תרבות הנוירוספירות הנגזרות מהנישות הנוירוגניות בערבה בוגרת וול

Summary

הקמנו את התנאים לתאי האבות העצביים של התרבות מהתת-ונטריקולרי ולתהדר את המוח הבוגר של הערבה, כמשלים במחקר מבחנה, כדי לנתח את ההבדלים התלויים במין בין גומחות נוירוגניות שיכולות להיות חלק משינויים פלסטיים פונקציונליים הקשורים להתנהגויות חברתיות.

Abstract

נוירוספירות הן אגרגטים של תאים עיקריים המרכיבים תאי גזע עצביים ותאי ם. מבנים תלת-מית-מיוד אלה הם כלי מצוין כדי לקבוע את פוטנציאל ההבידול וההתפשטות של תאי גזע עצביים, כמו גם ליצור קווי תאים ממה שניתן לומר לאורך זמן. כמו כן, נוירוספירות יכולות ליצור נישה (במבחנה) המאפשרת מידול של הסביבה המשתנה דינמי, כגון גורמי גדילה שונים, הורמונים, נוירוטרנסמיטורים, בין היתר. מיקרוטוס ochrogaster (בערבה vole) הוא מודל ייחודי להבנת הבסיס הנוירוביולוגי של התנהגויות חברתיות-מיניות וקוגניציה חברתית. עם זאת, המנגנונים הסלולריים המעורבים בהתנהגויות אלה אינם ידועים היטב. הפרוטוקול נועד להשיג תאים עצביים האבות מן הנישות הנוירוגניות של vole הערבה למבוגרים, אשר תרבותיים בתנאים שאינם דבקים, כדי ליצור נוירוספירות. הגודל והמספר של נוירוספירות תלויים באזור (אזור תת-זוויתי או גירוס דנת) ומין של vole הערבה. שיטה זו היא כלי יוצא דופן כדי ללמוד הבדלים תלויי מין נישות נוירוגניות במבחנה ואת השינויים neuroplasticity הקשורים התנהגויות חברתיות כגון מליטה זוג וטיפול דו-הורנטלי. כמו כן, ניתן לבחון מצבים קוגניטיביים הכרוכים בגירעונות באינטראקציות חברתיות (הפרעות בספקטרום האוטיסטי וסכיזופרניה).

Introduction

הערבה וול(Microtus ochrogaster),חברה בממשפחה קריסטיידה, היא יונק קטן שאסטרטגיית חייו מתפתחת כזן מונוגמי וחברתי מאוד. גם זכרים וגם נקבות יוצרים קשר זוגי מתמשך לאחר הזדווגות או תקופות ארוכות של חיים משותפים המאופיין בשיתוף הקן, בהגנה על הטריטוריה שלהם, והצגת טיפול דו-רנטלי^{עבור ציניהם 1,2,3,4}. לכן, vole הערבה הוא מודל בעל ערך להבנת הבסיס הנוירוביולוגי של התנהגות חברתית-מינית וליקויים בקוגניציה^{חברתית 5}.

נוירוגנזה למבוגרים היא אחד התהליכים החשובים ביותר של פלסטיות עצבית שמובילה לשינויים התנהגותיים. לדוגמה, קבוצת המחקר שלנו דיווחה בגברים כי שיתוף פעולה חברתי עם הזדווגות גדל התפשטות תאים באזור subventricular (VZ) ואת האזור subgranular ב גירוס dentate (DG) של ההיפוקמפוס, מציע כי neurogenesis למבוגרים יכול לשחק תפקיד בהתהוות של מליטה זיווג המושרה על ידי הזדווגות בערבה voles (נתונים שלא פורסם). מצד שני, למרות אזורי המוח שבו נוירונים חדשים נוצרים ומשולבים ידועים היטב, המנגנונים המולקולריים והסלולריים המעורבים בתהליכים אלה נשארים לא נקבעו בשל חסרונות טכניים בכל מודל המוח⁶. לדוגמה, מסלולי האיתות השולטים בביטוי גנים ובפעילויות תאיות אחרות יש תקופת הפעלה קצרה יחסית (זיהוי של פוספורוטום)⁷. מודל חלופי אחד הוא מבודד ותרבותי תאי גזע עצביים למבוגרים או תאים רבי דרך כדי להברר רכיבים מולקולריים מעורבים neurogenesis למבוגרים.

הגישה הראשונה לשמור על מבשרים עצביים מבחנה ממוח יונקים בוגרים (עכבר) הייתה ההסתה של נוירוספירות, שהם אגרגטים תאיים הגדלים בתנאים שאינם דבקים אשר משמרים את הפוטנציאל הרב-תכליתי שלהם ליצור נוירונים,^{כמו גם אסטרוציטים 8,9,10}. במהלך הפיתוח שלהם, יש תהליך בחירה שבו רק מבשרים יגיבו מיטוגנים כגון גורם גדילה אפידרמיס (EGF) ופיברובלסט גורם גדילה 2 (FGF2) כדי להתרבות וליצור נוירוספירות^8,9,10.

למיטב ידיעתנו, לא דווח על פרוטוקול בספרות כדי להשיג אנשים עצביים בוגרים מ"ערבה וול". כאן, ביססנו את תנאי התרבות כדי לבודד אבות עצביים מתוך נישות נוירוגניות ותחזוקת המבחנה שלהם באמצעות היווצרות נוירוספרה. לפיכך, ניתן לתווך ניסויים כדי לזהות את המנגנונים המולקולריים והסלולריים המעורבים בהתפשטות, הגירה, בידול והישרדות של תאי גזע עצביים וקרבות, תהליכים שעדיין אינם ידועים בערבה. יתר על כן, ההברה בהבדלים במבחנה במאפייני התאים הנגזרים VZ ו- DG יכול לספק מידע על התפקיד של נישות נוירוגניות ב פלסטיות עצבית הקשורים לשינויים בהתנהגות חברתית-מינית והתנהגויות קוגניטיביות, וגירעונות באינטראקציות חברתיות (הפרעת הספקטרום האוטיסטי וסכיזופרניה), אשר יכול להיות גם תלוי מין.

Protocol

המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה המחקרית של המשקעים לנוירוביולוגיה, אוניברסיטת נאסיונאל אוטונומה דה מקסיקו, מקסיקו והמשקע הלאומי של פריאנטולוגיה (2018-1-163). הרבייה, הטיפול ונקודות הקצה ההומניות של בעלי החיים הוקמו על פי התקן המקסיקני הרשמי (NOM-062-Z00-1999) המבוסס על "Ley General de Salud en Materia de Investigación para la Salud" (חוק הבריאות הכללי לחקר הבריאות) של מזכירות הבריאות המקסיקנית.

1. הכנת פתרונות ומניות

1. להכין מדיום תרבות N2 עם 485 מ"ל של הנשר שונה של Dulbecco בינוני-F12 (DMEM-F12), 5 מ"ל של N2 תוספת (100x), 5 מ"ל של תוסף גלוטמין (100x) ו 5 מ"ל של אנטיביוטי אנטימיקוטי (100x).
2. להכין B27 תרבות בינונית עם 480 מ"ל של Neurobasal בינוני, 10 מ"ל של תוספת B27 (50x), 5 מ"ל של תוסף גלוטמין, ו 5 מ"ל של אנטיביוטי אנטיביוטי אנטימיקוטי (100x).
3. אבקת קולגנאז מחדש ב- 1 pBS (תמיסת מלח עם אגירה פוספט) כדי להשיג aliquots עם פעילות של 100 יחידות / μL (1000x) ולאחסן ב -20 °C. שימו לב, פעילות הקולג'נאז תלויה במספר החברות.
4. להכין את ההפחתה של מניות aliquots על ידי המסת 5 מ"ג של אבקת דיספסה ב 1x PBS (50 מ"ג / מ"ל). לאחסן ב -20 °C.
5. להכין פתרון אנזימטי עם 100 מ"ל של DMEM-F12 בינוני, 50 μL של collagenase מניות (100 יחידות / μL) יש ריכוז סופי של 50 U /mL ו 333 μL של מניות dispase (50 מ"ג/ מ"ל) יש ריכוז סופי של 0.33 מ"ג / מ"ל.
6. כדי להכין פתרון כביסה, ל-1,000 מ"ל של 1x PBS, להוסיף 0.4766 גרם של HEPES (ריכוז סופי 2 מ'), 3.6 גר' של D-גלוקוז (ריכוז סופי 20 מ"ר) ו-2.1 גרם של NaHCO_{3 (ריכוז} סופי 25 מ"ר).
7. הכן aliquots מניות פולי-L-ornithine (1 מ"ג / מ"ל) באמצעות מים סטריליים ולאחסן ב -20 ° C.
8. הכן פתרון עבודה של פולי-L-ornithine. לדלל aliquot מניות (1 מ"ג / מ"ל) ב 49 מ"ל של מים סטריליים לריכוז סופי של 20 μg / מ"ל.
9. הכן פתרון עבודה של למינין. לדלל 25 μL של למינין (1 מ"ג / מ"ל המקורי) ב 5 מ"ל של מים סטריליים עבור ריכוז סופי של 5 μg / מ"ל.
   הערה: לאחר ההכנה, סנן את אמצעי התקשורת של התרבות, העבודה ופתרונות המלאי כדי למנוע זיהום. השתמשו במסנני ואקום מזרק או בקבוק עליון (קרום פוליאתרסולפון עם גודל נקבוביות של 0.2 μm). ניתן לאחסן את אמצעי התקשורת התרבות ופתרונות העבודה עד 30 יום ב- 4 °C, בעוד שניתן לאחסן את המניות עד ארבעה חודשים ב- -20 °C.

2. הכנה לפני תחילת microdissection

1. לחטא כלי ניתוח על ידי autoclaving או עם מחטא חרוז זכוכית חמה יבש.
2. נקה את שטח פני השטח של מיקרודיסטיסציה בתנאים קשים של אספטיים ודיספטיים (לדוגמה, עם מים אוזוניים).
   הערה: התזמון של microdissection של שני נישות נוירוגניות מכל מוח vole הוא כ 30 דקות. מומלץ לעבוד עם 1-4 בעלי חיים לכל ההליך.

3. חילוץ של המוח כולו

1. להרדים את vole למבוגרים (12-16 שבועות) עם מנת יתר של פנטוברביטל (6.3 מ"ג / בעלי חיים) באמצעות הזרקת תוך אפרטונל. ודא את עומק ההרדמה על-ידי היעדר רפלקס פדלים בתגובה לצביטת בהונות מוצקה.
2. ברגע שהוול מותם לחלוטין, לגרום המתת חסד על ידי עריפת ראש ולהחלים את הראש.
3. לנתח את העור מהגולגולת עם מספריים, מה שהופך חתך סיבתי-rostral (15 מ"מ ארוך) כדי לחשוף את הגולגולת.
4. חותכים את העצמות העורפיות והבין-פטריאליות ומאתרים חתך בגולגולת לאורך התפרים הסגית והקודקודית.
5. לעשות חור בגולגולת בצומת של עצמות פרונטליות וקודקודיות באמצעות מספריים, להיות זהיר מאוד לא לפגוע ברקמת המוח.
6. כדי לחשוף את המוח, הסר את שברי הגולגולת הנותרים שמכסים את שתי ההמיספרות במוח בפינצטה חדה.
7. השתמש מרית נירוסטה כדי להרים את כל המוח מבסיס הגולגולת.
8. לאסוף את המוח לתוך צינור צנטריפוגה (50 מ"ל) עם 20 מ"ל של פתרון כביסה קרה.
9. לשטוף את המוח פעמיים עם תמיסת השטיפה הקרה.

4. מיקרודיסציה של הרקמה העצבית

1. מניחים צלחת פטרי על משטח מוקף קרח.
2. מפקידים את המוח על הצלחת ומוסיפים 20 מ"ל של תמיסת שטיפה קרה.
3. עם אזמל, במטוס הקורונה, לחלק את המוח לשני בלוקים של רקמה (rostral וcaudal). כהתייחסות נוירואנאטומית, לבצע את חיתוך הקורונה ברמת Bregma בציר הקדמי-אחורי¹¹ (איור 1A,קו מוצק).
4. מבלוק rostral, לחלץ את רקמת VZ (איור 1B), בעוד מן הבלוק סיבתי להסיר את DG (איור 1C).
5. לנתח את VZ תחת מיקרוסקופ סטריאו.
   1. עם מפס דומונט, החזק את אחת ההמיספרות; לאחר מכן, הכנס, בשיא החדר, את הקצוות העדינים של מקצות דומונט שני מתחת לרקמות הקווים caudate-putamen(איור 2A).
   2. פתח את הממחצות לאורך ציר דורסווונטרל כדי להפריד את הרקמה.
   3. לאסוף את רקמת VZ לכל אדם בצינור צנטריפוגה עם 2 מ"ל של פתרון כביסה קרה. אין לאסוף את הרקמה של יותר משתי חיות.
   4. חזור על המיקרו-דיסציה בחצי הכדור השני.
   5. לאחסן את הצינור המכיל את רקמת VZ דו-צדדית על קרח ולהמשיך לנתח את DG.
6. לנתח את DG מבלוק סיבתי תחת מיקרוסקופ סטריאו.
   1. עם אזמל, לעשות חיתוך קורונלי לתוך הבלוק כדי להשיג שתי פרוסות, שבו היווצרות ההיפוקמפוס נצפתה. כציון דרך, החתך נעשה ב -2 מ"מ Bregma קואורדינטות בציר הקדמי-אחורי על פי אטלס^{מוח העכבר 11} (איור 1A, קו מנוקד איור 1C).
   2. עם מקציצות דומונט, החזק את אחת הפרוסות, ועם מקצות דומונט נקודה עדינה לעשות חתך אופקי בין DG ו CA1 ולאחר מכן לבצע חתך אנכי בין DG ו CA3 כדי להפריד את DG (איור 2B).
   3. חזור על החתך בפרוסה הראשונה של חצי הכדור השני.
   4. חזור על החתך בשתי ההמיספרות בפרוסה השנייה.
   5. לאסוף את ארבע חתיכות DG של כל vole בצינור צנטריפוגה. אין לאסוף את רקמת ה-DG של יותר משתי חיות.
      הערה: אם יש צורך בניתוח של יותר מלחיות אחד, יש לאחסן את צינורות הצנטריפוגה עם רקמת VZ או DG על קרח תוך המשך ניתוח שאר המוח. הסר את כל כלי הדם שמכסים את רקמת המוח בזמן ה ניתוח. אם כלי הדם לא נזרקים, התרבות יכולה להיות מעורבת עם עודף של אריתרושיטים ולהפריע היווצרות נוירוספרה.

5. בידוד תאים עצביים

1. מניחים את צינורות הצנטריפוגה בתוך ארון ההשבחה הביולוגית והמתינו כ-10 דקות עד שרסיסי הרקמה יאיצו מכוח הכבידה.
2. הסר את תמיסת השטיפה והוסף 1 מ"ל של הפתרון האנזימטי החם לכל שפופרת.
3. דגירה את הצינורות ב 37 ° C במשך 10 דקות.
4. לפורר את שברי הרקמה; פיפטה למעלה ולמעלה עם קצה של מ"ל אחד. אין פיפט יותר מ 30x.
5. לבצע דגירה שנייה של 10 דקות ב 37 °C.
6. בסוף הדגירה השנייה, פיפטה לשבור את הרקמות. אין פיפט יותר מ 30x.
   הערה: לאחר pipetting, שברי הרקמה צריך להיות התפורר לחלוטין; אם הם לא התפוררו, דגירה עוד 10 דקות ב 37 °C ו-re-pipette. תקופת העיכול לא צריכה לחרוג מ-30 דקות.
7. להוסיף 9 מ"ל של N2 בינוני לכל שפופרת כדי לדלל את הטיפול האנזימטי.
8. צנטריפוגה את הצינורות ב 200 x g עבור 4 דקות בטמפרטורת החדר.
9. השליכו את הסופרנטנט ושטפו עם 10 מ"ל של N2 בינוני.
10. צנטריפוגה באותם תנאים כמו שלב 5.8.
11. הסר את supernatant מכל צינור ולתחות מחדש את כדורי התא של VZ ו DG ב 2 מ"ל ו 1 מ"ל של B27 בינוני, בהתאמה.
12. כדי להסיר כל רקמה לא מפורקת, לסנן כל מתלה תאי באמצעות מסננת תא (גודל 40 μm).

6. היווצרות נוירוספירות

1. תרבות התאים עברו דרך מסננת לחיבור אולטרה נמוך, צלחת 24 באר. השתמש בשתי בארות עבור VZ ואחד באר עבור DG (1 מ"ל של B27 בינוני / באר).
2. להוסיף 20 ng/mL של FGF2 ו 20 ng/mL של EGF לכל באר (ריכוז סופי 1x).
3. דגירה ב 37 °C, 5% CO₂ ולחות גבוהה (90-95%). נא לא להפריע במשך 48 שעות (יום 1 ויום 2 של תרבות, D1-D2).
4. ביום השלישי (D3), להסיר מחצית מדיום התרבות ולהחליף אותו עם טרי B27 בינוני (500 μL לבאר) בתוספת ריכוז כפול (2x) של גורמי גדילה.
5. חזור על כל יום שלישי, לשנות את מדיום התרבות (חצי ממנו) ולהחליף אותו עם בינוני B27 טרי בתוספת ריכוז כפול (2x) של גורמי גדילה.
6. בימים בהם אין צורך לשנות את מדיום התרבות, להוסיף גורמי גדילה לריכוז הסופי של 1x.
7. ודא כי נוירוספירות נוצרים סביב D8-D10.
8. ב D10, לשנות את מדיום התרבות המלאה כדי להסיר את כל הפסולת.
   1. לאסוף את המדיום ונוירוספירות בנפרד של כל באר בצינורות צנטריפוגה.
   2. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הליך זה מאפשר נוירוספירות משקעים על ידי כוח המשיכה.
   3. הסר את supernatant וssuspend ב 1 מ"ל של B27 טרי בינוני בתוספת עם גורמי גדילה.
   4. הנח את הנוירוספירות בחזרה לאותה צלחת חיבור אולטרה-נמוכה ותדגרה ב-37°C, 5% CO₂.
9. מ- D10 ל- D15, המשך לשנות מחצית מהמדיום ולהוסיף גורמי גדילה.

7. מעבר של הנוירוספירות

1. ב D15 של התרבות העיקרית, לאסוף את הנוירוספירות לתוך צינורות צנטריפוגה באמצעות 1 מ"ל פיפטה. חותכים את קצה פיפטה כדי להגדיל את גודל הפתח כדי למנוע נזק לנוירוספירות.
2. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. נוירוספירות מזרזות על ידי כוח המשיכה.
3. הסר את המדיום והוסף 1 מ"ל של אמצעי הניתוק התא לכל שפופרת.
4. דגירה את הצינורות במשך 7 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
5. פיפטה למעלה ולמעלה עם קצה של מ"ל אחד כדי לפרק את הנוירוספירות.
6. לדלל את אמצעיניתנית התא עם 3 מ"ל של B27 בינוני לכל שפופרת.
7. צנטריפוגה מתלי התא במשך 5 דקות ב 200 x g.
8. השליכו את הסופרנטנט והתווסתו מחדש על כל כדור תא עם מדיום B27 טרי בתוספת גורמי גדילה.
   1. תוסתה מחדש את התאים המופקים מ-VZ ב-4 מ"ל של תאים בינוניים ותאים המופקים מ-DG ב-2 מ"ל של מדיום.
9. תרבות התאים (מעבר 1) בצלחת חדשה אולטרה נמוכה מצורף על ידי הכפלת מספר הבארים ששימשו בתרבות העיקרית (4 ו 2 בארות עבור VZ ו DG, בהתאמה).
10. לשנות מחצית המדיום כל יום שלישי ולהוסיף גורמי גדילה מדי יום.
11. לאחר 10 ימים (D10) במעבר 1, יש לשנות את התנאים הדבקים במעבר הבא.

8. המעבר בתנאים דבקים

1. לפני ביצוע המעבר 2, להכין צלחות מצופה עם פולי-L-ornithine ולמינין.
   1. ב 24-גם צלחות, להוסיף 500 μL של 1 פולי-L-ornithine (20 μg / מ"ל) לכל באר. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס בלילה.
   2. הסר את הפולי-L-ornithine ולשטוף 4x עם 1 pBS (500 μL / גם).
   3. להוסיף 200 μL (נפח מינימלי כדי לכסות את פני השטח של באר אחת) של 1x למינין (5 μg / מ"ל) לכל באר דגירה במשך 2-3 שעות ב 37 ° C לפני טיפוח התאים.
2. לאסוף את הנוירוספירות עם פיפטה 1 מ"ל עם טיפים לחתוך לתוך צינור צנטריפוגה.
3. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לזרז את הנוירוספירות על ידי כוח הכבידה.
4. השליכו את הסופרנטנט ופנסו מחדש את הנוירוספירות במדיום B27 טרי ללא גורמי גדילה.
5. לשאוף את ה למינין מהצלחת המצופה ולהפקיד את neurospheres לתוך הבארות באמצעות 1 מ"ל pipettes עם טיפים לחתוך.
   הערה: למנוע בארות מצופה מתייבש בין הסרת למינין וציפוי נוירוספירות.
6. לחלק את התרבות לשני תנאים:
   1. לשמור על נוירוספירות מובינות במשך 6 ימים (D6). לשנות את המדיום כל יום שלישי ולהוסיף גורמי גדילה מדי יום.
   2. צפה בהבדיל של התאים הנגזרים נוירוספרה על ידי 12 ימים (D12). לשנות את המדיום כל יום שלישי ללא גורמי גדילה.
      הערה: בסוף D6 עבור D12 מוערך או D12 עבור תנאי בידול, התאים יכולים לשמש עבור חיסונים קונבנציונליים, ניתוח מיון תאים, 5-אתניל-2'-deoxyuridine (EdU) כתם, חילוץ RNA, בין היתר.

תוצאות

נוירוספירות נוצרו מתאי גזע עצביים מבודדים VZ ו DG של שני זכר ערבה voles. כ 8-10 ימים לאחר תחילת התרבות, תאים היו צריכים להקים את הנוירוספירות. שים לב כי הלוח עשוי להכיל פסולת בתרבות העיקרית(איור 3A). עם זאת, בפסקה 1 התרבות צריכה להיות מורכבת רק נוירוספירות(איור 3B).

Discussion

שלב כדי להשיג תרבות תאי גזע עצביים היא תקופת העיכול עם הפתרון אנזימטי, אשר לא צריך לחרוג יותר מ 30 דקות כי זה עלול להקטין את הכדאיות של התא. נוירוספירות צריך להופיע ב 8-10 ימים לאחר התרבות הראשונית; אם הם לא יופיעו ביום ה-12, בטלו את התרבות וחזרו על הניסוי, תוך צמצום תקופת העיכול. בעיה נוספת היא כל...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies			Antibody ID
Anti-Nestin	GeneTex	GTX30671	RRID:AB_625325
Anti-Doublecortin	MERCK	AB2253	RRID:AB_1586992
Anti-Ki67	Abcam	ab66155	RRID:AB_1140752
Anti-MAP2	GeneTex	GTX50810	RRID:AB_11170769
Anti-GFAP	SIGMA	G3893	RRID:AB_477010
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11029	RRID:AB_2534088
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A-11036	RRID:AB_10563566
Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11073	RRID:AB_2534117
Culture reagents
Antibiotic-Antimycotic	Thermo Fisher Scientific/Gibco	15240062	100X
B-27 supplement	Thermo Fisher Scientific/Gibco	17504044	50X
Collagenase, Type IV	Thermo Fisher Scientific/Gibco	17104019	Powder
Dispase	Thermo Fisher Scientific/Gibco	17105041	Powder
DMEM/F12, HEPES	Thermo Fisher Scientific/Gibco	11330032
Glucose	any brand		Powder, Cell Culture Grade
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific/Gibco	35050061	100X
HEPES	any brand		Powder, Cell Culture Grade
Mouse Laminin	Corning	354232	1 mg/mL
N-2 supplement	Thermo Fisher Scientific/Gibco	17502048	100X
NAHCO3	any brand		Powder, Suitable for Cell Culture
Neurobasal	Thermo Fisher Scientific/Gibco	21103049
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific/Gibco	10010023	1X
Poly-L-ornithine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P3655	Powder
Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15
Recombinant Human FGF-basic	Peprotech	AF-100-18B
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Thermo Fisher Scientific/Gibco	A1110501	100 mL
Disposable material
24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates	Corning/Costar	3473
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates	Corning/Costar	3526
40 µm Cell Strainer	Corning/Falcon	352340	Blue
Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 µm pore	Corning	431118	PES membrane, 45 mm diameter neck
Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube	any brand		with conical bottom
Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl.	any brand
Sterile cotton gauzes
Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL	any brand
Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL	any brand
Sterile surgical gloves	any brand
Syringe Filters, 0.22 µm pore	Merk Millipore	SLGPR33RB	Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter
Equipment and surgical instruments
Biological safety cabinet
Dissecting Scissors
Dumont Forceps
Motorized Pipet Filler/Dispenser
Micropipettes
Petri Dishes
Scalpel Blades
Stainless-steel Spatula