen(Figura 2A).
   2. Abra os fórceps ao longo do eixo dorsoventral para separar o tecido.
   3. Colete o tecido VZ por indivíduo em um tubo de centrífuga com 2 mL de solução de lavagem a frio. Não acumule o tecido de mais de dois animais.
   4. Repita a microdisseção no outro hemisfério.
   5. Armazene o tubo contendo o tecido VZ bilateral no gelo e continue dissecando o DG.
6. Dissecar o DG do bloco caudal sob um microscópio estéreo.
   1. Com um bisturi, faça um corte coronal no bloco para obter duas fatias, nas quais a formação hipocampal é observada. Como marco, o corte é feito a coordenadas de -2 mm Bregma no eixo anterior-posterior de acordo com o cérebro do camundongo atlas¹¹ (Figura 1A, linha pontilhada e Figura 1C).
   2. Com um fórceps Dumont, segure uma das fatias, e com fórceps Dumont de ponta fina fazem um corte horizontal entre DG e CA1 e, em seguida, realizam uma incisão vertical entre o DG e o CA3 para separar o DG (Figura 2B).
   3. Repita a dissecção na primeira fatia do outro hemisfério.
   4. Repita a dissecção em ambos os hemisférios na segunda fatia.
   5. Colete os quatro pedaços de DG de cada vole em um tubo de centrífuga. Não acumule o tecido DG de mais de dois animais.
      NOTA: Se for necessária dissecção de mais de um animal, armazene os tubos de centrífugas com o tecido VZ ou DG no gelo enquanto continua a dissecar o resto do cérebro. Remova todos os vasos sanguíneos que cobrem o tecido cerebral enquanto dissecam. Se os vasos não forem descartados, a cultura pode ser misturada com um excesso de eritrócitos e perturbar a formação da neurosfera.

5. Isolamento de células neurais

1. Coloque os tubos de centrífugas dentro do armário de biossegurança e espere cerca de 10 minutos para que os fragmentos de tecido precipitam pela gravidade.
2. Remova a solução de lavagem e adicione 1 mL da solução enzimática quente a cada tubo.
3. Incubar os tubos a 37 °C por 10 min.
4. Desintegrar os fragmentos teciduais; pipeta para cima e para baixo com uma ponta de 1 mL. Não pipeta mais de 30x.
5. Realizar uma segunda incubação de 10 min a 37 °C.
6. No final da segunda incubação, pipeta para quebrar os tecidos. Não pipeta mais de 30x.
   NOTA: Após a pipetação, os fragmentos de tecido devem ser completamente desintegrados; se eles não forem desintegrados, incubar por mais 10 min a 37 °C e re-pipeta. O período de digestão não deve exceder 30 minutos.
7. Adicione 9 mL de N2 médio por tubo para diluir o tratamento enzimático.
8. Centrifugar os tubos a 200 x g por 4 min a temperatura ambiente.
9. Descarte o supernaspe e lave com 10 mL de meio N2.
10. Centrífuga sob as mesmas condições do passo 5.8.
11. Remova o supernascedor de cada tubo e resuspenja as pelotas celulares do VZ e DG em 2 mL e 1 mL do meio B27, respectivamente.
12. Para remover qualquer tecido não desintegrado, filtre cada suspensão celular usando um coador celular (tamanho 40 μm).

6. Formação de neuroesferas

1. Cultura as células passaram através do coador em um acessório ultra-baixo, placa de 24 poços. Use dois poços para o VZ e um bem para o DG (1 mL de B27 médio/bem).
2. Adicione 20 ng/mL de FGF2 e 20 ng/mL de EGF a cada poço (concentração final 1x).
3. Incubar a 37 °C, 5% de CO₂ e alta umidade (90-95%). Não perturbe por 48 h (dia 1 e dia 2 de cultura, D1-D2).
4. No terceiro dia (D3), remova metade do meio de cultura e substitua-o por meio B27 fresco (500 μL por poço) complementado com dupla concentração (2x) de fatores de crescimento.
5. Repita a cada três dias, mude o meio de cultura (metade dele) e substitua-o por um novo meio B27 complementado com dupla concentração (2x) de fatores de crescimento.
6. Nos dias em que não é necessário mudar o meio cultural, adicione fatores de crescimento a uma concentração final de 1x.
7. Certifique-se de que as neurosferas são formadas em torno de D8-D10.
8. Na D10, mude o meio de cultura completo para remover todos os detritos.
   1. Colete os meios e neuroesferas individualmente de cada poço em tubos de centrífuga.
   2. Incubar por 10 minutos em temperatura ambiente. Este procedimento permite a precipitação das neurosferas pela gravidade.
   3. Remova o supernasal e resuspende em 1 mL de médio B27 fresco complementado com fatores de crescimento.
   4. Coloque as neuroferas de volta na mesma placa de fixação ultra-baixa e incubar a 37 °C, 5% DE CO₂.
9. De D10 para D15, continue mudando metade do meio e adicionando fatores de crescimento.

7. Passagem das neurosferas

1. Na D15 da cultura primária, colete as neurosferas em tubos de centrífuga usando pipeta de 1 mL. Corte a ponta da pipeta para aumentar o tamanho da abertura para evitar danos às neurosferas.
2. Incubar por 10 minutos em temperatura ambiente. Neuroferas precipitam pela gravidade.
3. Retire o meio e adicione 1 mL do meio de descolamento celular por tubo.
4. Incubar os tubos por 7 min a 37 °C.
5. Pipeta para cima e para baixo com uma ponta de 1 mL para desmontar as neurosferas.
6. Diluir o meio de descolamento celular com 3 mL de meio B27 por tubo.
7. Centrifugar a suspensão celular por 5 min a 200 x g.
8. Descarte o supernasce e resuspenque cada pelota celular com um meio B27 fresco complementado com fatores de crescimento.
   1. Resuspend as células derivadas de VZ em 4 mL de células médias e derivadas de DG em 2 mL de médio.
9. Cultura as células (passagem 1) em uma nova placa de fixação ultra-baixa, dobrando o número de poços que foram utilizados na cultura primária (4 e 2 poços para VZ e DG, respectivamente).
10. Troque metade do meio a cada três dias e adicione fatores de crescimento diariamente.
11. Após 10 dias (D10) na passagem 1, mude para condições aderentes na próxima passagem.

8. A passagem em condições aderentes

1. Antes de realizar a passagem 2, prepare placas revestidas com poli-L-ornithine e laminina.
   1. Em placas de 24 poços, adicione 500 μL de 1x poli-L-ornithine (20 μg/mL) por poço. Incubar a 37 °C durante a noite.
   2. Remova o poli-L-ornithine e lave 4x com 1x PBS (500 μL/well).
   3. Adicione 200 μL (volume mínimo para cobrir a superfície de um único poço) de 1x laminina (5 μg/mL) por poço e incubar por 2-3 h a 37 °C antes de cultivar as células.
2. Colete as neuroesferas com pipeta de 1 mL com pontas cortadas em um tubo de centrífuga.
3. Incubar por 10 minutos à temperatura ambiente para precipitar as neurosferas pela gravidade.
4. Descarte o supernasce e resuspenque as neurosferas em um novo meio B27 sem fatores de crescimento.
5. Aspire a laminina da placa revestida e deposite as neurosferas nos poços usando pipetas de 1 mL com pontas cortadas.
   NOTA: Evite que os poços revestidos sequem entre a remoção de laminina e as neuroesferas de revestimento.
6. Divida a cultura em duas condições:
   1. Manter neuroesferas diferenciadas por 6 dias (D6). Mude o meio a cada três dias e adicione fatores de crescimento diariamente.
   2. Observe a diferenciação das células derivadas da neurosfera em 12 dias (D12). Mude o meio a cada três dias sem fatores de crescimento.
      NOTA: No final do D6 para condições indiferenciadas ou D12 para condições de diferenciação, as células podem ser usadas para imunohistoquímica convencional, análise de classificação celular, coloração 5-Ethynyl-2'-deoxyuridina (EdU), extração de RNA, entre outras.

Resultados

As neurosferas foram formadas a partir de células-tronco neurais isoladas do VZ e DG de voles de pradarias adultas femininas e masculinas. Cerca de 8-10 dias após o início da cultura, as células deveriam ter formado as neuroesferas. Note que a placa pode conter detritos na cultura primária(Figura 3A). No entanto, na passagem 1 a cultura deve consistir apenas de neuroesferas (Figura 3B).

Maior número de neurosferas foram obtidas ...

Discussão

Um estágio para obter uma cultura de células-tronco neurais é o período de digestão com a solução enzimática, que não deve exceder mais de 30 minutos porque pode diminuir a viabilidade celular. As neurosferas devem surgir entre 8 e 10 dias após a cultura inicial; se eles não emergirem até o dia 12, descartem a cultura e repitam o experimento, reduzindo o período de digestão. Outra questão são os vasos sanguíneos que cobrem o tecido cerebral. Eles devem ser completamente removidos durante a dissecção po...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies			Antibody ID
Anti-Nestin	GeneTex	GTX30671	RRID:AB_625325
Anti-Doublecortin	MERCK	AB2253	RRID:AB_1586992
Anti-Ki67	Abcam	ab66155	RRID:AB_1140752
Anti-MAP2	GeneTex	GTX50810	RRID:AB_11170769
Anti-GFAP	SIGMA	G3893	RRID:AB_477010
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11029	RRID:AB_2534088
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A-11036	RRID:AB_10563566
Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11073	RRID:AB_2534117
Culture reagents
Antibiotic-Antimycotic	Thermo Fisher Scientific/Gibco	15240062	100X
B-27 supplement	Thermo Fisher Scientific/Gibco	17504044	50X
Collagenase, Type IV	Thermo Fisher Scientific/Gibco	17104019	Powder
Dispase	Thermo Fisher Scientific/Gibco	17105041	Powder
DMEM/F12, HEPES	Thermo Fisher Scientific/Gibco	11330032
Glucose	any brand		Powder, Cell Culture Grade
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific/Gibco	35050061	100X
HEPES	any brand		Powder, Cell Culture Grade
Mouse Laminin	Corning	354232	1 mg/mL
N-2 supplement	Thermo Fisher Scientific/Gibco	17502048	100X
NAHCO3	any brand		Powder, Suitable for Cell Culture
Neurobasal	Thermo Fisher Scientific/Gibco	21103049
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific/Gibco	10010023	1X
Poly-L-ornithine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P3655	Powder
Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15
Recombinant Human FGF-basic	Peprotech	AF-100-18B
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Thermo Fisher Scientific/Gibco	A1110501	100 mL
Disposable material
24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates	Corning/Costar	3473
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates	Corning/Costar	3526
40 µm Cell Strainer	Corning/Falcon	352340	Blue
Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 µm pore	Corning	431118	PES membrane, 45 mm diameter neck
Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube	any brand		with conical bottom
Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl.	any brand
Sterile cotton gauzes
Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL	any brand
Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL	any brand
Sterile surgical gloves	any brand
Syringe Filters, 0.22 µm pore	Merk Millipore	SLGPR33RB	Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter
Equipment and surgical instruments
Biological safety cabinet
Dissecting Scissors
Dumont Forceps
Motorized Pipet Filler/Dispenser
Micropipettes
Petri Dishes
Scalpel Blades
Stainless-steel Spatula