أساليب معدلة لتحميل عالية الإنتاجية ألواح استخراج الحمض النووي يقلل من احتمال التلوث

Summary

يمكن أن تكون الطرق الحالية لتحميل 96-صحون البئر لاستخراج الحمض النووي عرضة للتلوث. نحن تفاصيل طريقة جديدة لتحميل 96-آبار لوحات أن يقلل من خطر التلوث المتبادل بين الآبار. ستساعد طريقتنا الباحثين الآخرين على الاستفادة من كفاءة تقنيات استخراج الحمض النووي عالية الإنتاجية وتقليل خطر التلوث.

Abstract

وقد ساهمت تقنيات تسلسل الحمض النووي عالية الإنتاجية بشكل كبير في التقدم في فهمنا للعلاقات بين المجتمعات الميكروبية، وخصائص المضيف، ووظائف النظام الإيكولوجي الأوسع. مع هذه الزيادة السريعة في اتساع وعمق قدرات التسلسل قد حان أساليب لاستخراج وتضخيم وتحليل وتفسير الحمض النووي البيئي بنجاح مع أقصى قدر من الكفاءة. لسوء الحظ، يمكن أن يأتي إجراء عمليات استخراج الحمض النووي بسرعة على حساب زيادة خطر التلوث بين العينات. وعلى وجه الخصوص، فإن عمليات الاستخراج العالية الإنتاجية التي تستند إلى عينات موجودة في لوحة من 96 بئراً توفر طريقة سريعة نسبياً، مقارنة باستخراجات أحادية الأنبوب، ولكنها تزيد أيضاً من فرص التلوث العابر من البئر إلى الجيد. لتقليل خطر التلوث المتبادل بين العينات، مع الاحتفاظ بفوائد تقنيات الاستخراج عالية الإنتاجية، طورنا طريقة جديدة لتحميل العينات البيئية في ألواح 96 بئر. استخدمنا ختم PCR قابل للخرق لأفلام لتغطية كل لوحة أثناء تحميل العينات وأضاف عينات أولاً إلى أنابيب PCR قبل نقلها إلى الآبار؛ وهذه الممارسات معاً تقلل من خطر الانجراف العينة والتحميل المزدوج غير المقصود للآبار. وتوفر الطريقة المبينة في هذه الورقة للباحثين نهجاً لتحقيق أقصى قدر من تقنيات الاستخراج العالية الإنتاجية المتاحة مع الحد من خطر التلوث المتبادل الملازم للوحات 96 بئراً. نحن نقدم خطوة مفصلة من الخطوط العريضة لكيفية الانتقال من جمع العينات إلى استخراج الحمض النووي مع التقليل من خطر التلوث المتبادل غير المرغوب فيه.

Introduction

إن التقدم الذي تحقق مؤخراً في التسلسل عالي الإنتاجية للمجتمعات الميكروبية يوفر عمق تسلسل لا مثيل له، وبالتالي، لمحة غير مسبوقة عن أداء وتنوع ميكروبيوم الأرض¹. كما يزيد القدرة على تعدد العينات أكثر وأكثر على مسار تسلسل واحد، استخراج الحمض النووي أنبوب واحد لديه القدرة على أن تصبح خطوة تحد من معدل في توليد البيانات البيئية. ومع ذلك ، طرق جديدة في استخراج الحمض النووي عالية الإنتاجية عقد الوعد لمعالجة كميات كبيرة من العينات البيئية مع كفاءة أكبر مما كان ممكنا في السابق^2. وغالباً ما تنطوي هذه الطرق على استخدام 96 بئراً بدلاً من أنابيب واحدة، مما يزيد من العدد المحتمل من عمليات الاستخراج التي يمكن أن تحدث في وقت واحد. على هذا النحو، فإن التطبيق العملي والكفاءة من أساليب استخراج عالية الإنتاجية واضحة وقد تم تنفيذها لمعالجة العينات البيئية تتراوح بين التربة^3،,4 والأنسجة النباتية^3،,5 إلى البراز الإنسان^2.

وفي حين أن هذه الطرق يمكن أن تسرع بشكل كبير على طول معالجة العينات واستخراج الحمض النووي، فإن الخطوة الأولية لتحميل التربة وعينات إيكولوجية أخرى في ألواح 96 بئراً معرضة للتلوث عبر العينات. يمكن أن يحدث هذا النوع من التلوث الجيد أثناء عمليات استخراج الحمض النووي^,6و7و⁸، والآبار معرضة بشكل خاص في هذه الخطوة الأولى قبل تعليق العينات في محلول عازل. McPherson وآخرون⁹ شرح طريقة لتحميل التربة rhizosphere في 96-آبار لوحات باستخدام القمع و8-آبار PCR يغطي الشريط، ولكن في حين أن طريقتهم هو نهج أكثر رقابة على لوحات التحميل، فإنه لا يزال يوفر فرصة واسعة لتلوث الآبار المجاورة عند تحميل كل عينة. بالإضافة إلى ذلك، تسمح الآبار المفتوحة بفرصة للباحث المشتت لوضع عينة في البئر غير الصحيح أو إضافة عينة إلى بئر تم تحميله بالفعل. وبالإضافة إلى ذلك، مجموعة متنوعة من أنواع العينات يثبت أن غير مناسب للتحميل مع هذا الأسلوب; العينات الرطبة في كثير من الأحيان عصا إلى القمع والعينات الجافة "القفز" بين الآبار بسبب الكهرباء الساكنة.

للحد من فرص التلوث بين الآبار في الخطوة الأولى من استخراج الحمض النووي عالي الإنتاجية ، طورنا نهجًا جديدًا لتحميل عينات التربة في 96 بئرًا. لدينا أساليب حماية الآبار من التعرض البيئي ومنعنا من تحميل عينات متعددة بطريق الخطأ في بئر واحد (التحميل المزدوج). ونحن نعتقد أن الطريقة المذكورة أدناه تقدم وعدا للحد من احتمال التلوث وعلى هذا النحو يوفر وسيلة أكثر رقابة لتحميل 96 آبار للاستخلاص الحمض النووي اللاحقة.

Protocol

1. مختبر مقاعد البدلاء وإعداد أداة لتحميل لوحة 96-جيدا

1. واضح أعلى مقاعد البدلاء عن طريق الضباب مع 70٪ الإيثانول. مسح والسماح للهواء الجاف قبل رش أعلى مقاعد البدلاء مع 10٪ التبييض. امسح أعلى مقاعد البدلاء الجافة.
2. تعقيم ملعقة صغيرة، ملعقة، ومقص الجراحية (منحني) عن طريق غمس في 95٪ الإيثانول ومن ثم تعرض لهب. تراجع كل في 10٪ التبييض والسماح لتجف الهواء قبل الاستخدام.
   ملاحظة: يجب أن يتم تعقيم أدوات بين كل عينة.

2- أخذ العينات الفرعية وإعداد العينات

1. تعقيم القفازات باستخدام الإيثانول قبل أخذ العينات الفرعية.
2. التجانس عينات التربة بدقة قبل أخذ العينات الفرعية.
3. باستخدام أدوات معقمة، تحميل أنبوب جهاز طرد مركزي 2 مل المسمى مع عينة حتى نصف كامل تقريبا.
4. كرر الخطوة 2.2 حتى يتم أخذ عينات فرعية من جميع العينات البالغ 95 إلى أنابيب أجهزة طرد مركزي 2 مل. وينبغي استخدام^بئر 96 كفراغ الاستخراج.
   ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوتين 2.3 و 2.4 لتقليل مساحة التخزين المطلوبة لمنع أخذ العينات عبر أو مزدوج.
5. تخزين 2 مل أنابيب عينة فرعية على الجليد حتى تحميل لوحة.
6. تسمية 96 معقم 200 ميكرولتر مسطحة توج أنابيب PCR A1\u2012A12، B1\u2012B12، .... H1\u2012H12. ضع هذه الأنابيب في ترتيب في رف 96-جيدا.
7. تعيين معرف عينة مع موقع بئر (A1\u2012H12) وتسجيله.

3. إعداد لوحة

1. إزالة الغطاء المطاطي من 96-جيدا لوحة (الشكل 1A-1C) ووضعها في كيس من البلاستيك العقيمة (انظر جدول المواد). ختم كيس من البلاستيك لمنع التلوث.
2. تغطية لوحة 96-جيدا مع ختم الفيلم (الشكل 1D-1E); على سبيل المثال، استخدم فيلم ختم قابل للثقب قبل القطع (راجع جدول المواد). ضمان ختم من المتداول مع الأسطوانة المطاطية.
   ملاحظة: يمكن أن توفر حصائر السيليكون القابلة للخرق خيارًا قابلًا لإعادة الاستخدام ، وتوفر التنظيف المناسب بين الاستخدامات ، ولكن حصائر السيليكون التي اختبرناها تقسيمها بسهولة على طول الثقوب ولن توفر حماية متساوية لأي لوحات تالية.
3. ضع لوحة في الثلاجة (4 درجة مئوية) للحفاظ على برودة.

4- نقل العينات الفرعية

ملاحظة: راجع الخطوة 4.13 للتعديلات عندما تكون عينة التربة صغيرة جداً.

1. ضع 24 من العينات الفرعية 2 مل في كتلة ثلج للتخزين البارد.
2. باستخدام اسم العينة ورقة موقع جيد اختيار الصحيح 200 ميكرولتر مسطحة توج PCR أنبوب.
3. اتخاذ 2 مل دون عينة أنبوب ودوامة ل ~ 5 s لضمان التجانس.
4. باستخدام اللهب وأدوات معقم تبييض تحميل ~ 200 ميكرولتر من العينة الأولى في أنبوب PCR مسطحة مغطاة بالصحيح (الشكل 1F).
5. كرر الخطوات 4.2\u20124.4 حتى يتم تحميل كافة 24 عينة. ثم الانتقال إلى الخطوة 4.6.
6. باستخدام مسح الورق المغمس بالتبييض، قم بتنظيف السطح الخارجي لمترو PCR المسطح 200 ميكرولتر.
7. عكس أنبوب والاستفادة على مقاعد البدلاء لنقل عينة إلى أعلى الأنبوب. مع مقص ابيض ومعقمة لهب، مقطع الجزء السفلي من أنبوب PCR لإنشاء فتحة لعينة لتقع في لوحة 96-well(الشكل 1G).
8. تحديد موقع جيد الصحيح على لوحة 96-well وتمرير أنبوب عبر لوحة مع قطع نهاية تواجه حتى تصل إلى أن جيدا. إمالة لوحة قليلا لتسهيل ثقب من فيلم ختم قبل القطع، وفقط عندما أنبوب هو مباشرة فوق الصحيح جيدا عكس ذلك بعناية بحيث قطع تلميح يناسب في البئر. باستخدام أدوات معقمة، اضغط على الجزء العلوي من أنبوب PCR حتى سقطت كل التربة من الأنبوب إلى البئر. ترك أنبوب داخل البئر مع غطاء مغلق (الشكل 1H-1J).
9. إزالة واحدة مسطحة توج 200 ميكرولتر PCR أنبوب في وقت واحد وإضافة 750 ميكرولتر من حل حبة إلى أن جيدا (الشكل 1K). دفع 200 μL مسطحة توج PCR أنبوب على طول الطريق إلى أسفل إلى البئر ووضع علامة على أعلى مع sharpie للإشارة إلى أن هذا البئر قد تم تحميلها. كرر هذا لكل عينة.
10. مرة واحدة وقد تم تحميل جميع العينات 24 و حبة حل المضافة، وإزالة أنابيب 2 مل عينة فرعية واستبدالها مع 24 أنابيب غير مُعيّن.
11. كرر الخطوات 4.1\u20124.10 حتى يتم تحميل جميع الآبار 95 مع عينة أو حل فارغة والخرزة. إزالة أنابيب دون تمريرها على الآبار المفتوحة (الشكل 1L).
12. إزالة الفيلم اختراق بعناية واستبدال الغطاء المطاطي لحماية لوحة حتى بداية استخراج (الشكل 1M-1O).
13. بالنسبة لكميات صغيرة جدًا من التربة التي يتم أيضًا وضعها بدقة، أضف 750 ميكرولتر من محلول الخرز إلى أنبوب العينة واستخدم طرف ماصات واسع النطاق لنقل جميع المحتويات إلى البئر المناسبة. ضع أنبوب PCR في الفتح لمنع التحميل المزدوج.
    ملاحظة: كن حذرا عند تنفيذ هذا التعديل كما الجسيمات العضوية أو شظايا الصخور الصغيرة أكبر من تتحمل من طرف ماصة يمكن أن تسد ماصة وجعل نقل الطين العينة صعبة.
14. كما يلزم تجميد في -20 درجة مئوية ولوحات مخزن محملة عينة والخرزة الحل حتى استخراج المخطط لها.

5. مقارنة بين طرق تحميل لوحة

ملاحظة: من أجل التحقق من طريقتنا الجديدة لتحميل 96-جيدا استخراج لوحات الحمض النووي، ونحن قسمت لوحة واحدة 96-جيدا إلى ثلاثة أقسام. استخدمنا ثلاث طرق مختلفة لتحميل الألواح لمقارنة إمكانية التحميل غير المقصود للتربة والتلوث العابر. الأساليب الثلاث التي استخدمناها هي الطرق المبينة في McPherson et al.⁹، بروتوكول التحميل الافتراضي Qiagen¹⁰، والبروتوكول الذي نحدده في هذا المنشور.

1. تحميل التربة في لوحة
   1. قسم لوحة 96 جيدا في ثلاث كتل أربعة أعمدة. قم بتحميل كل كتلة باستخدام أحد الطرق الثلاثة المذكورة أعلاه.
   2. تحميل التربة في كل بئر أخرى بحيث يتم ترنح العينة والآبار الفارغة. ويتيح هذا الترتيب أقصى فرصة لتحميل العينات غير المقصودة والتلوث العابر.
   3. تجميد لوحة 96-جيدا في -20 درجة مئوية حتى استخراج الحمض النووي.
2. استخراج الحمض النووي
   1. استخراج الحمض النووي وفقا 96-جيدا مصنع لوحة استخراج البروتوكول^10.
   2. تخزين مستخلصات الحمض النووي في -20 درجة مئوية حتى مزيد من التحليل.
3. القياس الكمي للحمض النووي في الآبار الفارغة
   1. ذوبان مستخلصات الحمض النووي في درجة حرارة الغرفة، دوامة وتدور أسفل باستخدام الدوار لوحة.
   2. قياس وتسجيل تركيزات الحمض النووي للآبار الفارغة باستخدام مقياس الطيف.
   3. استخدم اختبار ANVOA و Tukey بعد المخصص لتحليل الاختلافات في متوسط تركيز الحمض النووي في الآبار الفارغة.
      ملاحظة: تم الإبلاغ عن اختلافات كبيرة عند α = 0.05.

النتائج

تم استخدام هذه الطريقة الجديدة بنجاح لتحميل 96-جيدا لوحات استخراج الحمض النووي. وأظهرت المقارنة بين طرق تحميل الألواح أن لدينا طريقة أن يكون أدنى تركيز الحمض النووي في الآبار الفارغة. وكان تركيز الحمض النووي في الآبار الفارغة أقل بكثير من الطريقة المقترحة My McPherson et al.⁹ (p < 0.05)، ع?...

Discussion

هذه الطريقة يقلل من فرص جيدا إلى جيد عبر التلوث أثناء تحميل عالية الإنتاجية عينات استخراج لوحات ويوفر وسيلة أكثر رقابة لتحميل 96-آبار لوحات وراء القائمة لوحات تحميل الاستراتيجيات^9,10. التلوث بين الآبار يمكن أن يكون أكثر انتشارا في استخراج 96 جيدا لوحة من في عم?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 oz WhirlPak	Nasco	B01065
2 mL centrifuge tubes	Fisherbrand	05-408-129
200 µL micro-PCR tubes	Thermo Scientific	AB 2000
96-well PowerSoil DNA extraction kit	Qiagen	12955-4	We used a soil extraction kit but any 96-well format kit would work.
Ice block for 2 mL centrifuge tubes	Any	Any	Any ice block made for 2 mL tubes will work
Ice block for 200 µL micro-PCR tubes	Any	Any	Any ice block made for 200 µL tubes will work
Micro scoopula	Any	Any
Precut Pierceable Sealing Film	Excel Scientific	XPS25
Spatula	Any	Any
Surgical scissors	Any	Any