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  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
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  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

目前装载 96 孔板进行 DNA 提取的方法容易受到污染。我们详细介绍了一种装载96孔板的新方法,该方法可降低井中交叉污染的风险。我们的方法将帮助其他研究人员利用高通量DNA提取技术的效率,并最大限度地降低污染风险。

摘要

高通量DNA测序技术极大地促进了我们对微生物群落之间的关系、宿主特性和更广泛的生态系统功能的理解。随着测序能力的广度和深度的迅速提高,人们以最高效率成功提取、放大、分析和解释环境DNA的方法。不幸的是,快速进行DNA提取可能会增加样品污染风险。特别是,与单管萃取相比,基于 96 井板中所含样品的高通量萃取提供了相对快速的方法,但也增加了井中交叉污染的机会。为了最大限度地降低样品交叉污染的风险,同时保留高通量萃取技术的好处,我们开发了一种将环境样品装入 96 孔板的新方法。我们使用可穿透的PCR密封膜覆盖每个板,同时加载样品,并首先将样品添加到PCR管,然后再将它们移动到井中;这些做法共同降低了样品漂移和意外双载井的风险。本文概述的方法为研究人员提供了一种方法,以最大限度地提高可用的高通量提取技术,同时降低96孔板固有的交叉污染风险。我们提供了如何从样品收集到DNA提取的详细分步概述,同时最大限度地降低不必要的交叉污染风险。

引言

微生物群落高通量测序的最新进展提供了无与伦比的测序深度,因此,对地球微生物群1的功能和多样性有着前所未有的瞥。随着将越来越多的样品多能复用到单个测序通道上的能力增加,单管DNA提取有可能成为生成生态数据中速率限制的步骤。然而,高通量DNA提取中的新方法有望以比之前更高的效率处理大量环境样品。这些方法通常涉及使用96孔板而不是单管,从而增加可能同时发生的萃取量。因此,高通量萃取方法的实用性和效率明显,已用于处理从土壤3、4,和植物组织,3、5人类粪便2等环境样品。4

虽然这些方法可以显著加快样品处理和DNA提取的速度,但将土壤和其他生态样品装入96孔板的初始步骤容易受到交叉样品污染。这种类型的井井污染可能发生在DNA提取6,7,8,,8和井特别脆弱,在这第一步样品悬浮在缓冲溶液之前。6,McPherson等人演示了一种使用漏斗和8孔PCR带盖将土壤装入96孔板的方法,但是,虽然它们的方法是一种更可控的装载板的方法,但它仍然为装载每个样品时邻近井的污染提供了充足的机会。此外,开放式井允许分心的研究人员将样品放入不正确的井中,或将样本添加到已加载的井中。此外,各种样品类型证明不适合用这种方法加载;由于静电,湿样品通常粘在漏斗和干样品之间"跳跃"。

为了在高通量DNA提取的第一步减少油井污染的机会,我们开发了一种将土壤样品装入96孔板的新方法。我们的方法既保护油井免受环境暴露,又可防止我们意外地将多个样品装进一个油井(双装)。我们相信,下面报告的方法有望减少污染的可能性,因此提供了一种更可控的方法,用于加载96孔板,以便随后提取DNA。

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研究方案

1. 用于装载 96 井板的实验室台和工具准备

  1. 用 70% 乙醇雾化工作,清除台面。在用 10% 漂白剂喷洒工作台顶之前,请擦拭并让空气干燥。擦干工作台顶。
  2. 通过浸入95%乙醇,然后暴露在火焰中,对微铲、铲子和手术剪刀(弯曲)进行灭菌。将每个浸在 10% 漂白剂中,并在使用前晾干。
    注:每个样品之间应对工具进行灭菌。

2. 子取样和样品制备

  1. 在亚采样前使用乙醇消毒手套。
  2. 在亚采样之前,将土壤样品完全均质化。
  3. 使用灭菌工具,将标有 2 mL 的离心管与样品一起装载,直到大约半满。
  4. 重复步骤 2.2,直到所有 95 个样品都已分采样到标签的 2 mL 离心管中。第 96 应用作提取空白。
    注:步骤 2.3 和 2.4 用于最小化所需的存储空间,并防止过度采样或双采样。
  5. 将 2 mL 亚样品管存放在冰上,直到装入板。
  6. 标签 96 无菌 200 μL 平盖 PCR 管 A1\u2012A12, B1\u2012B12,......H1\u2012H12.将这些管子放入 96 井机架中。
  7. 分配具有井位置(A1\u2012H12)的样品 ID 并记录它。

3. 板准备

  1. 从 96 孔板(图1A+1C)中拆下橡胶盖并将其放入无菌塑料袋中( 参见材料表)。密封塑料袋以防止污染。
  2. 用密封膜盖住96井板(图1D+1E);例如,使用预切割的可穿孔密封膜(参见 材料表)。使用橡胶辊滚动,确保密封。
    注:可穿孔硅胶垫可能提供可重复使用的选择,在用途之间提供适当的清洁,但我们测试的硅胶垫很容易沿穿孔分离,不会提供平等保护,以任何以下板。
  3. 将板放在冰箱 (4 °C) 中以保持凉爽。

4. 子样本的转移

注:当土壤样本非常小时,请参阅步骤 4.13 进行修改。

  1. 将 2 mL 子样本中的 24 个放入冰块中进行冷库。
  2. 使用样品名称和井位表选择正确的 200 μL 平盖 PCR 管。
  3. 采取2 mL子样品管和涡流为+5s,以确保均质化。
  4. 使用火焰和漂白剂消毒工具将第一个样品的 ±200 μL 负载到正确的平盖 PCR 管中(图 1F)。
  5. 重复步骤 4.2\u20124.4,直到加载所有 24 个样本。然后转到步骤 4.6。
  6. 使用漂白浸纸擦拭,清洁 200 μL 平盖 PCR 管的外盖。
  7. 反转管子,轻按工作台,将样品移动到管的顶部。使用漂白和火焰消毒剪刀,夹住 PCR 管的底部,为样品进入 96 孔板(图1G) 创建开口。
  8. 在 96 井板上找到正确的井,并通过管穿过板,切割端朝上,直到到达该井。稍微倾斜板,以方便刺穿预切割的可刺穿密封膜,只有当管正上方正确的井小心倒合,使切割尖端适合井。使用灭菌工具,轻拍 PCR 管的顶部,直到所有土壤从管中掉入井中。将管子盖紧放在井内(图1H+1J)。
  9. 一次拆下一个平顶 200 μL PCR 管,并将 750 μL 的珠子溶液添加到该井中(图 1K)。将 200 μL 平盖 PCR 管一直推入井中,并用锐利标记顶部,以指示该井已装好。对每个样本重复此项。
  10. 加载所有 24 个样品并添加珠子溶液后,拆下 2 mL 子样品管,然后更换为 24 个未采样管。
  11. 重复步骤 4.1\u20124.10,直到所有 95 孔都装有样品或空白和珠子溶液。拆下管子,而不将其穿过打开的井(图1L)。
  12. 小心地拆下可刺穿的薄膜并更换橡胶盖以保护板,直到开始提取(图 1M=1O)。
  13. 对于非常少量的同样细粒度的土壤,在样品管中加入 750 μL 的珠溶液,并使用宽孔移液器尖端将所有内容物转移到适当的孔中。将 PCR 管放入开口,以防止双重加载。
    注:在实施这种修改时要小心,因为颗粒有机物或大于移液器尖端孔的小岩石碎片会堵塞移液器,使样品浆料的转移变得困难。
  14. 根据需要在-20°C下冷冻,并储存装有样品和珠子溶液的板,直到计划提取。

5. 板载方法比较

注:为了验证我们装载96孔DNA提取板的新方法,我们将单个96孔板分为三个部分。我们使用三种不同的板加载方法比较土壤意外装载和交叉污染的可能性。我们使用的三种方法是麦克弗森等人9中概述的方法、Qiagen的默认加载协议10,以及本出版物中概述的协议。

  1. 将土壤加载到板中
    1. 将 96 井板分成三个四柱块。使用上述三种方法之一加载每个块。
    2. 将土壤装载到其他井中,使样品和空白井交错。这种安排允许最大限度地利用意外样品装载和交叉污染的机会。
    3. 将96井板冷冻在-20°C,直到DNA提取。
  2. DNA提取
    1. 根据制造商的96井板提取协议10提取DNA。
    2. 将DNA提取物储存在-20°C,直到进一步分析。
  3. 空白井中DNA的定量
    1. 在室温下解冻DNA提取物,涡流,并使用板微调器向下旋转。
    2. 使用分光光度计测量和记录空白井的DNA浓度。
    3. 使用 ANVOA 和 Tukey 的后期测试来分析空白井中平均 DNA 浓度的差异。
      注:在 ± = 0.05 中报告了显著差异。

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结果

这种新方法成功地用于装载96孔DNA提取板。对板载荷方法的比较表明,该方法在空白井中DNA浓度最低。空白井中的DNA浓度明显低于我提出的McPherson 等人9(p<0.05)的方法,尽管我们方法中的DNA浓度与Qiagen默认方法(图2)没有统计学上的不同。所有三种方法产生的DNA均在2纳克/μL以下,尽管只有我们新方法生产出没有可测量DNA浓度的井。

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讨论

这种方法减少了在装载高通量样品提取板时实现井对井交叉污染的机会,并提供了一种更可控的方法,可以装载超过现有板装量策略9、10的96,。在96孔板提取中,井间污染比单管萃取更普遍,尤其是在自动6、7,7时,尽管没有在任何方法中进行过专门测试,但当提取板的油井在板装过程中保持打开状态时,...

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披露声明

提交人报告没有利益冲突,也没有什么可透露的。

致谢

这项研究得到了微生物生态合作组织的支持,NSF奖资助#EPS-1655726。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
18 oz WhirlPakNascoB01065
2 mL centrifuge tubesFisherbrand05-408-129
200 µL micro-PCR tubesThermo ScientificAB 2000
96-well PowerSoil DNA extraction kitQiagen12955-4We used a soil extraction kit but any 96-well format kit would work.
Ice block for 2 mL centrifuge tubesAnyAnyAny ice block made for 2 mL tubes will work
Ice block for 200 µL micro-PCR tubesAnyAnyAny ice block made for 200 µL tubes will work
Micro scoopulaAnyAny
Precut Pierceable Sealing FilmExcel ScientificXPS25
SpatulaAnyAny
Surgical scissorsAnyAny

参考文献

  1. Thompson, L. R., et al. A communal catalogue reveals Earth's multiscale microbial diversity. Nature. 551 (7681), 457-463 (2017).
  2. Davis, A., et al. Improved yield and accuracy for DNA extraction in microbiome studies with variation in microbial biomass. BioTechniques. 66 (6), 285-289 (2019).
  3. Marotz, C., et al. Triplicate PCR reactions for 16S rRNA gene amplicon sequencing are unnecessary. BioTechniques. 67 (1), 29-32 (2019).
  4. Romdhane, S., et al. Cover crop management practices rather than composition of cover crop mixtures affect bacterial communities in no-till agroecosystems. Frontiers in Microbiology. 10, 1618(2019).
  5. Rochefort, A., et al. Influence of environment and host plant genotype on the structure and diversity of the Brassica napus seed microbiota. Phytobiomes Journal. 3 (4), 326-336 (2019).
  6. Minich, J. J., et al. Quantifying and understanding well-to-well contamination in microbiome research. mSystems. 4 (4), 00186(2019).
  7. Walker, A. W. A lot on your plate? Well-to-well contamination as an additional confounder in microbiome sequence analyses. mSystems. 4 (4), 00362(2019).
  8. Eisenhofer, R., et al. Contamination in low microbial biomass microbiome studies: issues and recommendations. Trends in Microbiology. 27 (2), 105-117 (2019).
  9. McPherson, M. R., et al. Isolation and analysis of microbial communities in soil, rhizosphere, and roots in perennial grass Experiments. Journal of Visualized Experiments. (137), e57932(2018).
  10. Qiagen, D. N., et al. easy PowerSoil HTP 96 Kit Handbook. , Hilden, Germany. (2019).

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