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Method Article
Gli attuali metodi per il caricamento di piastre di 96 well per le estrazioni di DNA possono essere soggetti a contaminazione. Dettagliamo un nuovo metodo per caricare piastre a 96 pozzi che riduce il rischio di contaminazione incrociata tra i pozzetti. Il nostro metodo aiuterà altri ricercatori a capitalizzare l'efficienza delle tecniche di estrazione del DNA ad alto rendimento e a ridurre al minimo il rischio di contaminazione.
Tecniche di sequenziamento del DNA ad alto rendimento hanno contribuito notevolmente a far progredire la nostra comprensione delle relazioni tra le comunità microbiche, le caratteristiche dell'ospite e le funzioni più ampie dell'ecosistema. Con questo rapido aumento di ampiezza e profondità delle capacità di sequenziamento sono venuti metodi per estrarre, amplificare, analizzare e interpretare il DNA ambientale con successo con la massima efficienza. Purtroppo, l'esecuzione rapida di estrazioni di DNA può costare il rischio di contaminazione tra i campioni. In particolare, le estrazioni ad alta velocità che si basano su campioni contenuti in una piastra di 96 po 'offrono un metodo relativamente veloce, rispetto alle estrazioni a tubo singolo, ma aumentano anche le opportunità di contaminazione incrociata ben bene. Per ridurre al minimo il rischio di contaminazione incrociata tra i campioni, pur mantenendo i benefici delle tecniche di estrazione ad alto rendimento, abbiamo sviluppato un nuovo metodo per caricare campioni ambientali in piastre a 96 poteggiamenti. Abbiamo usato pellicole di tenuta PCR forabili per coprire ogni piastra durante il caricamento dei campioni e abbiamo aggiunto campioni prima ai tubi PCR prima di spostarli in pozzi; insieme, queste pratiche riducono il rischio di deriva del campione e di doppio carico involontario di pozzi. Il metodo descritto in questo documento fornisce ai ricercatori un approccio per massimizzare le tecniche di estrazione ad alto rendimento disponibili, riducendo al contempo il rischio di contaminazione incrociata inerente alle piastre a 96 pozze. Forniamo una descrizione dettagliata passo dopo passo di come passare dalla raccolta dei campioni all'estrazione del DNA, riducendo al minimo il rischio di contaminazione incrociata indesiderata.
I recenti progressi nel sequenziamento ad alto rendimento delle comunità microbiche stanno fornendo una profondità di sequenziamento senza precedenti e, di conseguenza, uno sguardo senza precedenti sul funzionamento e la diversità del microbiomaterrestre 1. Con l'aumentare della capacità di multiplex sempre più campioni su una singola corsia di sequenziamento, l'estrazione del DNA a tubo singolo potrebbe diventare un passo limitante nella generazione di dati ecologici. Tuttavia, i nuovi metodi nelle estrazioni di DNA ad alto rendimento promettono di elaborare grandi quantità di campioni ambientali con una maggiore efficienza di quanto sia stato possibile inprecedenza 2. Questi metodi spesso comportano l'utilizzo di piastre di 96-pozzo invece di tubi singoli, aumentando così il possibile numero di estrazioni che possono verificarsi contemporaneamente. Di conseguenza, la praticità e l'efficienza dei metodi di estrazione ad alto rendimento sono evidenti e sono state implementate per la lavorazione di campioni ambientali che vannodal suolo 3,4 e tessutivegetali 3,5 alla materia fecaleumana 2.
Mentre questi metodi possono accelerare notevolmente lungo l'elaborazione dei campioni e l'estrazione del DNA, la fase iniziale di caricamento del suolo e di altri campioni ecologici in piastre a 96 po 'è suscettibile alla contaminazione da campioni incrociati. Questo tipo di contaminazione ben bene può verificarsi durante le estrazioni di DNA6,7,8e i pozzi sono particolarmente vulnerabili in questa prima fase prima che i campioni siano sospesi in una soluzione tampone. McPherson et al.9 dimostrano un metodo per caricare i suoli di rizosfera in lastre di 96 pozzi utilizzando imbuti e coperture a strisce PCR a 8 pozzi, ma mentre il loro metodo è un approccio più controllato al caricamento delle piastre, offre ancora ampie opportunità per la contaminazione dei pozzi vicini durante il caricamento di ogni campione. Inoltre, i pozzi aperti permettono la possibilità per un ricercatore distratto di inserire un campione nel pozzo non corretto o aggiungere un campione in un pozzo che è già stato caricato. Inoltre, una varietà di tipi di campione si rivelano inadatto per il caricamento con questo metodo; i campioni umidi spesso si attaccano agli imbuti e i campioni secchi "saltano" tra i pozzetti a causa dell'elettricità statica.
Per ridurre le opportunità di contaminazione tra i pozzi nella prima fase delle estrazioni di DNA ad alto rendimento, abbiamo sviluppato un nuovo approccio per caricare campioni di terreno in piastre a 96 pozzi. I nostri metodi proteggono i pozzi dall'esposizione ambientale e ci impediscono di caricare accidentalmente più campioni in un unico pozzo (doppio caricamento). Crediamo che il metodo riportato di seguito offra una promessa per ridurre il potenziale di contaminazione e come tale fornisce un mezzo più controllato per caricare piastre a 96 po 'per la successiva estrazione del DNA.
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1. Panca di laboratorio e preparazione dell'utensile per il caricamento di una piastra da 96
2. Sotto-campionamento e preparazione del campione
3. Preparazione della piastra
4. Trasferimento di sottose samples
NOTA: vedere il punto 4.13 per le modifiche quando il campione del suolo è molto piccolo.
5. Confronto dei metodi di caricamento delle piastre
NOTA: Al fine di verificare il nostro nuovo metodo per il caricamento di piastre di estrazione del DNA di 96-well, abbiamo diviso una singola piastra 96-well in tre sezioni. Abbiamo utilizzato tre diversi metodi di carico delle placche per confrontare il potenziale di carico involontario del suolo e della contaminazione incrociata. I tre metodi che abbiamo usato sono stati i metodi descritti in McPherson et al.9, il protocollo di caricamento predefinito di Qiagen10e il protocollo che si delinea in questa pubblicazione.
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Questo nuovo metodo è stato utilizzato con successo per caricare lastre di estrazione del DNA di 96-well. Il confronto dei metodi di caricamento delle placche ha mostrato il nostro metodo per avere la più bassa concentrazione di DNA nei pozzi vuoti. La concentrazione del DNA nei pozzi vuoti era significativamente inferiore al metodo proposto il mio McPherson et al.9 (p < 0.05), anche se le concentrazioni di DNA nel nostro metodo non erano statisticamente diverse dal metodo di default Qiagen (
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Questo metodo riduce le opportunità di contaminazione incrociata ben elevata durante il caricamento di piastre di estrazione del campione ad alta velocità di produzione e offre un mezzo più controllato per caricare piastre a 96 pori oltre le strategie di caricamento delle piastreesistenti 9,10. La contaminazione tra pozzi può essere più pervasiva nelle estrazioni di lastre di 96 pozzi rispetto alle estrazioni a tubo singolo, soprattutto quando
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Gli autori non segnalano conflitti di interesse e non hanno nulla da rivelare.
Questa ricerca è stata supportata dal Microbial Ecology Collaborative con il finanziamento del premio NSF #EPS-1655726.
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Name | Company | Catalog Number | Comments |
18 oz WhirlPak | Nasco | B01065 | |
2 mL centrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-129 | |
200 µL micro-PCR tubes | Thermo Scientific | AB 2000 | |
96-well PowerSoil DNA extraction kit | Qiagen | 12955-4 | We used a soil extraction kit but any 96-well format kit would work. |
Ice block for 2 mL centrifuge tubes | Any | Any | Any ice block made for 2 mL tubes will work |
Ice block for 200 µL micro-PCR tubes | Any | Any | Any ice block made for 200 µL tubes will work |
Micro scoopula | Any | Any | |
Precut Pierceable Sealing Film | Excel Scientific | XPS25 | |
Spatula | Any | Any | |
Surgical scissors | Any | Any |
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