성인 프레리 볼레스의 신경질성 틈새에서 파생된 신경구 의 문화

요약

우리는 뇌원내에서 신경 전구세포를 배양하고, 대초원의 성인 뇌의 자이루스를 배양하는 조건을 확립하고, 체외 연구의 보완적인 것으로, 사회적 행동과 관련된 기능성 플라스틱 변화의 일부가 될 수 있는 신경성 틈새 시장 간의 성 의존적 차이를 분석하였다.

초록

신경구는 신경 줄기 세포와 전구 세포를 포함하는 1 차세포 집계입니다. 이러한 3D 구조는 신경 줄기 세포의 분화 및 확산 잠재력을 결정할 뿐만 아니라 시간이 지남에 따라 분석될 수 있는 세포주를 생성하는 훌륭한 도구입니다. 또한, 신경 구는 틈새 시장을 만들 수 있습니다 (체 외) 동적 변화 환경의 모델링을 허용, 다양 한 성장 인자 등, 호르몬, 신경 전달 물질, 다른 사람의 사이에서. 마이크로투스 오크로가스터(대초원 vole)는 사회 성 행동과 사회적 인식의 신경생물학적 기초를 이해하는 독특한 모델입니다. 그러나 이러한 동작과 관련된 세포 메커니즘은 잘 알려져 있지 않습니다. 이 프로토콜은 신경구를 생성하기 위해 비 준수 조건하에서 배양되는 성인 대초원의 신경 성 틈새에서 신경 전구 세포를 얻는 것을 목표로합니다. 신경구의 크기와 수는 지역 (서브 벤토리 영역 또는 dentate gyrus) 및 대초원 vole의 섹스에 따라 달라집니다. 이 방법은 시험관 내 신경 성 틈새 에서 성에 의존적인 차이와 쌍 결합 및 쌍 부모 치료와 같은 사회적 행동과 관련된 신경 가소성 변화를 연구하는 놀라운 도구입니다. 또한 사회적 상호 작용 (자폐증 스펙트럼 장애 및 정신 분열증)의 적자를 수반하는 인지 상태를 검사 할 수 있었습니다.

서문

크리스티대 가족의 일원인 대초원볼(마이크로투스 오크로가스터)은사회적으로 일부일처화하고 사교적인 종으로 생활 전략이 발전하는 작은 포유류입니다. 남성과 여성 모두 결합 후 지속적인 쌍 유대를 설정하거나 둥지를 공유, 자신의 영토를 방어, 자신의 자손에 대한 양부모 치료를 표시 하는^특징의긴 기간^1,2,3,4. 따라서, 대초원 볼은 사회 인식^5에서사회 성 행동 및 손상의 신경 생물학적 기초를 이해하는 귀중한 모델이다.

성인 신경 발생은 행동 변화로 이어지는 신경 가소성의 가장 중요한 과정 중 하나입니다. 예를 들어, 우리의 연구 그룹은 해마의 축산 자이러스 (DG)에서 세포 증식을 증가 결합과 사회적 동거가 남성 voles에서보고, 성인 신경 발생이 대초원 voles에서 짝짓기하여 유도 쌍 결합의 형성에 역할을 할 수 있음을 시사 (출판되지 않은 데이터). 한편, 새로운 뉴런이 생성되고 통합되는 뇌 영역은 잘 알려져 있지만, 이러한 과정에 관여하는 분자 및 세포 메커니즘은 전체 뇌 모델^6의기술적 단점으로 인해 결정되지 않은 상태로 남아 있다. 예를 들어, 유전자 발현 및 기타 세포 활동을 제어하는 신호 경로는 비교적 짧은 활성화 기간(인포프로테온의 검출)^7을갖는다. 한 가지 대체 모델은 성인 신경 발생에 관여하는 분자 성분을 해명하기 위해 성인 신경 줄기 세포 또는 전구 세포를 분리하고 배양합니다.

성인 포유동물(mouse) 뇌로부터 체외 신경 전구체를 유지하는 첫 번째 접근법은 신경세포를 생성하는 다능성 잠재력을 보존하는 비응성 조건하에서 성장하는 세포 집계인 신경권의 분석과 성상세포^{8,9,10이었다.} 이들의 발달 과정에서, 전구체만이 피피성장인자(EGF) 및 섬유아세포 성장인자 2(FGF2)와 같은 미토겐에 반응하여 증식하고 신경구를 생성하는 선택 과정이 있다^8,9,10.

우리의 지식에, 어떤 프로토콜은 대초원 voles에서 성인 신경 선조를 얻기 위해 문학에서보고되지 않습니다. 여기에서, 우리는 신경질 틈새 에서 신경 선조및 신경권 형성 분석을 통해 그들의 체외 유지를 격리하는 배양 조건을 설치했습니다. 따라서, 실험은 신경 줄기 세포 및 선조의 증식, 마이그레이션, 분화 및 생존에 관여하는 분자 및 세포 메커니즘을 식별하도록 설계될 수 있으며, 대초원 vole에서 아직 알려지지 않은 공정. 더욱이, VZ와 DG에서 파생된 세포의 성질에 있는 체외 다름을 해명하는 것은 사회 성적인 행동 및 인지 행동의 변화와 관련되었던 신경 가소성에 있는 신경성 틈새 소각의 역할에 관하여 정보를 제공할 수 있고, 사회적인 상호 작용에 있는 적자 (자폐증 스펙트럼 무질서 및 정신 분열증), 또한 성 의존적일 수 있었습니다.

프로토콜

연구 결과는 Instituto de Neurobiología, Universidad Nacional Autónoma de México, 멕시코 및 Instituto Nacional de Perinatologia (2018-1-163)의 연구 윤리위원회에 의해 승인되었습니다. 동물의 번식, 관리 및 인도적 끝점은 멕시코 보건 사무국의 "Ley General de Salud en Materia de Investigación para la Salud"(건강 연구를 위한 일반 건강법)를 기반으로 한 공식 멕시코 표준(NOM-062-Z00-1999)에 따라 설립되었습니다.

1. 솔루션 및 주식 준비

1. 덜벡코의 수정독수리 중간-F12(DMEM-F12), N2 보충제 5mL(100x), 글루타민 보충제 5mL(100x), 항생제 항마이코틱(100x)의 5mL로 N2 배양 배지를 준비한다.
2. 신경물질 배지 480mL, B27 보충제 10mL(50배), 글루타민 보충제 5mL, 항생제 항마이코틱5mL(100x)로 B27 배양 배지를 준비한다.
3. 콜라게나아제 분말을 1x PBS(인산염 완충식식염)로 재구성하여 100단위/μL(1000x)의 활성을 가진 알리쿼를 얻고 -20°C에 보관한다. 공지, 콜라게나아제 활동은 회사의 많은 수에 따라 달라집니다.
4. 1x PBS(50 mg/mL)에서 디스파스 파우더 5 mg을 용해하여 디스파스 스톡 알리오트(dispase stock aliquots)를 준비하십시오. -20 °C에 보관하십시오.
5. DMEM-F12 배지 100mL, 주식 콜라게나아제 50 μL(100단위/μL)으로 효소 용액을 준비하여 최종 농도50 U/mL 및 333 μL의 스톡 디스파스(50 mg/mL)의 최종 농도를 갖도록 0.33 mg/mL의 최종 농도를 갖습니다.
6. 세척용액을 1x PBS 1,000mL로 준비하려면 HEPES 0.4766 g(최종 농도 2mM), D-포도당 3.6g(최종 농도 20mM) 및 NaHCO_3(최종 농도 25mM)의 2.1g을 추가한다.
7. 멸균물을 사용하여 폴리 L-올니틴 스톡 알리쿼트(1 mg/mL)를 준비하고 -20°C에 보관하십시오.
8. 폴리 L-오르니틴의 작업 솔루션을 준비합니다. 20 μg/mL의 최종 농도를 위해 49mL의 멸균 수에 육수 알리쿼트(1mg/mL)를 희석시하십시오.
9. 라미닌의 작업 솔루션을 준비합니다. 5 μg/mL의 최종 농도를 위해 멸균 수의 5mL에 라미닌 (1 mg/mL 원래 재고)의 25 μL을 희석하십시오.
   참고: 준비 후, 오염을 방지하기 위해 배양 매체, 작업 및 재고 솔루션을 필터링합니다. 주사기 또는 병 상단 진공 필터를 사용합니다 (0.2 μm 모공 크기의 폴레터술폰 멤브레인). 배양 배지 및 작업 용액은 4°C에서 최대 30일 동안 보관할 수 있으며, 주식은 -20°C에서 최대 4개월 동안 보관할 수 있다.

2. 미세 절을 시작하기 전에 준비

1. 자동 사용 또는 뜨거운 유리 비드 드라이 멸균제로 수술 기구를 살균하십시오.
2. 엄격한 무균 및 방부제 조건 (예 : 오존화 된 물)에서 미세 절 표면적을 청소하십시오.
   참고: 각 볼 뇌에서 신경질 틈새 의 미세 절의 타이밍은 약 30 분입니다. 전체 시술에 대해 1-4 마리의 동물과 함께 일하는 것이 좋습니다.

3. 전체 뇌의 추출

1. 성용 볼 (12-16 주)을 관면 주사를 통해 펜토 바르비탈 (6.3 mg / 동물)의 과다 복용으로 마취하십시오. 단단한 발가락 핀치에 대한 응답으로 페달 반사의 부재에 의해 마취의 깊이를 확인합니다.
2. 볼이 완전히 마취되면 참수로 안락사를 유도하고 머리를 회복하십시오.
3. 두개골에서 가위로 피부를 해부하여 두개골을 드러내기 위해 코살-로스트랄 절개(15mm 길이)를 만듭니다.
4. 후두와 간 간 뼈를 자르고 처진 및 정수리 봉합사를 따라 두개골에 절개를 추적합니다.
5. 가위를 사용하여 정면과 정수리 뼈의 접합에 두개골에 구멍을 확인, 뇌 조직을 손상시키지 않도록 매우 조심되고.
6. 뇌를 드러내려면 날카로운 뾰족한 핀셋으로 두 뇌 반구를 덮는 나머지 두개골 조각을 제거하십시오.
7. 스테인레스 스틸 주걱을 사용하여 두개골 기지에서 뇌 전체를 들어 올립니다.
8. 20mL의 냉세척 용액을 가진 원심분리기 튜브(50mL)로 뇌를 수집합니다.
9. 차가운 세척 용액으로 뇌를 두 번 씻으시면 됩니다.

4. 신경 조직의 미세 절

1. 얼음으로 둘러싸인 표면에 페트리 접시를 놓습니다.
2. 접시에 뇌를 착유하고 차가운 세척 용액 20mL를 추가합니다.
3. 메스와 함께, 관상 평면에서, 조직의 두 블록으로 뇌를 분할 (로스트랄과 코달). 신경 해부학적 참고로서, 전방 후방^{축(11)에서} 브레그마 수준에서 관상 절단을수행한다(도 1A,고선).
4. 로스트랄 블록으로부터, VZ조직(도 1B)을추출하고, 소달 블록으로부터 DG(도1C)를제거한다.
5. 스테레오 현미경으로 VZ를 해부합니다.
   1. 두몬트 집게로 반구 중 하나를 잡으십시오. 그런 다음, 심실의 높이에서, 카우다테-푸타멘(그림2A)을일렬로 세워주는 조직 하에서 두 번째 듀몬트 집게의 미세한 팁을 삽입한다.
   2. 조직을 분리하기 위해 등쪽 축을 따라 집게를 엽니다.
   3. 콜드 워시 용액 2mL의 원심분리기 튜브에서 개인당 VZ 조직을 수집합니다. 두 개 이상의 동물의 조직을 풀지 마십시오.
   4. 다른 반구에서 미세 절을 반복합니다.
   5. 양자 VZ 조직을 포함하는 튜브를 얼음에 저장하고 DG를 해부계속합니다.
6. 스테레오 현미경의 밑에 caudal 블록에서 DG를 해부합니다.
   1. 메스를 사용하면 관상 동맥절단을 블록으로 잘라 두 조각을 얻으며 해마 형성이 관찰됩니다. 랜드마크로서, 컷은 마우스 뇌^{아틀라스(11)에} 따라 전방 후방 축에서 -2mm Bregma 좌표로만들어집니다(그림 1A,점선 및 도 1C).
   2. Dumont 집게를 사용하면 슬라이스 중 하나를 잡고 미세 한 점 두몬트 집게로 DG와 CA1 사이의 수평 절단을 한 다음 DG와 CA3 사이의 수직 절개를 수행하여 DG(그림 2B)를분리합니다.
   3. 다른 반구의 첫 번째 조각에서 해부를 반복합니다.
   4. 두 번째 슬라이스의 두 반구에서 해부를 반복합니다.
   5. 원심분리기 튜브에 각 볼의 4개의 DG 조각을 수집합니다. 두 개 이상의 동물의 DG 조직을 풀지 마십시오.
      참고: 두 개 이상의 동물의 해부가 필요한 경우, 뇌의 나머지 부분을 해부하면서 VZ 또는 DG 조직과 원심분리관을 얼음 위에 보관하십시오. 해부하는 동안 뇌 조직을 덮는 모든 혈관을 제거하십시오. 혈관이 버려지지 않으면 배양은 과도한 적혈구와 혼합되어 신경권 형성을 방해할 수 있습니다.

5. 신경 세포의 격리

1. 원심분리관을 생물안전 캐비닛 내부에 놓고 조직 파편이 중력에 의해 침전될 때까지 약 10분 정도 기다립니다.
2. 세척 용액을 제거하고 각 튜브에 따뜻한 효소 용액 1mL을 추가합니다.
3. 튜브를 37°C에서 10분 동안 배양합니다.
4. 조직 조각을 분해; 1 mL 팁으로 위아래로 파이펫. 30배 이상 파이펫을 사용하지 마십시오.
5. 37°C에서 10분의 두 번째 인큐베이션을 수행한다.
6. 두 번째 인큐베이션이 끝나면 조직을 분해하는 파이펫이 있습니다. 30배 이상 파이펫을 사용하지 마십시오.
   참고: 파이펫팅 후 조직 조각은 완전히 분해되어야 합니다. 붕괴되지 않으면 37°C에서 10분 동안 배양하고 다시 파이펫을 다시 피펫으로 배양합니다. 소화 기간은 30분 이상이어야 합니다.
7. 효소 처리를 희석하기 위하여 관 당 N2 매체의 9mL를 추가합니다.
8. 실온에서 4 분 동안 200 x g의 튜브원심분리기.
9. 상체를 버리고 N2 배지 의 10mL로 세척하십시오.
10. 5.8 단계와 동일한 조건에서 원심분리기.
11. 각 튜브에서 상체를 제거하고 각각 B27 배지의 2mL 및 1 mL에서 VZ 및 DG의 세포 펠릿을 재연한다.
12. 비분해 조직을 제거하려면 세포 여조(크기 40 μm)를 사용하여 각 세포 현탁액을 필터링합니다.

6. 신경권 형성

1. 세포가 스트레이너를 통과하여 초저 부착, 24웰 플레이트로 배양합니다. VZ에 두 개의 우물과 DG (B27 중간 / 웰의 1 mL)에 대한 하나의 우물을 사용합니다.
2. FGF2의 20 ng/mL과 각 웰(최종 농도 1x)에 EGF의 20 ng/mL을 추가합니다.
3. 37°C, 5% CO₂ 및 높은 습도(90-95%)에서 배양합니다. 48h(문화의 1일차 및 2일차, D1-D2)를 방해하지 마십시오.
4. 셋째 날(D3)에서는 배양 배지의 절반을 제거하고 성장 인자의 이중 농도(2배)로 보충된 신선한 B27 배지(웰당 500 μL)로 대체한다.
5. 매 3 일마다 반복, 배양 배지 (그것의 절반)를 변경 하 고 성장 인자의 이중 농도 (2 x)로 보충 신선한 B27 매체로 대체.
6. 배양 배지를 변경할 필요가 없는 날에는 1배의 최종 농도에 성장 인자를 추가합니다.
7. 신경구가 D8-D10 주위에 형성되는지 확인하십시오.
8. D10에서 전체 배양 매체를 변경하여 모든 이물질을 제거합니다.
   1. 원심분리기 튜브에서 각 우물의 배지와 신경구를 개별적으로 수집합니다.
   2. 실온에서 10분 동안 배양하십시오. 이 절차는 중력에 의해 신경구 강수량을 허용합니다.
   3. 상체를 제거하고 성장 요인으로 보충 된 신선한 B27 매체의 1 mL에서 재연하십시오.
   4. 신경구를 동일한 초저 부착 판에 다시 넣고 37 °C, 5 % CO_2에서배양합니다.
9. D10에서 D15로, 중간의 절반을 계속 변경하고 성장 요인을 추가합니다.

7. 신경구의 통과

1. 1차 배양의 D15에서, 1mL 파이펫을 사용하여 원심분리기 튜브로 신경구를 수집한다. 피펫 팁을 잘라 서 개구의 크기를 증가 하 여 신경 구체에 손상을 방지 합니다.
2. 실온에서 10분 동안 배양하십시오. 신경구는 중력에 의해 침전됩니다.
3. 배지를 제거하고 튜브 당 세포 분리 매체의 1 mL을 추가합니다.
4. 37°C에서 튜브를 7분 동안 배양합니다.
5. 피펫은 신경구를 해체하기 위해 1mL 팁으로 위아래로 합니다.
6. 튜브 당 B27 배지의 3 mL로 세포 분리 매체를 희석.
7. 200 x g에서5 분 동안 세포 현탁액을 원심 분리합니다.
8. 상체를 버리고 성장 요인으로 보충된 신선한 B27 배지로 각 세포 펠릿을 재연하십시오.
   1. VZ 유래 세포를 배지의 4mL 및 DG 유래 세포에서 2mL의 배지에서 재중단한다.
9. 1차 배양(VZ 및 DG의 경우 각각 4및 2웰)에서 사용된 우물의 수를 두 배로 늘려 새로운 초저 부착 판에서 세포(passage 1)를 배양한다.
10. 3일마다 중간 크기의 절반을 변경하고 매일 성장 요인을 추가합니다.
11. 1번 통로에서 10일(D10) 후에다음 구절에서 신봉조건으로 변경한다.

8. 준수 조건의 통로

1. 2번 통로를 수행하기 전에 폴리 L-오르니틴과 라미닌으로 코팅된 플레이트를 준비합니다.
   1. 24웰 플레이트에 1x 폴리 L-오르니틴(20 μg/mL)의 500 μL을 잘 넣습니다. 하룻밤 사이에 37 °C에서 배양하십시오.
   2. 폴리 L-올니틴을 제거하고 1x PBS(500 μL/웰)로 4배 세척합니다.
   3. 우물당 200 μL(최소 부피)을 1x 라미닌(5 μg/mL)의 1x 라미닌(5 μg/mL)을 넣고 세포를 재배하기 전에 37°C에서 2-3h의 배양한다.
2. 원심분리기 튜브에 컷 팁이 있는 1mL 파이펫으로 신경구를 수집합니다.
3. 중력에 의해 신경구를 침전하기 위해 실온에서 10 분 동안 배양하십시오.
4. 상체를 버리고 성장 인자없이 신선한 B27 배지에서 신경구를 다시 중단하십시오.
5. 코팅 된 접시에서 라미닌을 흡인하고 절단 팁1 mL 파이펫을 사용하여 우물에 신경 구체를 입금합니다.
   참고: 코팅된 우물이 라미닌 제거와 도금 신경구 사이에 건조되는 것을 방지합니다.
6. 문화를 다음 두 가지 조건으로 나눈다.
   1. 6 일 동안 분화 된 신경 구체를 유지 (D6). 매 3일마다 배지를 변경하고 매일 성장 요인을 추가합니다.
   2. 신경권 유래 세포의 분화를 12일(D12)까지 관찰한다. 성장 요인없이 3 일마다 매체를 변경합니다.
      참고: 분화 조건에 대한 D6의 끝에서, 세포는 종래의 면역히스토케, 세포 선별 분석, 5-에티닐-2'-deoxyuridine (EdU) 염색, RNA 추출 등에 사용될 수 있다.

결과

신경구는 VZ와 여성 및 남성 성인 대초원 voles의 DG에서 분리된 신경 줄기 세포에서 형성되었다. 배양을 시작한 지 약 8-10일 후에 세포가 신경구를 형성했어야 합니다. 플레이트는 1차 배양(도3A)에이물질을 포함할 수 있다. 그러나, 1항에서 배양은 신경구(도3B)로만이루어져야 한다.

여성과 남성의 남성 VZ 및 DG와 비교하여 여성 VZ로부?...

토론

신경 줄기 세포 배양을 얻는 단계는 효소 용액을 가진 소화 기간이며, 이는 세포 생존가능성을 감소시킬 수 있기 때문에 30분 이상을 초과해서는 안 된다. 신경구는 초기 문화 후에 8-10 일에 나타나야 합니다; 12일째에 나타나지 않으면 문화를 버리고 실험을 반복하여 소화 기간을 줄입니다. 또 다른 문제는 뇌 조직을 커버 하는 혈관. 적혈구의 과잉신경구 형성을 방해할 수 있기 때문에 해부 도중 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies			Antibody ID
Anti-Nestin	GeneTex	GTX30671	RRID:AB_625325
Anti-Doublecortin	MERCK	AB2253	RRID:AB_1586992
Anti-Ki67	Abcam	ab66155	RRID:AB_1140752
Anti-MAP2	GeneTex	GTX50810	RRID:AB_11170769
Anti-GFAP	SIGMA	G3893	RRID:AB_477010
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11029	RRID:AB_2534088
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A-11036	RRID:AB_10563566
Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11073	RRID:AB_2534117
Culture reagents
Antibiotic-Antimycotic	Thermo Fisher Scientific/Gibco	15240062	100X
B-27 supplement	Thermo Fisher Scientific/Gibco	17504044	50X
Collagenase, Type IV	Thermo Fisher Scientific/Gibco	17104019	Powder
Dispase	Thermo Fisher Scientific/Gibco	17105041	Powder
DMEM/F12, HEPES	Thermo Fisher Scientific/Gibco	11330032
Glucose	any brand		Powder, Cell Culture Grade
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific/Gibco	35050061	100X
HEPES	any brand		Powder, Cell Culture Grade
Mouse Laminin	Corning	354232	1 mg/mL
N-2 supplement	Thermo Fisher Scientific/Gibco	17502048	100X
NAHCO3	any brand		Powder, Suitable for Cell Culture
Neurobasal	Thermo Fisher Scientific/Gibco	21103049
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific/Gibco	10010023	1X
Poly-L-ornithine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P3655	Powder
Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15
Recombinant Human FGF-basic	Peprotech	AF-100-18B
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Thermo Fisher Scientific/Gibco	A1110501	100 mL
Disposable material
24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates	Corning/Costar	3473
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates	Corning/Costar	3526
40 µm Cell Strainer	Corning/Falcon	352340	Blue
Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 µm pore	Corning	431118	PES membrane, 45 mm diameter neck
Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube	any brand		with conical bottom
Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl.	any brand
Sterile cotton gauzes
Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL	any brand
Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL	any brand
Sterile surgical gloves	any brand
Syringe Filters, 0.22 µm pore	Merk Millipore	SLGPR33RB	Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter
Equipment and surgical instruments
Biological safety cabinet
Dissecting Scissors
Dumont Forceps
Motorized Pipet Filler/Dispenser
Micropipettes
Petri Dishes
Scalpel Blades
Stainless-steel Spatula