从成人草原卷的神经性尼奇衍生的神经球培养

摘要

我们建立了培养神经祖细胞的条件，从辅助区和凹陷陀螺的成年大脑的草原卷，作为补充的体外研究，以分析神经基因利基之间的性别依赖差异，这可能是功能塑料变化的一部分相关的社会行为。

摘要

神经球是组成神经干细胞和祖细胞的原发细胞聚集体。这些 3D 结构是确定神经干细胞的分化和增殖潜力以及生成细胞系的极佳工具。此外，神经球可以创建一个利基（体外），允许动态变化的环境建模，如不同的生长因子，激素，神经递质，等等。 微图色（ 草原卷）是理解社会性行为和社会认知的神经生物学基础的独特模型。然而，这些行为所涉及的细胞机制并不为人所知。该协议旨在从成人草原卷的神经原位获得神经祖细胞，这些细胞在非粘附条件下培养，以产生神经球。神经球的大小和数量取决于区域（辅助区或凹陷陀螺）和草原卷的性别。这种方法是研究体外神经基因利基的性别依赖差异和与社会行为相关的神经可塑性变化（如配对结合和双亲护理）的显著工具。此外，可以检查导致社会互动缺陷的认知条件（自闭症谱系障碍和精神分裂症）。

引言

草原卷（Microtus ochrogaster）是克里西蒂达家族的一员，是一种小型哺乳动物，其生命策略发展为社会一夫一妻制和高度善于交际的物种。雄性与雌性在交配或长期同居后建立持久的对结，其特点是共享巢，保卫自己的领地，并表现出双亲照顾他们的后代^{1，2，3，4。}因此，草原卷是理解社会性行为和社会认知障碍的神经生物学基础的宝贵^模型。

成人神经生成是导致行为变化的神经可塑性最重要的过程之一。例如，我们的研究小组在雄细胞中报告说，与交配的社会同居增加了在海马体凹陷陀螺（DG）的辅助区（VZ）和亚角区细胞增殖，这表明成人神经生成可以在草原卷交配诱导的配对结合（未公布的数据）中发挥作用。另一方面，虽然产生和整合新神经元的大脑区域是众所周知的，但由于整个大脑模型6的技术缺点，这些过程中涉及的分子和细胞机制仍然^不确定。例如，控制基因表达和其他细胞活动的信号通路具有相对较短的激活期（磷蛋白群的检测^）7。另一种模型是分离和培养成人神经干细胞或祖细胞，以阐明参与成人神经生成分子成分。

维持成年哺乳动物（小鼠）大脑中的神经前体的第一个方法是神经球的测定，神经球是在非粘附条件下生长的细胞聚集体，保留了其产生神经元的多能潜力，以及星细胞^{8、9、10。}在它们的发展过程中，有一个选择过程，只有前体会响应米粒生长因子（EGF）和纤维细胞生长因子2（FGF2）等表皮生长因子（FGF2），以增殖和产生^{神经球8，9，10。}

据我们所知，文献中没有关于从草原卷获得成人神经祖细胞的协议。在这里，我们建立了培养条件，通过神经球形成分析将神经元祖细胞从神经原位及其体外维持中分离。因此，实验可以设计为确定神经干细胞和祖细胞的增殖、迁移、分化和存活的分子和细胞机制，这些机制在草原卷中仍然不为人知。此外，阐明从VZ和DG衍生的细胞的特性的体外差异，可以提供神经基因利基在神经可塑性中的作用的信息，与社会性行为和认知行为的变化，以及社会互动的不足（自闭症谱系障碍和精神分裂症），这也可能依赖于性别。

研究方案

这项研究得到了墨西哥墨西哥国家国家大学神经生物学研究所研究伦理委员会和全国生物学研究所（2018-1-163）的批准。这些动物的繁殖、护理和人道终点是根据墨西哥卫生秘密协会"萨卢德总健康法"（卫生研究一般健康法）根据墨西哥官方标准（NOM-062-Z00-1999）建立的。

1. 解决方案和库存准备

1. 准备N2培养基与485 mL的Dulbecco的修改鹰中-F12（DMEM-F12），5mL的N2补充剂（100x），5mL的谷氨酰胺补充剂（100x）和5mL的抗生素抗霉菌（100x）。
2. 准备一个B27培养基与480 mL的神经基础介质，10 mL的B27补充剂（50x），5mL的谷氨酰胺补充剂，和5mL的抗生素抗真菌（100x）。
3. 在 1x PBS（磷酸盐缓冲盐水）中重组胶酶粉，以获得活性为 100 单位/μL （1000x） 的等分，并储存在 -20 °C。 请注意，胶原酶的活动取决于公司的批号。
4. 在 1x PBS （50 mg/mL） 中溶解 5 毫克的去色粉末，以准备 diss 库存等分。储存在-20°C。
5. 制备具有 100 mMEM-F12 介质的酶溶液，50 μL 的库存胶酶（100 单位/μL），最终浓度为 50 U/mL 和 333 μL 的库存 dispase （50 mg/mL），最终浓度为 0.33 mg/mL。
6. 要准备洗涤溶液，至 1000 mL 的 1x PBS，加入 0.4766 g HEPES（最终浓度 2 mM）、3.6 g D-葡萄糖（最终浓度 20 mM）和 2.1 g NaHCO_3（ 最终浓度 25 mM）。
7. 使用无菌水准备聚L-奥尼辛股票（1毫克/千升），储存在-20°C。
8. 准备聚-L-奥尼辛的工作解决方案。在49毫升无菌水中稀释库存等分（1mg/mL），最终浓度为20μg/mL。
9. 准备层压素的工作解决方案。将 25 μL 层薄荷（1 mg/mL 原库存）稀释在 5 mL 无菌水中，最终浓度为 5 μg/mL。
   注:制备后，过滤培养介质、工作和库存解决方案，以避免污染。使用注射器或瓶顶真空过滤器（孔径为 0.2 μm 的聚氨酯膜）。培养基介质和工作解决方案可以在 4 °C 下存储长达 30 天，而在 -20°C 下可存储多达 4 个月。

2. 开始微分流前的准备

1. 通过高压灭菌或热玻璃珠干消毒器对手术器械进行消毒。
2. 在严格的无菌和防腐条件下（例如，用臭氧水）清洁微解表面积。
   注:每个卷脑中两个神经基因利基的微致性分理的分显时间约为30分钟。建议使用1-4只动物完成整个过程。

3. 提取整个大脑

1. 麻醉成人卷（12-16周）与过量的五巴比妥（6.3毫克/动物）通过内丙酮注射。通过没有踏板反射来响应坚定的脚趾捏，验证麻醉的深度。
2. 一旦卷完全麻醉，通过斩首诱导安乐死，并恢复头部。
3. 用剪刀从头骨中解剖皮肤，做一个骨-罗体切口（15毫米长）来暴露头骨。
4. 切开腹骨和腹间骨骼，沿着下垂和腹牙线切入头骨。
5. 用剪刀在正面骨骼和骨骼交界处的头骨上打个洞，小心不要损伤脑组织。
6. 要暴露大脑，请用锋利的钳子取出覆盖两个大脑半球的剩余颅骨碎片。
7. 使用不锈钢铲将整个大脑从颅基上抬起来。
8. 用20 mL的冷洗溶液将大脑收集到离心管（50 mL）。
9. 用冷洗溶液洗脑两次。

4. 神经组织的微切除

1. 将培养皿放在被冰包围的表面上。
2. 将大脑沉积在盘子上，加入20mL的冷洗溶液。
3. 用手术刀，在日冕平面上，将大脑分成两个组织块（左体和骨。作为神经解剖学参考，在前后轴^11（ 图1A，实线）的布雷格玛水平上执行日冕切割。
4. 从骨骼块中提取VZ组织（图1B），而从骨块取出DG（图1C）。
5. 在立体显微镜下解剖 VZ。
   1. 用杜蒙钳子，举行半球之一;然后，在心室的高度插入第二个杜蒙力的细尖，在组织下，线由胆小子-普塔门（图2A）。
   2. 沿多索文体轴打开钳子以分离组织。
   3. 使用 2 mL 的冷洗溶液在离心管中收集每个个体的 VZ 组织。不要将两种动物的组织集中。
   4. 在另一半球重复微切除。
   5. 将含有双边 VZ 组织的管子存放在冰上，并继续解剖 DG。
6. 在立体显微镜下从考达尔块中解剖 DG。
   1. 用手术刀，做一个日冕切入块，以获得两片，其中海马的形成观察。作为一个里程碑，根据鼠标大脑图集^11（ 图1A，虚线和图1C），在前部轴的-2毫米Bregma 坐标下进行切割。
   2. 使用 Dumont 钳子，握住其中一个切片，用细点 Dumont 钳子在 DG 和 CA1 之间进行水平切割，然后在 DG 和 CA3 之间执行垂直切口以分隔 DG（图 2B）。
   3. 在另一个半球的第一片中重复解剖。
   4. 在第二个切片中的两个半球中重复解剖。
   5. 在离心管中收集每卷的四个 DG 片。请勿将两种动物的 DG 组织集中。
      注:如果需要解剖多个动物，请将附有VZ或DG组织的离心管储存在冰上，同时继续解剖大脑的其余部分。解剖时清除覆盖脑组织的所有血管。如果不丢弃这些血管，培养物可以与过量的红细胞混合，干扰神经球的形成。

5. 神经细胞分离

1. 将离心管放在生物安全柜内，等待约 10 分钟，让组织碎片通过重力沉淀。
2. 拆下洗涤液，将 1 mL 的暖酶溶液添加到每个管中。
3. 在37°C下孵育管子10分钟。
4. 分解组织碎片;移液器上下与 1 mL 尖端。不要移液超过30倍。
5. 在37°C下进行10分钟的第二次孵育。
6. 在第二次孵育结束时，移液器分解组织。不要移液超过30倍。
   注:移液后，组织片段应完全分解;如果它们没有分解，在37°C下再孵育10分钟，然后重新移液。消化期不应超过30分钟。
7. 每管加入9 mL的N2介质，稀释酶处理。
8. 在室温下以 200 x g 离心管 4 分钟。
9. 丢弃上一杯，用10 mL的N2介质清洗。
10. 在步骤5.8相同的条件下进行离心机。
11. 从每个管中去除上重物，并分别将VZ和DG的细胞颗粒在2 mL和1 mL的B27介质中重新暂停。
12. 要去除任何非分解组织，请使用细胞滤株（大小 40 μm）过滤每个细胞悬浮液。

6. 神经球的形成

1. 培养细胞通过过滤器进入一个超低的附件，24井板。使用两口用于 VZ 的井，一口用于 DG（1 mL 的 B27 介质/孔）。
2. 在每个井中加入20纳克/mL的FGF2和20纳克/mL的EGF（最终浓度1x）。
3. 在37°C、5%CO 2和高湿度（90-95%）下孵育。请勿打扰 48 小时（培养的第 1 天和第 2 天，D1-D2）。
4. 在第三天（D3），去除一半的培养基，代之以新鲜的B27介质（每井500μL），并辅以双浓度（2倍）的生长因子。
5. 每三天重复一次，改变培养基（其中一半），代之以新的B27培养基，辅以双浓度（2倍）的生长因子。
6. 在不需要改变培养媒介的日子里，将生长因子添加到最终浓度的 1 倍。
7. 确保神经球在 D8-D10 周围形成。
8. 在 D10 中，更换完整的培养介质以清除所有碎屑。
   1. 在离心管中分别收集每一井的中层和神经球。
   2. 在室温下孵育10分钟。这个过程允许神经球通过重力沉淀。
   3. 去除上一升，在1 mL的新鲜B27介质中去除，并辅以生长因子。
   4. 将神经球放回同一超低附着板中，在37°C、5%CO_2下孵育。
9. 从 D10 到 D15，继续改变一半的介质并增加增长因子。

7. 神经球的通过

1. 在主要培养的D15，使用1mL移液器将神经球收集到离心管中。切开移液器尖端以增加开口的大小，以避免对神经球的损伤。
2. 在室温下孵育10分钟。神经球由重力沉淀。
3. 取出介质，每管添加1 mL的细胞分离介质。
4. 在37°C下孵育管子7分钟。
5. 用 1 mL 尖端上下移液，以拆除神经球。
6. 每管用3 mL的B27介质稀释细胞分离介质。
7. 在 200 x g 下将电池悬浮液离心 5 分钟。
8. 丢弃上一提液，用新鲜的B27培养基补充生长因子，重新暂停每个细胞颗粒。
   1. 在4mL的介质中重新发送VZ衍生细胞，在2mL的介质中重新暂停VZ衍生细胞。
9. 通过将初级培养中使用的孔数（VZ 和 DG 分别用于 4 和 2 孔）增加一倍，在新的超低附着板中培养细胞（通道 1）。
10. 每三天更换一半的介质，每日增加生长因子。
11. 在第 1 通道中 10 天后 （D10），在下一通道中更改为粘附条件。

8. 附时条件下的通道

1. 在执行通道 2 之前，准备涂有聚 L-奥尼辛和层氨基的涂层板。
   1. 在24孔板中，每孔加入500μL的1x聚L-奥尼辛（20μg/mL）。在37°C孵育过夜。
   2. 拆下聚-L-苯乙烯，用1x PBS（500μL/well）洗涤4x。
   3. 每井加入200μL（最小体积覆盖单个井表面）1x层明（5μg/mL），在培养细胞前在37°C下孵育2-3小时。
2. 用带切头的 1 mL 移液器将神经球收集到离心管中。
3. 在室温下孵育10分钟，通过重力沉淀神经球。
4. 丢弃上一级，在没有生长因子的情况下，在新鲜的B27介质中重新暂停神经球。
5. 从涂层板中吸出层压，并使用带切头的 1 mL 移液器将神经球沉积到井中。
   注:防止涂层孔在去除层压和电镀神经球之间干燥。
6. 将区域性分为两个条件:
   1. 保持差异化神经球6天（D6）。每三天更换一次介质，每日增加生长因子。
   2. 观察神经球衍生细胞的分化12天（D12）。每三天更换一次，没有生长因子。
      注:在D6的末尾，对于未分化的或D12的分化条件，这些细胞可用于常规的免疫组织化学、细胞分选分析、5-Ethynyl-2'-脱氧核糖核酸（EdU）染色、RNA提取等。

结果

神经球是由从雌雄成年草原卷的VZ和DG分离出的神经干细胞形成的。开始培养后大约8-10天，细胞应该已经形成神经球。请注意，该板可能包含主培养物中的碎屑（图 3A）。然而，在第1段，培养者应该只包括神经球（图3B）。

与雌性VZ和雌性VZ相比，从女性VZ获得的神经球数量更高（图4A）。这些数据表明，获得?...

讨论

获得神经干细胞培养的阶段是酶溶液的消化期，不应超过30分钟，因为它可能会降低细胞的生存能力。神经球应在初始培养后8-10天出现;如果第12天没有出现，就放弃培养，重复实验，缩短消化期。另一个问题就是覆盖脑组织的血管。在解剖过程中，它们应该被完全去除，因为红细胞的过量会干扰神经球的形成。

该协议允许扩展浮动神经球，直到通过2和改变粘附条件，以评估?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies			Antibody ID
Anti-Nestin	GeneTex	GTX30671	RRID:AB_625325
Anti-Doublecortin	MERCK	AB2253	RRID:AB_1586992
Anti-Ki67	Abcam	ab66155	RRID:AB_1140752
Anti-MAP2	GeneTex	GTX50810	RRID:AB_11170769
Anti-GFAP	SIGMA	G3893	RRID:AB_477010
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11029	RRID:AB_2534088
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A-11036	RRID:AB_10563566
Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11073	RRID:AB_2534117
Culture reagents
Antibiotic-Antimycotic	Thermo Fisher Scientific/Gibco	15240062	100X
B-27 supplement	Thermo Fisher Scientific/Gibco	17504044	50X
Collagenase, Type IV	Thermo Fisher Scientific/Gibco	17104019	Powder
Dispase	Thermo Fisher Scientific/Gibco	17105041	Powder
DMEM/F12, HEPES	Thermo Fisher Scientific/Gibco	11330032
Glucose	any brand		Powder, Cell Culture Grade
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific/Gibco	35050061	100X
HEPES	any brand		Powder, Cell Culture Grade
Mouse Laminin	Corning	354232	1 mg/mL
N-2 supplement	Thermo Fisher Scientific/Gibco	17502048	100X
NAHCO3	any brand		Powder, Suitable for Cell Culture
Neurobasal	Thermo Fisher Scientific/Gibco	21103049
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific/Gibco	10010023	1X
Poly-L-ornithine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P3655	Powder
Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15
Recombinant Human FGF-basic	Peprotech	AF-100-18B
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Thermo Fisher Scientific/Gibco	A1110501	100 mL
Disposable material
24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates	Corning/Costar	3473
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates	Corning/Costar	3526
40 µm Cell Strainer	Corning/Falcon	352340	Blue
Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 µm pore	Corning	431118	PES membrane, 45 mm diameter neck
Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube	any brand		with conical bottom
Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl.	any brand
Sterile cotton gauzes
Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL	any brand
Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL	any brand
Sterile surgical gloves	any brand
Syringe Filters, 0.22 µm pore	Merk Millipore	SLGPR33RB	Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter
Equipment and surgical instruments
Biological safety cabinet
Dissecting Scissors
Dumont Forceps
Motorized Pipet Filler/Dispenser
Micropipettes
Petri Dishes
Scalpel Blades
Stainless-steel Spatula