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Method Article
目前装载 96 孔板进行 DNA 提取的方法容易受到污染。我们详细介绍了一种装载96孔板的新方法,该方法可降低井中交叉污染的风险。我们的方法将帮助其他研究人员利用高通量DNA提取技术的效率,并最大限度地降低污染风险。
高通量DNA测序技术极大地促进了我们对微生物群落之间的关系、宿主特性和更广泛的生态系统功能的理解。随着测序能力的广度和深度的迅速提高,人们以最高效率成功提取、放大、分析和解释环境DNA的方法。不幸的是,快速进行DNA提取可能会增加样品污染风险。特别是,与单管萃取相比,基于 96 井板中所含样品的高通量萃取提供了相对快速的方法,但也增加了井中交叉污染的机会。为了最大限度地降低样品交叉污染的风险,同时保留高通量萃取技术的好处,我们开发了一种将环境样品装入 96 孔板的新方法。我们使用可穿透的PCR密封膜覆盖每个板,同时加载样品,并首先将样品添加到PCR管,然后再将它们移动到井中;这些做法共同降低了样品漂移和意外双载井的风险。本文概述的方法为研究人员提供了一种方法,以最大限度地提高可用的高通量提取技术,同时降低96孔板固有的交叉污染风险。我们提供了如何从样品收集到DNA提取的详细分步概述,同时最大限度地降低不必要的交叉污染风险。
微生物群落高通量测序的最新进展提供了无与伦比的测序深度,因此,对地球微生物群1的功能和多样性有着前所未有的一瞥。随着将越来越多的样品多能复用到单个测序通道上的能力增加,单管DNA提取有可能成为生成生态数据中速率限制的步骤。然而,高通量DNA提取中的新方法有望以比之前更高的效率处理大量环境样品。这些方法通常涉及使用96孔板而不是单管,从而增加可能同时发生的萃取量。因此,高通量萃取方法的实用性和效率明显,已用于处理从土壤3、4,和植物组织,3、5到人类粪便2等环境样品。4
虽然这些方法可以显著加快样品处理和DNA提取的速度,但将土壤和其他生态样品装入96孔板的初始步骤容易受到交叉样品污染。这种类型的井井污染可能发生在DNA提取6,7,8,,8和井特别脆弱,在这第一步样品悬浮在缓冲溶液之前。6,McPherson等人演示了一种使用漏斗和8孔PCR带盖将土壤装入96孔板的方法,但是,虽然它们的方法是一种更可控的装载板的方法,但它仍然为装载每个样品时邻近井的污染提供了充足的机会。此外,开放式井允许分心的研究人员将样品放入不正确的井中,或将样本添加到已加载的井中。此外,各种样品类型证明不适合用这种方法加载;由于静电,湿样品通常粘在漏斗和干样品之间"跳跃"。
为了在高通量DNA提取的第一步减少油井污染的机会,我们开发了一种将土壤样品装入96孔板的新方法。我们的方法既保护油井免受环境暴露,又可防止我们意外地将多个样品装进一个油井(双装)。我们相信,下面报告的方法有望减少污染的可能性,因此提供了一种更可控的方法,用于加载96孔板,以便随后提取DNA。
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1. 用于装载 96 井板的实验室台和工具准备
2. 子取样和样品制备
3. 板准备
4. 子样本的转移
注:当土壤样本非常小时,请参阅步骤 4.13 进行修改。
5. 板载方法比较
注:为了验证我们装载96孔DNA提取板的新方法,我们将单个96孔板分为三个部分。我们使用三种不同的板加载方法比较土壤意外装载和交叉污染的可能性。我们使用的三种方法是麦克弗森等人9中概述的方法、Qiagen的默认加载协议10,以及本出版物中概述的协议。
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这种新方法成功地用于装载96孔DNA提取板。对板载荷方法的比较表明,该方法在空白井中DNA浓度最低。空白井中的DNA浓度明显低于我提出的McPherson 等人9(p<0.05)的方法,尽管我们方法中的DNA浓度与Qiagen默认方法(图2)没有统计学上的不同。所有三种方法产生的DNA均在2纳克/μL以下,尽管只有我们新方法生产出没有可测量DNA浓度的井。
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这种方法减少了在装载高通量样品提取板时实现井对井交叉污染的机会,并提供了一种更可控的方法,可以装载超过现有板装量策略9、10的96,孔板。在96孔板提取中,井间污染比单管萃取更普遍,尤其是在自动6、7,7时,尽管没有在任何方法中进行过专门测试,但当提取板的油井在板装过程中保持打开状态时,...
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提交人报告没有利益冲突,也没有什么可透露的。
这项研究得到了微生物生态合作组织的支持,NSF奖资助#EPS-1655726。
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Name | Company | Catalog Number | Comments |
18 oz WhirlPak | Nasco | B01065 | |
2 mL centrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-129 | |
200 µL micro-PCR tubes | Thermo Scientific | AB 2000 | |
96-well PowerSoil DNA extraction kit | Qiagen | 12955-4 | We used a soil extraction kit but any 96-well format kit would work. |
Ice block for 2 mL centrifuge tubes | Any | Any | Any ice block made for 2 mL tubes will work |
Ice block for 200 µL micro-PCR tubes | Any | Any | Any ice block made for 200 µL tubes will work |
Micro scoopula | Any | Any | |
Precut Pierceable Sealing Film | Excel Scientific | XPS25 | |
Spatula | Any | Any | |
Surgical scissors | Any | Any |
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