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Method Article
Aktuelle Methoden zum Beladen von 96-Well-Platten für DNA-Extraktionen können anfällig für Verunreinigungen sein. Wir beschreiben eine neue Methode zum Beladen von 96-Well-Platten, die das Risiko einer Kreuzkontamination zwischen Brunnen reduziert. Unsere Methode wird anderen Forschern helfen, von der Effizienz von DNA-Extraktionstechniken mit hohem Durchsatz zu profitieren und das Risiko einer Kontamination zu minimieren.
DNA-Sequenzierungstechniken mit hohem Durchsatz haben wesentlich zu Fortschritten in unserem Verständnis von Beziehungen zwischen mikrobiellen Gemeinschaften, Host-Eigenschaften und breiteren Ökosystemfunktionen beigetragen. Mit dieser raschen Zunahme der Breite und Tiefe der Sequenzierung sequencing Fähigkeiten haben Methoden zu extrahieren, zu verstärken, analysieren, und interpretieren Umwelt-DNA erfolgreich mit maximaler Effizienz. Leider kann die schnelle Durchführung von DNA-Extraktionen auf Kosten der Erhöhung des Kontaminationsrisikos unter den Proben gehen. Insbesondere Hochdurchsatzextraktionen, die auf Proben basieren, die in einer 96-Well-Platte enthalten sind, bieten im Vergleich zu Einrohrextraktionen eine relativ schnelle Methode, erhöhen aber auch die Möglichkeiten für eine gut zu-gut-kreuz-Kontamination. Um das Risiko einer Kreuzkontamination zwischen Proben zu minimieren und gleichzeitig die Vorteile von Extraktionstechniken mit hohem Durchsatz beizubehalten, haben wir eine neue Methode entwickelt, um Umweltproben in 96-Well-Platten zu laden. Wir verwendeten durchbohrbare PCR-Dichtungsfolien, um jede Platte während des Ladens von Proben abzudecken, und fügten Proben zuerst zu PCR-Röhren hinzu, bevor wir sie in Brunnen bewegten; Zusammen reduzieren diese Praktiken das Risiko von Probendrift und unbeabsichtigter Doppelbelastung von Brunnen. Die in diesem Papier beschriebene Methode bietet Forschern einen Ansatz zur Maximierung der verfügbaren Extraktionstechniken mit hohem Durchsatz bei gleichzeitiger Verringerung des Risikos einer Kreuzkontamination, die 96-Well-Platten innewohnt. Wir bieten einen detaillierten Schritt für Schritt, wie man von der Probenentnahme zur DNA-Extraktion übergeht und gleichzeitig das Risiko einer unerwünschten Kreuzkontamination minimiert.
Die jüngsten Fortschritte bei der Hochdurchsatzsequenzierung mikrobieller Gemeinschaften bieten eine unvergleichliche Sequenzierungstiefe und damit einen beispiellosen Einblick in das Funktionieren und die Vielfalt des Erdmikrobioms1. Da die Fähigkeit, immer mehr Proben auf eine einzige Sequenzierungsspur zu multiplen, zunimmt, hat die DNA-Extraktion von Einzelrohren das Potenzial, ein ratenbegrenzender Schritt bei der Generierung ökologischer Daten zu werden. Neue Methoden in DNA-Extraktionen mit hohem Durchsatz versprechen jedoch die Verarbeitung großer Mengen von Umweltproben mit größerer Effizienz als bisher möglich2. Bei diesen Methoden werden häufig 96-Well-Platten anstelle von Einrohren verwendet, wodurch die mögliche Anzahl von Extraktionen erhöht wird, die gleichzeitig auftreten können. Als solche sind die Praktikabilität und Effizienz von Hochdurchsatzextraktionsmethoden offensichtlich und wurden für die Verarbeitung von Umweltproben von Boden3,4 und Pflanzengewebe3,5 bis zu menschlichen Fäkalien2umgesetzt.
Während diese Methoden die Probenverarbeitung und DNA-Extraktion dramatisch beschleunigen können, ist der erste Schritt der Beladung von Boden und anderen ökologischen Proben in 96-Well-Platten anfällig für kreuzprobenübergreifende Kontamination. Diese Art der Brunnenkontamination kann während der DNA-Extraktionen6,7,8und Brunnen in diesem ersten Schritt besonders anfällig sein, bevor Proben in einer Pufferlösung suspendiert werden. McPherson et al.9 demonstrieren eine Methode, um Rhizosphärenböden mit Trichtern und 8-Well-PCR-Streifenabdeckungen in 96-Well-Platten zu laden, aber obwohl ihre Methode ein kontrollierterer Ansatz zum Beladen von Platten ist, bietet sie dennoch reichlich Gelegenheit zur Kontamination benachbarter Brunnen beim Laden jeder Probe. Darüber hinaus ermöglichen die offenen Brunnen einem abgelenkten Forscher die Möglichkeit, eine Probe in den falschen Brunnen zu legen oder eine Probe in einen Brunnen zu geben, der bereits geladen wurde. Darüber hinaus erweisen sich eine Vielzahl von Probentypen als ungeeignet für die Beladung mit diesem Verfahren; Nassproben kleben oft an den Trichtern und trockenen Proben "springen" zwischen Brunnen aufgrund statischer Elektrizität.
Um die Kontaminationsmöglichkeiten zwischen Brunnen im ersten Schritt der DNA-Extraktion mit hohem Durchsatz zu verringern, haben wir einen neuen Ansatz entwickelt, um Bodenproben in 96-Well-Platten zu verladen. Unsere Methoden schützen Brunnen vor Umweltbelastungen und verhindern, dass wir versehentlich mehrere Proben in einen Brunnen laden (Doppelbelastung). Wir glauben, dass die unten beschriebene Methode verspricht, das Kontaminationspotenzial zu verringern und als solches eine kontrolliertere Möglichkeit bietet, 96-Well-Platten für die nachfolgende DNA-Extraktion zu laden.
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1. Laborbank und Werkzeugvorbereitung zum Beladen einer 96-Well-Platte
2. Unterprobe und Probenvorbereitung
3. Plattenvorbereitung
4. Übertragung von Unterproben
HINWEIS: Siehe Schritt 4.13 für Änderungen, wenn die Bodenprobe sehr klein ist.
5. Vergleich der Plattenlademethoden
HINWEIS: Um unsere neuartige Methode zur Beladung von 96-Well-DNA-Extraktionsplatten zu überprüfen, haben wir eine einzelne 96-Well-Platte in drei Abschnitte unterteilt. Wir verwendeten drei verschiedene Methoden der Plattenbeladung, um das Potenzial für unbeabsichtigte Verschmutzung von Boden und Kreuzkontamination zu vergleichen. Die drei Methoden, die wir verwendeten, waren die Methoden, die in McPherson et al.9beschrieben wurden, Qiagens Standardladeprotokoll10, und das Protokoll, das wir in dieser Publikation skizzieren.
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Diese neuartige Methode wurde erfolgreich verwendet, um 96-Well-DNA-Extraktionsplatten zu laden. Der Vergleich der Plattenlademethoden zeigte, dass unsere Methode die niedrigste DNA-Konzentration in den Rohbrunnen aufweist. Die DNA-Konzentration in den Rohbrunnen war signifikant niedriger als die vorgeschlagene Methode mein McPherson et al.9 (p < 0,05), obwohl sich die DNA-Konzentrationen in unserer Methode statistisch nicht von der Qiagen-Standardmethode unterschieden (Abbild...
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Diese Methode reduziert die Möglichkeiten für eine gut zu-gut-kreuz-Kontamination beim Laden von Probenextraktionsplatten mit hohem Durchsatz und bietet eine kontrolliertere Möglichkeit, 96-Well-Platten über bestehende Plattenbelastungsstrategien9,10hinaus zu laden. Die Kontamination unter Brunnen kann bei 96-Well-Plattenextraktionen stärker ausgeprägt sein als bei Einrohrextraktionen, insbesondere bei automatisierten6,,
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Die Autoren berichten von keinen Interessenkonflikten und haben nichts zu verraten.
Diese Forschung wurde vom Microbial Ecology Collaborative mit Einer Förderung des NSF-Preises #EPS-1655726 unterstützt.
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Name | Company | Catalog Number | Comments |
18 oz WhirlPak | Nasco | B01065 | |
2 mL centrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-129 | |
200 µL micro-PCR tubes | Thermo Scientific | AB 2000 | |
96-well PowerSoil DNA extraction kit | Qiagen | 12955-4 | We used a soil extraction kit but any 96-well format kit would work. |
Ice block for 2 mL centrifuge tubes | Any | Any | Any ice block made for 2 mL tubes will work |
Ice block for 200 µL micro-PCR tubes | Any | Any | Any ice block made for 200 µL tubes will work |
Micro scoopula | Any | Any | |
Precut Pierceable Sealing Film | Excel Scientific | XPS25 | |
Spatula | Any | Any | |
Surgical scissors | Any | Any |
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