A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
שיטות נוכחיות לטעינת צלחות 96-באר עבור עקירות DNA יכול להיות נוטה זיהום. אנו מפרטים שיטה חדשה לטעינת צלחות 96-באר המפחיתה את הסיכון לזיהום צולב בין בארות. השיטה שלנו תסייע לחוקרים אחרים לנצל את היעילות של טכניקות חילוץ DNA בתפוקה גבוהה ולמזער את הסיכון לזיהום.
טכניקות רצף DNA בתפוקה גבוהה תרמו באופן משמעותי להתקדמות בהבנת מערכות היחסים שלנו בין קהילות מיקרוביאליות, מאפייני מארחים ופונקציות אקוסיסטם רחבות יותר. עם עלייה מהירה זו ברוחב ועומק של יכולות רצף הגיעו שיטות לחלץ, להגביר, לנתח ולפרש DNA סביבתי בהצלחה ביעילות מקסימלית. למרבה הצער, ביצוע עקירות DNA במהירות יכול לבוא במחיר של הגדלת הסיכון לזיהום בין דגימות. בפרט, עקירות בתפוקה גבוהה המבוססות על דגימות הכלולות בצלחת 96-באר מציעות שיטה מהירה יחסית, בהשוואה עקירות צינור יחיד, אבל גם להגדיל את ההזדמנויות עבור טוב לבאר זיהום צולב. כדי למזער את הסיכון לזיהום צולב בין דגימות, תוך שמירה על היתרונות של טכניקות חילוץ בתפוקה גבוהה, פיתחנו שיטה חדשה לטעינת דגימות סביבתיות לתוך צלחות 96 באר. השתמשנו בסרטי איטום PCR הניתנים לפינוק כדי לכסות כל צלחת תוך טעינת דגימות והוספנו דגימות תחילה לצינורות PCR לפני העברתן לבארות; יחד, שיטות אלה להפחית את הסיכון של סחיפה מדגם וטעינה כפולה לא מכוונת של בארות. השיטה המתוארת בנייר זה מספקת לחוקרים גישה למקסם את טכניקות החילוץ הזמינות בתפוקה גבוהה תוך הפחתת הסיכון לזיהום צולב הטבוע בצלחות של 96 בארות. אנו מספקים מתאר מפורט שלב אחר שלב של איך לעבור מאיסוף מדגם לחילוץ DNA תוך מזעור הסיכון של זיהום צולב לא רצוי.
ההתפתחויות האחרונות בהקפת תפוקה גבוהה של קהילות מיקרוביאליות מספקות עומק רצף שאין שני לו, וכתוצאה מכך, הצצה לא מנומקת לתפקוד ולמגוון של המיקרוביום1 של כדור הארץ. ככל שהיכולת לדגום יותר ויותר דגימות על נתיב רצף יחיד גדלה, חילוץ DNA צינור יחיד יש פוטנציאל להפוך צעד הגבלת קצב בדור של נתונים אקולוגיים. עם זאת, שיטות חדשות בתפוקה גבוהה עקירות DNA להחזיק הבטחה לעיבוד כמויות גדולות של דגימות סביבתיות עם יעילות רבה יותר מאשר בעבר היה אפשרי2. שיטות אלה כרוכות לעתים קרובות באמצעות 96-באר צלחות במקום חד צינוריות, ובכך להגדיל את המספר האפשרי של עקירות שיכולות להתרחש בו זמנית. בתור שכזה, המעשיות והיעילות של שיטות חילוץ בתפוקה גבוהה ניכרות ומיושמות לעיבוד דגימות סביבתיות החלקרקע 3,,4 ורקמות צמח3,,5 כדי חומר צואתי אנושי2.
בעוד שיטות אלה יכול להאיץ באופן דרמטי לאורך עיבוד מדגם וחילוץ DNA, השלב הראשוני של טעינת קרקע ודגימות אקולוגיות אחרות לתוך 96-באר צלחות הוא רגיש זיהום חוצה דגימות. סוג זה של זיהום טוב יכול להתרחשבמהלךעקירות DNA 6,7,8 , בארות פגיעותבמיוחדבשלב הראשון זה לפני דגימות מושהות בתמיסת חיץ. McPherson ואח'9 להפגין שיטה לטעון קרקעות rhizosphere לתוך 96-גם צלחות באמצעות משפך ו8-well כיסויים רצועת PCR, אבל בעוד השיטה שלהם היא גישה מבוקרת יותר לטעינת צלחות, זה עדיין מספק הזדמנות מספיקה לזיהום של בארות שכנות בעת טעינת כל מדגם. בנוסף, בארות פתוחות לאפשר את ההזדמנות עבור חוקר מוסח למקם דגימה לתוך הבאר הלא נכונה או להוסיף דגימה לתוך באר שכבר נטען. בנוסף, מגוון סוגי דגימות להוכיח להיות לא מתאים לטעינה עם שיטה זו; דגימות רטובות לעתים קרובות להיצמד משפך ודגימות יבש 'לקפוץ' בין בארות בשל חשמל סטטי.
כדי להפחית את ההזדמנויות לזיהום בין בארות בשלב הראשון של עקירות DNA בתפוקה גבוהה, פיתחנו גישה חדשה להעמסת דגימות קרקע לתוך צלחות 96-באר. השיטות שלנו מגנות על בארות מפני חשיפה סביבתית ומונעות מאיתנו לטעון בטעות דגימות מרובות לבאר אחת (טעינה כפולה). אנו מאמינים השיטה שדווחה להלן מבטיח להפחית את הפוטנציאל לזיהום ולכן מספק אמצעי מבוקר יותר לטעון 96-well צלחות עבור הפקת DNA עוקבות.
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
1. ספסל מעבדה והכנת כלי להעמסת צלחת 96 באר
2. הכנת דגימה משנה ודגימה
3. הכנת צלחת
4. העברת תת-דגימות
הערה: ראה שלב 4.13 לשינויים כאשר דגימת הקרקע קטנה מאוד.
5. השוואה של שיטות טעינת לוחות
הערה: על מנת לאמת את השיטה החדשן שלנו לטעינת לוחות חילוץ DNA 96-באר, חילקנו צלחת אחת 96-באר לשלושה חלקים. השתמשנו בשלוש שיטות שונות של טעינת צלחת כדי להשוות פוטנציאל לטעינה לא מכוונת של אדמה וזיהום צולב. שלוש השיטות שבהן השתמשנו היו השיטות המתוארות במקפירסון ואח'9, פרוטוקול הטעינה המוגדר כברירת מחדל של Qiagen10, והפרוטוקול שאנו מתארים בפרסום זה.
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
שיטה חדשנית זו שימשה בהצלחה כדי לטעון 96-well חילוץ לוחות. השוואה בין שיטות טעינת לוחות הראתה את השיטה שלנו שיש ריכוז ה-DNA הנמוך ביותר בארות ריקות. ריכוז ה-DNA בארות הריקות היה נמוך משמעותית מהשיטה המוצעת מקפירסון ואח'שלי (p < 0.05), אם כי ריכוזי ה-DNA בשיטה שלנו לא היו שונים סטטיסטית משיט?...
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
שיטה זו מפחיתה הזדמנויות לזיהום צולב היטב תוך טעינת לוחות חילוץ מדגם בתפוקה גבוהה ומציעה אמצעי מבוקר יותר לטעון 96-well צלחות מעבר אסטרטגיות טעינתצלחת קיימות 9,10. זיהום בין בארות יכול להיות מתפשט יותר בחילוץ צלחת 96-גם מאשר בעיות צינור יחיד, במיוחד כאשר
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
המחברים מדווחים שאין ניגודי עניינים ואין להם מה לחשוף.
מחקר זה נתמך על ידי המיקרוביאלית אקולוגיה שיתוף פעולה עם מימון מNSF פרס #EPS-1655726.
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
18 oz WhirlPak | Nasco | B01065 | |
2 mL centrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-129 | |
200 µL micro-PCR tubes | Thermo Scientific | AB 2000 | |
96-well PowerSoil DNA extraction kit | Qiagen | 12955-4 | We used a soil extraction kit but any 96-well format kit would work. |
Ice block for 2 mL centrifuge tubes | Any | Any | Any ice block made for 2 mL tubes will work |
Ice block for 200 µL micro-PCR tubes | Any | Any | Any ice block made for 200 µL tubes will work |
Micro scoopula | Any | Any | |
Precut Pierceable Sealing Film | Excel Scientific | XPS25 | |
Spatula | Any | Any | |
Surgical scissors | Any | Any |
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved