Culture des neurosphères dérivées des niches neurogéniques des campagnols adultes des Prairies

Résumé

Nous avons établi les conditions de culture des cellules progénitrices neurales de la zone sous-ventriculaire et de la bosseler le gyrus du cerveau adulte des campagnols des Prairies, en tant qu’étude in vitro complémentaire, pour analyser les différences dépendantes du sexe entre les niches névrogènes qui pourraient faire partie des changements plastiques fonctionnels associés aux comportements sociaux.

Résumé

Les neurosphères sont des agrégats cellulaires primaires qui comprennent des cellules souches neurales et des cellules progénitrices. Ces structures 3D sont un excellent outil pour déterminer le potentiel de différenciation et de prolifération des cellules souches neurales, ainsi que pour générer des lignées cellulaires que l’on peut trouver au fil du temps. En outre, les neurosphères peuvent créer un créneau (in vitro) qui permet la modélisation de l’environnement dynamique changeant, tels que divers facteurs de croissance, hormones, neurotransmetteurs, entre autres. Microtus ochrogaster (campagnol des Prairies) est un modèle unique pour comprendre la base neurobiologique des comportements socio-sexuels et de la cognition sociale. Cependant, les mécanismes cellulaires impliqués dans ces comportements ne sont pas bien connus. Le protocole vise à obtenir des cellules progénitrices neurales des niches névrogènes du campagnol adulte des Prairies, qui sont cultivés dans des conditions non adhérentes, pour générer des neurosphères. La taille et le nombre de neurosphères dépendent de la région (zone subventriculaire ou gyrus bosselé) et du sexe du campagnol des Prairies. Cette méthode est un outil remarquable pour étudier les différences sexo-dépendantes dans les niches névrogènes in vitro et les changements de neuroplasticité associés aux comportements sociaux tels que la liaison de paire et les soins biparentaux. En outre, les conditions cognitives qui entraînent des déficits dans les interactions sociales (troubles du spectre autistique et schizophrénie) pourraient être examinées.

Introduction

Le campagnol des Prairies (Microtus ochrogaster), un membre de la famille cricetidae, est un petit mammifère dont la stratégie de vie se développe comme une espèce socialement monogame et très sociable. Les mâles et les femelles établissent un lien de couple durable après l’accouplement ou de longues périodes de cohabitation caractérisées par le partage du nid, la défense de leur territoire, et l’affichage de soins biparentaux pour leur^{progéniture 1,2,3,4}. Ainsi, le campagnol de prairie est un modèle valable pour comprendre la base neurobiologique du comportement socio-sexuel et des affaiblissements dans la cognition sociale^5.

La neurogenèse adulte est l’un des processus les plus primordiaux de la plasticité neuronale qui conduit à des changements comportementaux. Par exemple, notre groupe de recherche a signalé chez les campagnols mâles que la cohabitation sociale avec l’accouplement augmentait la prolifération cellulaire dans la zone sous-ventriculaire (ZV) et la zone subgranulaire dans le gyrus bosselé (DG) de l’hippocampe, ce qui suggère que la neurogenèse adulte peut jouer un rôle dans la formation de liaisons en couple induites par l’accouplement dans les campagnols des Prairies (données non publiées). D’autre part, bien que les régions du cerveau où de nouveaux neurones sont générés et intégrés sont bien connues, les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans ces processus restent indéterminés en raison des inconvénients techniques dans l’ensemble du modèle^{cérébral 6}. Par exemple, les voies de signalisation contrôlant l’expression des gènes et d’autres activités cellulaires ont une période d’activation relativement courte (détection du phosphoprotéome)⁷. Un modèle alternatif est des cellules souches neurales adultes isolées et cultivés ou des cellules progénitrices pour élucider les composants moléculaires impliqués dans la neurogenèse adulte.

La première approche pour maintenir les précurseurs neuronaux in vitro du cerveau adulte de mammifère (souris) a été l’essai des neurosphères, qui sont des agrégats cellulaires se développent dans des conditions non adhérentes qui préservent leur potentiel multipotent pour générer des neurones, aussi bien que des astrocytes^8,9,10. Au cours de leur développement, il existe un processus de sélection où seuls les précurseurs répondront aux mitogènes tels que le facteur de croissance épidermique (FEM) et le facteur de croissance fibroblaste 2 (FGF2) pour proliférer et générer des néorosphères^8,9,10.

À notre connaissance, aucun protocole n’est rapporté dans la littérature pour obtenir des progéniteurs neuronaux adultes des campagnols des Prairies. Ici, nous avons établi les conditions de culture pour isoler les progéniteurs neuronaux des niches névrogènes et de leur entretien in vitro par l’essai de formation de neurosphère. Ainsi, les expériences peuvent être conçues pour identifier les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans la prolifération, la migration, la différenciation et la survie des cellules souches neurales et des progéniteurs, processus encore inconnus dans le campagnol des Prairies. En outre, l’élucidation des différences in vitro dans les propriétés des cellules dérivées de la ZV et de la DG pourrait fournir des informations sur le rôle des niches névrogènes dans la plasticité neuronale associée aux changements dans le comportement socio-sexuel et les comportements cognitifs, et les déficits dans les interactions sociales (troubles du spectre autistique et schizophrénie), qui pourraient également être dépendants du sexe.

Protocole

L’étude a été approuvée par le Comité d’éthique de la recherche de l’Instituto de Neurobiología, de l’Universidad Nacional Autónoma de México, au Mexique, et de l’Instituto Nacional de Perinatologia (2018-1-163). La reproduction, les soins et les critères d’évaluation humains des animaux ont été établis selon la norme mexicaine officielle (NOM-062-Z00-1999) basée sur le « Ley General de Salud en Materia de Investigación para la Salud » (Loi générale sur la santé pour la recherche en santé) de la Secrétairerie mexicaine de la Santé.

1. Solutions et préparation des stocks

1. Préparer un milieu de culture N2 avec 485 mL de Dulbecco’s Modified Eagle Medium-F12 (DMEM-F12), 5 mL de supplément N2 (100x), 5 mL de supplément de glutamine (100x) et 5 mL d’antibio-antimycotique (100x).
2. Préparer un milieu de culture B27 avec 480 mL de milieu neurobasal, 10 mL de supplément B27 (50x), 5 mL de supplément de glutamine, et 5 mL d’antibiotique-antimycotique (100x).
3. Reconstituer la poudre de collagène en 1x PBS (saline tamponnée de phosphate) pour obtenir des aliquots avec une activité de 100 unités/μL (1000x) et stocker à -20 °C. Remarquez, l’activité collagène dépend du nombre de lot des entreprises.
4. Préparer les aliquots de dispase stock en dissolvant 5 mg de poudre de dispase en 1x PBS (50 mg/mL). Conserver à -20 °C.
5. Préparer une solution enzymatique avec 100 mL de DMEM-F12 moyen, 50 μL de collagène stock (100 unités/μL) pour avoir une concentration finale de 50 U/mL et 333 μL de dispase de stock (50 mg/mL) pour avoir une concentration finale de 0,33 mg/mL.
6. Pour préparer une solution de lavage, à 1 000 mL de 1x PBS, ajouter 0,4766 g de HEPES (concentration finale 2 mM), 3,6 g de D-glucose (concentration finale de 20 mM) et 2,1 g de NaHCO₃ (concentration finale de 25 mM).
7. Préparer les aliquots en poly-L-ornithine (1 mg/mL) à l’aide d’eau stérile et les conserver à -20 °C.
8. Préparer une solution de travail de poly-L-ornithine. Diluer un stock aliquot (1mg/mL) dans 49 mL d’eau stérile pour une concentration finale de 20 μg/mL.
9. Préparer une solution de travail de laminine. Diluer 25 μL de laminine (1 mg/mL de bouillon d’origine) dans 5 mL d’eau stérile pour une concentration finale de 5 μg/mL.
   REMARQUE : Après la préparation, filtrer les supports culturels, les solutions de travail et de stockage pour éviter la contamination. Utilisez une seringue ou des filtres à vide à dessus de bouteille (membrane polyethersulfone avec une taille de pore de 0,2 μm). Les supports culturels et les solutions de travail peuvent être stockés jusqu’à 30 jours à 4 °C, tandis que les stocks peuvent être stockés jusqu’à quatre mois à -20 °C.

2. Préparation avant de commencer la microdissection

1. Stériliser les instruments chirurgicaux en autoclavant ou avec un stérilisateur sec perle de verre chaud.
2. Nettoyez la surface de microdissection dans des conditions aseptiques et antiseptiques strictes (p. ex., avec de l’eau ozonisée).
   REMARQUE : Le moment de la microdissection des deux niches névrogènes de chaque cerveau de campagnol est approximativement 30 min. Il est recommandé de travailler avec 1 à 4 animaux pendant toute la procédure.

3. Extraction de tout le cerveau

1. Anesthésier le campagnol adulte (12-16 semaines) avec une surdose de pentobarbital (6,3 mg/animal) par injection intraperitoneal. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie par l’absence de réflexe de pédale en réponse à un pincement ferme des pieds.
2. Une fois que le campagnol est entièrement anesthésié, induisez l’euthanasie par décapitation et récupérez la tête.
3. Disséquer la peau du crâne avec des ciseaux, en faisant une incision caudale-rostrale (15 mm de long) pour exposer le crâne.
4. Couper les os occipitaux et interpariétals et tracer une incision dans le crâne le long des sutures sagittales et pariétales.
5. Faire un trou dans le crâne à la jonction des os frontaux et pariétals à l’aide de ciseaux, en prenant très soin de ne pas endommager le tissu cérébral.
6. Pour exposer le cerveau, retirez les fragments de crâne restants qui couvrent les deux hémisphères cérébraux avec des pinces pointues.
7. Utilisez une spatule en acier inoxydable pour soulever tout le cerveau de la base crânienne.
8. Recueillir le cerveau dans un tube de centrifugeuse (50 mL) avec 20 mL de solution de lavage à froid.
9. Lavez le cerveau deux fois avec la solution de lavage à froid.

4. Microdissection du tissu neuronal

1. Déposer une boîte de Pétri sur une surface entourée de glace.
2. Déposer le cerveau sur le plat et ajouter 20 mL de solution de lavage à froid.
3. Avec un scalpel, dans le plan coronal, diviser le cerveau en deux blocs de tissu (rostral et caudal). Comme référence neuroanatomique, effectuer la coupe coronale au niveau de Bregma dans l’axe antérieur-postérieur¹¹ (Figure 1A, ligne solide).
4. Du bloc rostral, extraire le tissu VZ (Figure 1B), tandis que du bloc caudal enlever le DG (Figure 1C).
5. Disséquer le VZ au microscope stéréo.
   1. Avec un forceps Dumont, tenir l’un des hémisphères; puis, insérez, à la hauteur du ventricule, les extrémités fines d’un deuxième Dumont forceps sous le tissu qui aligne le caudate-putamen (Figure 2A).
   2. Ouvrez les forceps le long de l’axe dorsoventral pour séparer le tissu.
   3. Recueillir le tissu VZ par individu dans un tube de centrifugeuse avec 2 mL de solution de lavage à froid. Ne pas mettre en commun les tissus de plus de deux animaux.
   4. Répétez la microdissection dans l’autre hémisphère.
   5. Entreposez le tube contenant le tissu bilatéral de VZ sur la glace et continuez à disséquer le DG.
6. Disséquer le DG du bloc caudal au microscope stéréo.
   1. À l’aide d’un scalpel, faire une coupe coronale dans le bloc pour obtenir deux tranches, dans lesquelles la formation hippocampale est observée. Comme point de repère, la coupe est faite à -2 mm coordonnées Bregma dans l’axe antérieur-postérieur selon l’atlas du cerveau de^{la souris 11} (Figure 1A, ligne pointillée et figure 1C).
   2. Avec un forceps Dumont, tenir l’une des tranches, et avec des forceps Dumont à pointe fine faire une coupe horizontale entre DG et CA1, puis effectuer une incision verticale entre le DG et CA3 pour séparer le DG (Figure 2B).
   3. Répétez la dissection dans la première tranche de l’autre hémisphère.
   4. Répétez la dissection dans les deux hémisphères dans la deuxième tranche.
   5. Recueillir les quatre pièces DG de chaque campagnol dans un tube de centrifugeuse. Ne pas mettre en commun le tissu DG de plus de deux animaux.
      REMARQUE : Si la dissection de plus d’un animal est nécessaire, entreposez les tubes de centrifugeuse avec le tissu VZ ou DG sur la glace tout en continuant à disséquer le reste du cerveau. Enlevez tous les vaisseaux sanguins qui couvrent le tissu cérébral tout en disséquant. Si les vaisseaux ne sont pas jetés, la culture pourrait être mélangée à un excès d’érythrocytes et perturber la formation de la neurosphère.

5. Isolement des cellules neurales

1. Placez les tubes de centrifugeuse à l’intérieur de l’armoire de biosécurité et attendez environ 10 min que les fragments de tissu se précipitent par gravité.
2. Retirez la solution de lavage et ajoutez 1 mL de la solution enzymatique chaude à chaque tube.
3. Incuber les tubes à 37 °C pendant 10 min.
4. Désintégrer les fragments de tissu; pipette de haut en bas avec une pointe de 1 mL. Ne pas pipette plus de 30x.
5. Effectuer une deuxième incubation de 10 min à 37 °C.
6. À la fin de la deuxième incubation, pipette pour briser les tissus. Ne pas pipette plus de 30x.
   REMARQUE : Après le pipetage, les fragments de tissu devraient être complètement désintégrés ; s’ils ne sont pas désintégrés, incuber encore 10 min à 37 °C et re-pipette. La période de digestion ne doit pas dépasser 30 min.
7. Ajouter 9 mL de N2 moyen par tube pour diluer le traitement enzymatique.
8. Centrifuger les tubes à 200 x g pendant 4 min à température ambiante.
9. Jeter le supernatant et laver avec 10 mL de N2 moyen.
10. Centrifugeuse dans les mêmes conditions que l’étape 5.8.
11. Retirez le supernatant de chaque tube et résuspendez les granulés cellulaires de la VZ et de la DG en 2 mL et 1 mL du milieu B27, respectivement.
12. Pour enlever tout tissu non désintégré, filtrer chaque suspension cellulaire à l’aide d’une passoire cellulaire (taille 40 μm).

6. Formation de neurosphères

1. Culture les cellules sont passées à travers la passoire dans un attachement ultra-faible, plaque de 24 puits. Utilisez deux puits pour la VZ et un puits pour le DG (1 mL de B27 moyen/puits).
2. Ajouter 20 ng/mL de FGF2 et 20 ng/mL d’EGF à chaque puits (concentration finale 1x).
3. Incuber à 37 °C, 5 % de CO_{2 et} une humidité élevée (90-95 %). Ne pas déranger pendant 48 h (jour 1 et jour 2 de la culture, D1-D2).
4. Le troisième jour (D3), retirer la moitié du milieu de culture et le remplacer par un milieu B27 frais (500 μL par puits) complété par une double concentration (2x) de facteurs de croissance.
5. Répétez chaque troisième jour, changer le milieu de culture (la moitié de celui-ci) et le remplacer par un milieu B27 frais complété par une double concentration (2x) de facteurs de croissance.
6. Les jours où il n’est pas nécessaire de changer le milieu de culture, ajouter des facteurs de croissance à une concentration finale de 1x.
7. Assurez-vous que les neurosphères sont formées autour de D8-D10.
8. À la D10, changer le milieu de culture complet pour enlever tous les débris.
   1. Recueillir les moyennes et neurosphères individuellement de chaque puits dans des tubes de centrifugeuse.
   2. Incuber pendant 10 min à température ambiante. Cette procédure permet aux neurosphères de se précipitations par gravité.
   3. Retirez le supernatant et resuspendez en 1 mL de milieu B27 frais complété par des facteurs de croissance.
   4. Remettre les neurosphères dans la même plaque de fixation ultra-basse et incuber à 37 °C, 5 % de CO_2.
9. De D10 à D15, continuer à changer la moitié du milieu et l’ajout de facteurs de croissance.

7. Passage des neurosphères

1. À D15 de la culture primaire, recueillir les neurosphères dans des tubes de centrifugeuse à l’aide de pipette de 1 mL. Couper la pointe pipette pour augmenter la taille de l’ouverture afin d’éviter les dommages aux neurosphères.
2. Incuber pendant 10 min à température ambiante. Les neurosphères se précipitent par gravité.
3. Retirer le milieu et ajouter 1 mL du milieu de détachement cellulaire par tube.
4. Incuber les tubes pendant 7 min à 37 °C.
5. Pipette de haut en bas avec une pointe de 1 mL pour démanteler les neurosphères.
6. Diluer le milieu de détachement cellulaire avec 3 mL de B27 moyen par tube.
7. Centrifugeuse de la suspension cellulaire pendant 5 min à 200 x g.
8. Jetez le supernatant et resuspendez chaque granule cellulaire avec un milieu B27 frais complété par des facteurs de croissance.
   1. Resuspendez les cellules dérivées de la ZV dans 4 mL de cellules moyennes et les cellules dérivées du DG dans 2 mL de milieu.
9. Culture des cellules (passage 1) dans une nouvelle plaque d’attachement ultra-basse en doublant le nombre de puits utilisés dans la culture primaire (4 et 2 puits pour VZ et DG, respectivement).
10. Changez la moitié du milieu tous les trois jours et ajoutez quotidiennement des facteurs de croissance.
11. Après 10 jours (D10) dans le passage 1, changement aux conditions d’adhésion dans le passage suivant.

8. Le passage dans des conditions d’adhésion

1. Avant d’effectuer le passage 2, préparer les assiettes enduites de poly-L-ornithine et de laminine.
   1. Dans des assiettes de 24 puits, ajouter 500 μL de 1x poly-L-ornithine (20 μg/mL) par puits. Incuber à 37 °C pendant la nuit.
   2. Retirer le poly-L-ornithine et laver 4x avec 1x PBS (500 μL/puits).
   3. Ajouter 200 μL (volume minimum pour couvrir la surface d’un seul puits) de 1x laminine (5 μg/mL) par puits et incuber pendant 2-3 h à 37 °C avant de cultiver les cellules.
2. Recueillir les neurosphères avec une pipette de 1 mL avec des pointes coupées dans un tube de centrifugeuse.
3. Incuber pendant 10 min à température ambiante pour précipiter les neurosphères par gravité.
4. Jetez le supernatant et resuspendez les neurosphères dans le milieu B27 frais sans facteurs de croissance.
5. Aspirer la laminine de la plaque enduite et déposer les neurosphères dans les puits à l’aide de pipettes de 1 mL avec des pointes coupées.
   REMARQUE : Empêchez les puits enduits de se dessécher entre l’enlèvement de la laminine et les neurosphères de placage.
6. Divisez la culture en deux conditions :
   1. Maintenir les neurosphères différenciées pendant 6 jours (D6). Changez le milieu tous les trois jours et ajoutez quotidiennement des facteurs de croissance.
   2. Observez la différenciation des cellules dérivées de la neurosphère par 12 jours (D12). Changez le milieu tous les trois jours sans facteurs de croissance.
      REMARQUE : À la fin de D6 pour les conditions indifférenciées ou D12 pour des conditions de différenciation, les cellules peuvent être employées pour l’immunohistochimie conventionnelle, l’analyse de tri cellulaire, la coloration 5-Éthynyl-2'-deoxyuridine (EdU), l’extraction d’ARN, entre autres.

Résultats

Des neurosphères ont été formées à partir de cellules souches neurales isolées de la ZV et de la DG des campagnols adultes femelles et mâles des Prairies. Environ 8-10 jours après le début de la culture, les cellules auraient dû former les neurosphères. Notez que la plaque peut contenir des débris dans la culture primaire (Figure 3A). Toutefois, au passage 1, la culture ne devrait être composée que de neurosphères (figure 3B).

Discussion

Une étape pour obtenir une culture neurale de cellules souches est la période de digestion avec la solution enzymatique, qui ne devrait pas dépasser plus de 30 min parce qu’elle pourrait diminuer la viabilité cellulaire. Les neurosphères devraient émerger à 8-10 jours après la culture initiale ; s’ils n’émergent pas au jour 12, jetez la culture et répétez l’expérience, réduisant ainsi la période de digestion. Un autre problème est les vaisseaux sanguins qui couvrent le tissu cérébral. Ils doivent...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies			Antibody ID
Anti-Nestin	GeneTex	GTX30671	RRID:AB_625325
Anti-Doublecortin	MERCK	AB2253	RRID:AB_1586992
Anti-Ki67	Abcam	ab66155	RRID:AB_1140752
Anti-MAP2	GeneTex	GTX50810	RRID:AB_11170769
Anti-GFAP	SIGMA	G3893	RRID:AB_477010
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11029	RRID:AB_2534088
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A-11036	RRID:AB_10563566
Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11073	RRID:AB_2534117
Culture reagents
Antibiotic-Antimycotic	Thermo Fisher Scientific/Gibco	15240062	100X
B-27 supplement	Thermo Fisher Scientific/Gibco	17504044	50X
Collagenase, Type IV	Thermo Fisher Scientific/Gibco	17104019	Powder
Dispase	Thermo Fisher Scientific/Gibco	17105041	Powder
DMEM/F12, HEPES	Thermo Fisher Scientific/Gibco	11330032
Glucose	any brand		Powder, Cell Culture Grade
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific/Gibco	35050061	100X
HEPES	any brand		Powder, Cell Culture Grade
Mouse Laminin	Corning	354232	1 mg/mL
N-2 supplement	Thermo Fisher Scientific/Gibco	17502048	100X
NAHCO3	any brand		Powder, Suitable for Cell Culture
Neurobasal	Thermo Fisher Scientific/Gibco	21103049
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific/Gibco	10010023	1X
Poly-L-ornithine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P3655	Powder
Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15
Recombinant Human FGF-basic	Peprotech	AF-100-18B
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Thermo Fisher Scientific/Gibco	A1110501	100 mL
Disposable material
24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates	Corning/Costar	3473
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates	Corning/Costar	3526
40 µm Cell Strainer	Corning/Falcon	352340	Blue
Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 µm pore	Corning	431118	PES membrane, 45 mm diameter neck
Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube	any brand		with conical bottom
Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl.	any brand
Sterile cotton gauzes
Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL	any brand
Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL	any brand
Sterile surgical gloves	any brand
Syringe Filters, 0.22 µm pore	Merk Millipore	SLGPR33RB	Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter
Equipment and surgical instruments
Biological safety cabinet
Dissecting Scissors
Dumont Forceps
Motorized Pipet Filler/Dispenser
Micropipettes
Petri Dishes
Scalpel Blades
Stainless-steel Spatula