成人大草原の神経起源ニッチ由来の神経球の培養

要約

我々は、社会行動に関連する機能的プラスチック変化の一部となり得る神経原性ニッチ間の性依存性差を分析するために、大草原の渦の脳の脳下脳領域および脳内胞から神経前駆細胞を培養する条件を確立した。

要約

神経球は、神経幹細胞と前駆細胞を含む一次細胞凝集体である。これらの3D構造は、神経幹細胞の分化および増殖の可能性を決定し、時間をかけてアッセイできるよりも細胞株を生成するための優れたツールです。また、神経球は、様々な成長因子、ホルモン、神経伝達物質などの動的変化環境のモデリングを可能にするニッチ(インビトロ)を作成することができます。 マイクロタス・オクロガスター (大草原のボレ)は、社会性行動と社会的認知の神経生物学的基礎を理解するためのユニークなモデルです。しかし、これらの行動に関与する細胞機構は、よく知られていない。このプロトコルは、非接着条件下で培養される成体大草原の神経原性ニッチから神経前駆細胞を得て、神経球を生成することを目的としている。神経球の大きさと数は、領域(脳室内領域またはデンテート回)および大草原の性別に依存する。この方法は、インビトロにおける神経原性ニッチの性依存性に依存する違いを研究するための顕著なツールであり、ペアボンディングおよびバイペアペアケアなどの社会的行動に関連する神経可塑性の変化である。また、社会的相互作用(自閉症スペクトラム障害および統合失調症)の欠損を伴う認知状態を調べることができる。

概要

クリセチダ科の一員である大草原のボレ(ミクロトゥス・オクロガスター)は、社会的に一夫一婦制で社交的な種として生命戦略が発展する小さな哺乳類です。男性と女性の両方が交配後または同棲の長い期間の後に永続的なペアの絆を確立し、巣を共有し、自分の領土を守り、子孫^{1、2、3、4}のための二人の世話を表示することを特徴とする。このように、大草原のボレは、社会認知における社会性行動および障害の神経生物学的基礎を理解するための貴重なモデル^{である5。}

成人の神経新生は、行動の変化につながる神経可塑性の最も重要なプロセスの一つです。例えば、我々の研究グループは、海馬の脳内胞領域(VZ)および樹状回(DG)における脳室領域(VZ)およびサブ顆粒帯における交配との社会的同居が、大草原の交配によって誘発される対結合の形成に役割を果たすことができることを示唆している男性のボルで報告した(未発表データ)。一方、新しいニューロンが生成され、統合された脳領域はよく知られているが、これらのプロセスに関与する分子および細胞機構は、脳モデル⁶全体の技術的な欠点のために未確定のままである。例えば、遺伝子発現および他の細胞活動を制御するシグナル伝達経路は、比較的短い活性化期間(ホスホプロテオームの検出⁾⁷を有する。代替モデルの1つは、成人神経新生に関与する分子成分を解明するために、単離された、培養された成体神経幹細胞または前駆細胞である。

成人哺乳類(マウス)脳からのインビトロ神経前駆体を維持するための最初のアプローチは、神経球のアッセイであり、これは、ニューロンを生成する多能性の可能性を維持する非接着条件下で成長する細胞凝集体であり、アストロサイト^8、9、10であった。その開発の間に、前駆体だけが上皮成長因子(EGF)や線維芽細胞成長因子2(FGF2)などの有糸原物質に反応して神経球^8、9、10を増殖させ^、生成する選択プロセスがある。

我々の知る限りでは、大草原から成体神経前駆物質を得るためのプロトコルは文献に報告されていない。ここでは、神経球形成アッセイを通じて神経原性ニッチとそのインビトロ維持から神経前駆細胞を分離する培養条件を確立した。したがって、実験は、増殖、移動、分化および前駆体の神経幹細胞および前駆細胞の生存に関与する分子および細胞のメカニズムを同定するために設計されることができ、大草原の中でまだ知られていないプロセスである。さらに、VZおよびDGに由来する細胞の特性のインビトロの違いを解明することは、社会性行動および認知行動の変化に関連する神経可塑性における神経原性ニッチの役割に関する情報を提供し、性依存性依存性に依存する可能性のある社会的相互作用(自閉症スペクトラム障害および統合失調症)の欠損に関する情報を提供する可能性がある。

プロトコル

この研究は、ニューロバイオロジー研究所、メキシコ、メキシコ国立大学、国立副正書デペリナトリシア研究所(2018-1-163)の研究倫理委員会によって承認されました。動物の繁殖、ケア、人道的エンドポイントは、メキシコ保健事務局の「レイ・ジェネラル・デ・サルド・アン・マテリア・デ・インベスティガシオン・パラ・ラ・サルード」(健康研究一般健康法)に基づいてメキシコ公式スタンダード(NOM-062-Z00-1999)に従って設立されました。

1. ソリューションと株式の準備

1. ダルベックコの改変イーグルミディアムF12(DMEM-F12)の485 mL、N2サプリメント(100x)5 mL、グルタミンサプリメント5 mL(100x)、抗生物質抗ミキマティック(100x)5 mLのN2培地を調製します。
2. 480 mLの神経基底培地、10 mLの B27 サプリメント(50x)、5 mLのグルタミンサプリメント、5 mLの抗抗菌薬(100x)を用いたB27培地を調製する。
3. コラゲナーゼ粉末を1x PBS(リン酸緩衝生理食塩水)で再構成し、100単位/μL(1000x)の活性を有するアリコートを得、-20°Cで保存する。 コラゲローゼ活性は、企業のロット数によって異なります。
4. 1x PBS(50 mg/mL)に5mgのジスパーゼ粉末を溶解して、ディスパーゼストックアリコートを調製します。-20°Cで保管してください。
5. DMEM-F12培地100mL、50μLのストックコラゲナーゼ(100単位/μL)を用いた酵素溶液を調製し、最終濃度は50 U/mL、ストックディスパーゼ(50mg/mL)の最終濃度は333μL(50mg/mL)で、最終濃度は0.33mg/mLです。
6. 洗浄液を調製するには、1x PBSの1,000mLに、0.4766 gのHEPES(最終濃度2mM)、3.6gのD-グルコース(最終濃度20mM)および2.1gの_NaHCO3( 最終濃度25mM)を加える。
7. 滅菌水を使用してポリ-L-オルニチンストックアリコート(1mg/mL)を調製し、-20°Cで保管してください。
8. ポリ-L-オルニチンの働く溶液を準備します。ストックアリコート(1mg/mL)を49mLの滅菌水で希釈し、最終濃度20μg/mLにします。
9. ラミニンの作業溶液を準備します。5 μg/mLの最終濃度のために滅菌水の5 mLのラミニンの25 μL(1 mg/mLの元のストック)を薄くします。
   注:準備後、汚染を避けるために、培養培地、作業およびストックソリューションをフィルタリングしてください。シリンジまたはボトルトップ真空フィルター(0.2 μmの孔径のポリエーテルサルホン膜)を使用してください。培養培地と作業ソリューションは4°Cで最大30日間保存でき、ストックは-20°Cで最大4ヶ月間保存できます。

2. マイクロディシスを開始する前の準備

1. オートクレーブまたはホットガラスビーズドライ滅菌装置で手術器具を殺菌します。
2. 厳密な無菌および防腐条件下でマイクロディスセクション表面積を清掃します(例えば、オゾン水で)。
   注:各ボレ脳からの両方の神経原性ニッチのマイクロディセクションのタイミングは約30分です。全手順で1~4匹の動物を使用することをお勧めします。

3. 脳全体の抽出

1. 腹腔内注射によるペントバルビタール(6.3mg/動物)の過剰摂取で成人のボレ(12-16週)を麻酔します。しっかりとしたつまみに応答してペダル反射の欠如によって麻酔の深さを確認します。
2. ボレが完全に麻酔されると、首切りによって安楽死を誘発し、頭を回復する。
3. 頭蓋骨から皮膚をはさみで解剖し、尾骨-鼻の切開(長さ15mm)を作り、頭蓋骨を露出させる。
4. 後頭骨と足頭間骨を切り取り、矢頭と頭頂縫合糸に沿って頭蓋骨に切開をトレースします。
5. はさみを使用して前頭骨と頭頂骨の接合部で頭蓋骨に穴を開け、脳組織に損傷を与えないように非常に注意してください。
6. 脳を露出させるために、鋭利な尖ったピンセットで両方の脳半球を覆う残りの頭蓋骨の断片を取り除く。
7. 頭蓋の基盤から脳全体を持ち上げるためにステンレス製のへらを使用してください。
8. 20 mLの冷たい洗浄液を用いた遠心分離管(50 mL)に脳を集めなさい。
9. 冷たい洗浄液で脳を2回洗います。

4. 神経組織の微細解剖

1. 氷に囲まれた表面にペトリ皿を置きます。
2. 皿に脳を堆積させ、冷たい洗浄液の20 mLを加える。
3. メスでは、コロナ平面で、脳を組織の2つのブロック(ロストラルと尾体)に分けます。神経解剖学的基準として、前後軸¹¹ においてブレグマレベルでコロナカットを行う(図1A、実線)。
4. ロストラルブロックからVZ組織(図1B)を抽出し、コーダルブロックからDGを取り外します(図1C)。
5. VZをステレオ顕微鏡で解剖する。
   1. デュモン鉗子で、半球の1つを保持します。次に、心室の高さで、第2のデュモン鉗子の微細な先端を、カウデート・プタメンに並ぶ組織下に挿入する(図2A)。
   2. 組織を分離するために、ドーソベントラ軸に沿って鉗子を開きます。
   3. 2 mLの冷たい洗浄液を用いた遠心分離管に、個人毎にVZ組織を回収します。2匹以上の動物の組織をプールしないでください。
   4. 他の半球でマイクロディショ切を繰り返します。
   5. 二国間VZ組織を含むチューブを氷の上に保存し、DGの解剖を続ける。
6. ステレオ顕微鏡下で尾ブロックからDGを解剖する。
   1. メスで、コロナをブロックに切り込み、海馬の形成が観察される2つのスライスを得る。目印として、カットはマウス脳アトラス¹¹⁽図1A、点線および図1C)に従って前部後軸の-2mmブレグマ座標で行われる。
   2. デュモン鉗子で、スライスの1つを保持し、ファインポイントのデュモン鉗子でDGとCA1の間に水平切削を行い、DGとCA3の間で垂直切開を行い、DGを分離します(図2B)。
   3. 他の半球の最初のスライスで解剖を繰り返します。
   4. 2 番目のスライスで両半球の解剖を繰り返します。
   5. 遠心分離管に各ボレの4つのDG部分を集める。2匹以上の動物のDG組織をプールしないでください。
      注:複数の動物の解剖が必要な場合は、脳の残りの部分を解剖し続けながら、氷の上にVZまたはDG組織と遠心管を保存します。解剖中に脳組織を覆うすべての血管を取り除きます。血管が廃棄されない場合、培養物は過剰な赤血球と混合され、神経球形成を妨げることができる。

5. 神経細胞の分離

1. バイオセーフティキャビネット内に遠心管を入れ、組織断片が重力によって沈殿するまで約10分待ちます。
2. 洗浄液を取り出し、各チューブに温かい酵素溶液1mLを加えます。
3. 37°Cで10分間チューブをインキュベートします。
4. 組織断片を崩壊させる;ピペットは1 mLの先端で上下に。30倍以上のピペットを使用しないでください。
5. 37°Cで10分の2回目のインキュベーションを行います。
6. 第2インキュベーションの終わりに、ピペットは組織を分割する。30倍以上のピペットを使用しないでください。
   注:ピペット処理後、組織断片は完全に崩壊する必要があります。それらが崩壊していない場合は、37°Cで別の10分間インキュベートし、再ピペット。消化期間は30分を超えてはなりません。
7. 酵素処理を希釈するためにチューブあたり9 mLのN2培地を加えます。
8. 室温で4分間200 x g でチューブを遠心します。
9. 上清を捨て、10mLのN2培地で洗います。
10. ステップ5.8と同じ条件で遠心分離機。
11. 各チューブから上澄み液を取り出し、VZおよびDGの細胞ペレットをそれぞれ2mLおよび1mLのB27培地に再懸濁する。
12. 非崩壊組織を除去するには、細胞ストレーナー(サイズ40μm)を使用して各細胞懸濁液を濾過します。

6. 神経球形成

1. ストレーナーを通過した細胞を超低い付着、24ウェルプレートに培養する。VZには2つの井戸を使用し、DGには井戸1つ(B27培地/ウェルの1 mL)を使用してください。
2. 各ウェル(最終濃度1x)に20 ng /mLのFGF2と20 ng /mLのEGFを加えます。
3. 37°C、5%CO2、高湿度(90~95%)でインキュベートします。48時間(1日目と2日目の培養、D1-D2)の邪魔をしないでください。
4. 3日目(D3)に、培養培地の半分を取り除き、成長因子の二重濃度(2x)を加えた新鮮なB27培地(ウェルあたり500 μL)に置き換えます。
5. 3日ごとに繰り返し、培養培地(その半分)を変更し、成長因子の二重濃度(2倍)を添加した新鮮なB27培地に置き換えます。
6. 培養培地を変更する必要がない日には、1倍の最終濃度に成長因子を加える。
7. 神経球がD8-D10の周りに形成されていることを確認してください。
8. D10では、全ての残骸を除去するために完全な培養培地を変更する。
   1. 遠心分離管の各ウェルの培地と神経球を個別に収集します。
   2. 室温で10分間インキュベートします。この手順は、重力による神経球の沈殿を可能にする。
   3. 上清を除去し、成長因子を補充した新鮮なB27培地の1 mLで再中断します。
   4. 神経球を同じ超低い取り付けプレートに戻し、37°C、5%CO2でインキュベートします。
9. D10からD15へ、培地の半分を変更し、成長因子を追加し続けます。

7. 神経球の通過

1. 一次培養のD15で、1 mLピペットを用いて遠心管に神経球を集める。ピペットチップを切って開口部のサイズを大きくし、神経球の損傷を避けます。
2. 室温で10分間インキュベートします。神経球は重力によって沈殿する。
3. 培地を取り出し、チューブあたり1mLの細胞剥離培地を加えます。
4. 37°Cで7分間チューブをインキュベートします。
5. ピペットは、神経球を解体するために1 mLの先端で上下に。
6. 細胞剥離培地をチューブあたり3mLのB27培地で希釈します。
7. 200 x gで 5 分間の細胞懸濁液を遠心分離します。
8. 上清を捨て、成長因子を補充した新鮮なB27培地で各細胞ペレットを再懸濁する。
   1. VZ由来細胞を培地4mL、DG由来細胞を2mLの培地で再懸濁する。
9. 一次培養で使用されたウェルの数を2倍にして新しい超低い付着プレートで細胞(継代1)を培養する(VZおよびDGの場合は4および2ウェルずつ)。
10. 3 日ごとに培地の半分を変更し、成長要因を毎日追加します。
11. 10日後(D10)を通過1にして、次の通路で付着条件に変更する。

8. 付着条件での通路

1. 通過2を実施する前に、ポリ-L-オルニチンおよびラミニンでコーティングされたプレートを準備する。
   1. 24ウェルプレートに、1xポリL-オルニチン(20μg/mL)の500 μLをウェルあたりに加えます。一晩で37°Cでインキュベートする。
   2. ポリL-オルニチンを取り出し、1x PBS(500 μL/ウェル)で4倍洗います。
   3. 1ウェルあたり1xラミニン(5 μg/mL)の200 μL(1つのウェルの表面を覆う最小体積)を加え、細胞を培養する前に37°Cで2〜3時間インキュベートします。
2. 遠心分離管に切り取られた先端と1 mLピペットと神経球を収集します。
3. 室温で10分間インキュベートし、重力によって神経球を沈殿させます。
4. 上清を捨て、成長因子を含まない新鮮なB27培地で神経球を再中断する。
5. コーティングされたプレートからラミニンを吸引し、切り取られた先端と1 mLピペットを使用して井戸に神経球を沈着させます。
   注:コーティングされた井戸がラミニン除去とメッキ神経球の間で乾燥しないようにしてください。
6. カルチャを 2 つの条件に分割します。
   1. 6日間の分化された神経球を維持する(D6)。3 日ごとにメディアを変更し、成長要因を毎日追加します。
   2. 神経球由来細胞の分化を12日(D12)で観察する。成長因子なしで3日ごとに培地を変更します。
      注:分化条件のD6の終わりに、分化条件のためのD6またはD12の終わりに、細胞は従来の免疫検査、細胞選別分析、5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)染色、RNA抽出などに使用することができます。

結果

神経球は、女性と男性の両方の成人大草原のVZとDGから分離された神経幹細胞から形成された。培養開始から約8~10日後、細胞は神経球を形成しているはずだ。なお、プレートには、一次培養物に破片が含まれていてもよい(図3A)。しかし、通路1では、培養は神経球のみで構成されるべきである(図3B)。

女性と男性の両方の雄VZお?...

ディスカッション

神経幹細胞培養を得る段階は酵素溶液による消化期間であり、細胞の生存率を低下させる可能性があるため、30分を超えてはならない。神経球は、最初の培養後8〜10日で出現するはずです。12日目までに出現しない場合は、培養を捨てて実験を繰り返し、消化期間を短縮する。もう一つの問題は、脳組織をカバーする血管です。赤血球の過剰が神経球形成を妨げる可能性があるため、解剖中に...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies			Antibody ID
Anti-Nestin	GeneTex	GTX30671	RRID:AB_625325
Anti-Doublecortin	MERCK	AB2253	RRID:AB_1586992
Anti-Ki67	Abcam	ab66155	RRID:AB_1140752
Anti-MAP2	GeneTex	GTX50810	RRID:AB_11170769
Anti-GFAP	SIGMA	G3893	RRID:AB_477010
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11029	RRID:AB_2534088
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A-11036	RRID:AB_10563566
Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11073	RRID:AB_2534117
Culture reagents
Antibiotic-Antimycotic	Thermo Fisher Scientific/Gibco	15240062	100X
B-27 supplement	Thermo Fisher Scientific/Gibco	17504044	50X
Collagenase, Type IV	Thermo Fisher Scientific/Gibco	17104019	Powder
Dispase	Thermo Fisher Scientific/Gibco	17105041	Powder
DMEM/F12, HEPES	Thermo Fisher Scientific/Gibco	11330032
Glucose	any brand		Powder, Cell Culture Grade
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific/Gibco	35050061	100X
HEPES	any brand		Powder, Cell Culture Grade
Mouse Laminin	Corning	354232	1 mg/mL
N-2 supplement	Thermo Fisher Scientific/Gibco	17502048	100X
NAHCO3	any brand		Powder, Suitable for Cell Culture
Neurobasal	Thermo Fisher Scientific/Gibco	21103049
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific/Gibco	10010023	1X
Poly-L-ornithine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P3655	Powder
Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15
Recombinant Human FGF-basic	Peprotech	AF-100-18B
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Thermo Fisher Scientific/Gibco	A1110501	100 mL
Disposable material
24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates	Corning/Costar	3473
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates	Corning/Costar	3526
40 µm Cell Strainer	Corning/Falcon	352340	Blue
Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 µm pore	Corning	431118	PES membrane, 45 mm diameter neck
Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube	any brand		with conical bottom
Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl.	any brand
Sterile cotton gauzes
Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL	any brand
Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL	any brand
Sterile surgical gloves	any brand
Syringe Filters, 0.22 µm pore	Merk Millipore	SLGPR33RB	Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter
Equipment and surgical instruments
Biological safety cabinet
Dissecting Scissors
Dumont Forceps
Motorized Pipet Filler/Dispenser
Micropipettes
Petri Dishes
Scalpel Blades
Stainless-steel Spatula