고처리량 DNA 추출 플레이트의 로딩을 위한 수정된 방법은 오염 가능성을 감소시니다.

요약

DNA 추출을 위한 96웰 플레이트를 적재하는 현재의 방법은 오염되기 쉽습니다. 우리는 우물 중 교차 오염의 위험을 감소 96 웰 플레이트를로드하기위한 새로운 방법을 자세히 설명합니다. 우리의 방법은 다른 연구자들이 고처리량 DNA 추출 기술의 효율성을 활용하고 오염 위험을 최소화하는 데 도움이 될 것입니다.

초록

높은 처리량 DNA 염기서열 분석 기술은 미생물 지역 사회, 호스트 특성 및 광범위한 생태계 기능 간의 관계에 대한 이해의 발전에 실질적으로 기여했습니다. 이러한 급속한 폭과 시퀀싱 기능이 급격히 증가함에 따라 최대 효율로 환경 DNA를 추출, 증폭, 분석 및 해석하는 방법이 왔습니다. 불행히도, DNA 추출을 신속하게 수행하는 것은 샘플 중 오염 위험을 증가시켜야 할 수 있습니다. 특히, 96웰 플레이트에 포함된 샘플을 기반으로 하는 고처리량 추출은 단일 튜브 추출에 비해 비교적 빠른 방법을 제공하지만 잘 교차 오염을 위한 기회도 증가합니다. 시료 간 교차 오염 위험을 최소화하기 위해 고처리량 추출 기술의 이점을 유지하면서 환경 샘플을 96웰 플레이트에 적재하는 새로운 방법을 개발했습니다. 우리는 샘플을로드하는 동안 각 플레이트를 커버하기 위해 피어싱 식 PCR 밀봉 필름을 사용하고 우물로 이동하기 전에 PCR 튜브에 먼저 샘플을 추가했습니다. 이러한 관행은 함께 샘플 드리프트및 의도하지 않은 이중 유정 의 위험을 줄입니다. 이 논문에 설명된 방법은 연구원들에게 96웰 플레이트에 내재된 교차 오염 위험을 줄이면서 사용 가능한 고처리량 추출 기술을 극대화하는 방법을 제공합니다. 우리는 원치 않는 교차 오염의 위험을 최소화하면서 샘플 수집에서 DNA 추출로 이동하는 방법에 대한 자세한 단계를 제공합니다.

서문

미생물 공동체의 고처리량 시퀀싱의 최근 발전은 비교할 수 없는 시퀀싱 깊이를 제공하고 있으며, 결과적으로 지구의 미생물군유전체^1의기능과 다양성을 엿볼 수 있습니다. 단일 시퀀싱 레인에 점점 더 많은 샘플을 멀티플렉스하는 능력이 증가함에 따라 단일 튜브 DNA 추출은 생태 데이터 생성에서 속도 제한 단계가 될 가능성이 있습니다. 그러나, 고처리량 DNA 추출의 새로운 방법은 이전에 가능했던 것보다 더 큰 효율을 가진 다량의 환경 샘플을 처리하기위한 약속을^보유2. 이러한 방법은 종종 단일 튜브 대신 96 웰 플레이트를 사용하여 동시에 발생할 수있는 추출 수를 증가시키는 것을 포함합니다. 이와 같이, 고처리량 추출 방법의 실용성과 효율이 분명하고 토양^3,4 및 식물 조직^33,5에서 인간의 배설물^{물질 2에}이르기까지 환경 샘플의 처리를 위해 구현되었다.^,

이러한 방법은 시료 처리 및 DNA 추출을 따라 극적으로 속도를 낼 수 있지만 토양 및 기타 생태 샘플을 96웰 플레이트로 적재하는 초기 단계는 교차 시료 오염에 취약합니다. 이러한 유형의 잘 오염은 DNA 추출^6,7,7,8동안 발생할 수 있으며, 우물은 이 첫 번째 단계에서 특히 취약하여 샘플이 완충액에서 일시 중단됩니다. McPherson^{외. 9는} 깔때기와 8 웰 PCR 스트립 커버를 사용하여 96 웰 플레이트에 뿌리 권구 토양을 적재하는 방법을 보여 주지만, 그 방법은 플레이트를 적재하는 보다 통제된 접근 방식이지만, 각 시료를 적재할 때 주변 우물의 오염을 위한 충분한 기회를 제공한다. 또한, 오픈 웰은 산만 한 연구원이 잘못된 우물에 샘플을 배치하거나 이미로드 된 우물에 샘플을 추가 할 수있는 기회를 허용합니다. 또한 다양한 샘플 유형이 이 방법으로 로딩에 적합하지 않은 것으로 판명되었습니다. 젖은 샘플은 종종 정전기로 인해 우물 사이에 깔때기와 건조 샘플 '점프'에 충실합니다.

고처리량 DNA 추출의 첫 번째 단계에서 우물 간 오염 기회를 줄이기 위해 토양 샘플을 96웰 플레이트로 적재하는 새로운 접근법을 개발했습니다. 우리의 방법은 모두 환경 노출로부터 우물을 보호하고 실수로 여러 샘플을 하나의 우물 (이중 로딩)에적재하지 못하게합니다. 우리는 아래에 보고된 방법이 오염가능성을 감소시키는 것을 약속하고 그 같은 후속 DNA 추출을 위한 96 웰 플레이트를 적재하는 더 통제된 수단을 제공한다는 것을 믿습니다.

프로토콜

1. 실험실 벤치 및 96 웰 플레이트를적재딩하기 위한 공구 준비

1. 70%에탄올로 미스티로 벤치 탑을 클리어합니다. 10% 표백제로 벤치 탑을 뿌리기 전에 공기를 닦고 건조시키십시오. 벤치 탑을 말리십시오.
2. 마이크로 스쿠뮬라, 주걱 및 외과 가위 (곡선)를 95 %에탄올에 담근 다음 화염에 노출하여 살균하십시오. 각 10%의 표백제에 담그고 사용하기 전에 공기 건조를 허용합니다.
   참고: 각 샘플 간에 도구를 소독해야 합니다.

2. 하위 샘플링 및 샘플 준비

1. 서브 샘플링 전에 에탄올을 사용하여 장갑을 살균하십시오.
2. 하위 샘플링 전에 토양 샘플을 균질화합니다.
3. 멸균 도구를 사용하여 라벨이 부착된 2mL 원심분리기 튜브를 샘플로 적재하여 약 절반까지 충전할 수 있습니다.
4. 모든 95개의 샘플이 라벨이 부착된 2mL 원심분리기 튜브로 하위 샘플링될 때까지 2.2를 반복합니다. 96^th 우물추출 공백으로 사용되어야 합니다.
   참고: 2.3 단계와 2.4단계는 필요한 저장 공간을 최소화하고 오버 또는 이중 샘플링을 방지하기 위해 수행됩니다.
5. 플레이트를 적재할 때까지 2mL 서브 샘플 튜브를 얼음에 보관하십시오.
6. 라벨 96 멸균 200 μL 플랫 캡 PCR 튜브 A1\u2012A12, B1\u2012B12, .... H1\u2012H12. 이 튜브를 96웰 랙에 넣습니다.
7. 위치가 좋은 샘플 ID(A1\u2012H12)를 지정하고 기록합니다.

3. 플레이트 준비

1. 96웰플레이트(그림 1A-1C)에서고무 커버를 분리하여 멸균 비닐 봉지에 넣습니다(재료표참조). 오염을 방지하기 위해 비닐 봉지를 밀봉하십시오.
2. 밀봉 필름으로 96웰 플레이트를덮습니다(그림 1D-1E); 예를 들어, 사전 절단 피어싱 가능한 밀봉 필름을 사용합니다(재료표참조). 고무 롤러로 롤링하여 밀봉을 보장합니다.
   참고: 피어싱 가능한 실리콘 매트는 사용 간에 적절한 세척을 제공하는 재사용 가능한 옵션을 제공할 수 있지만, 우리가 쉽게 피어싱을 따라 분할테스트한 실리콘 매트는 다음 플레이트에 동등한 보호를 제공하지 않습니다.
3. 냉장고 (4 °C)에 접시를 놓고 시원함을 유지합니다.

4. 하위 샘플 의 전송

참고: 토양 샘플이 매우 작은 경우 수정을 위한 4.13 단계를 참조하십시오.

1. 2mL 하위 샘플 중 24개샘플을 얼음 블록에 넣고 냉장 보관합니다.
2. 샘플 이름과 위치 시트를 사용하여 올바른 200 μL 플랫 캡 PCR 튜브를 선택합니다.
3. 균질화를 보장하기 위해 ~ 5 s에 대한 2 mL 하위 샘플 튜브와 소용돌이를 가져 가라.
4. 화염 및 표백제 살균 도구를 사용하여 올바른 평면 캡 PCR 튜브(도 1F)에첫 번째 샘플의 ~ 200 μL을로드합니다.
5. 모든 24개의 샘플이 로드될 때까지 4.2\u20124.4단계를 반복합니다. 그런 다음 4.6 단계로 이동합니다.
6. 표백제 담근 종이 닦아를 사용하여 200 μL 평면 캡 PCR 튜브의 외부를 청소하십시오.
7. 튜브를 반전시키고 벤치를 탭하여 샘플을 튜브 위로 이동합니다. 표백 및 화염 멸균 가위를 사용하여 PCR 튜브의 바닥을 잘라 96 웰 플레이트(도 1G)에빠질 수있는 시료를 만듭니다.
8. 96웰 플레이트에서 올바른 것을 찾아 서 잘 도달할 때까지 잘라낸 끝이 있는 플레이트를 가로질러 튜브를 통과합니다. 플레이트를 약간 기울여 미리 절단된 피어싱 식 밀봉 필름의 구멍을 용이하게 하고 튜브가 올바른 바로 위에 있을 때만 잘 뒤집어 잘라낸 팁이 잘 들어갑니다. 살균 도구를 사용하여 모든 토양이 튜브에서 우물로 떨어질 때까지 PCR 튜브의 상단을 누릅니다. 뚜껑이 닫혀 있는 우물 안에 튜브를 둡니다(그림1H-1J).
9. 한 번에 하나의 평면 캡 200 μL PCR 튜브를 제거하고 잘 비드 용액750 μL을 추가(그림 1K). 200 μL 플랫 캡 PCR 튜브를 끝까지 우물로 밀어 넣고 상단을 날카로운 것으로 표시하여 이 우물이 로드되었음을 나타냅니다. 각 샘플에 대해 이 작업을 반복합니다.
10. 24개의 시료가 모두 적재되고 비드 용액이 추가되면 2mL 하위 샘플 튜브를 제거하고 24개의 비샘플링 튜브로 교체하십시오.
11. 모든 95 개의 우물이 샘플 또는 빈 및 비드 솔루션으로로드 될 때까지 4.1\u20124.10 단계를 반복하십시오. 열린 우물 위에 전달하지 않고 튜브를 제거합니다(그림1L).
12. 조심스럽게 관통 필름을 제거하고 추출(그림 1M-1O)까지플레이트를 보호하기 위해 고무 커버를 교체합니다.
13. 또한 세분화 된 토양의 매우 작은 양의 경우, 샘플 튜브에 비드 용액의 750 μL을 추가하고 적절한 우물에 모든 내용을 전송하는 넓은 보어 파이펫 팁을 사용합니다. PCR 튜브를 개구부에 배치하여 이중 로딩을 방지합니다.
    참고: 파이펫 팁의 보어보다 큰 미립자 유기물 또는 작은 암석 조각으로 이 수정을 구현할 때 파이펫을 막고 시료 슬러리의 전달을 어렵게 만들 수 있습니다.
14. 필요에 따라 -20°C에서 동결하고 계획 추출될 때까지 시료및 비드 용액이 적재된 플레이트를 저장합니다.

5. 플레이트 로딩 방법의 비교

참고 : 96 웰 DNA 추출 플레이트의 로딩에 대한 우리의 새로운 방법을 확인하기 위해, 우리는 세 섹션으로 하나의 96 웰 플레이트를 분할. 우리는 토양과 교차 오염의 의도하지 않은 적재 가능성을 비교하기 위해 판 로딩의 세 가지 다른 방법을 사용했다. 우리가 사용한 세 가지 방법은 McPherson 외^9,Qiagen의 기본 로딩 프로토콜¹⁰및 이 출판물에서 설명하는 프로토콜에 설명된 메서드였습니다.

1. 접시에 토양을 적재
   1. 96웰 플레이트를 3개의 4열 블록으로 섹션화합니다. 위에서 언급한 세 가지 방법 중 하나를 사용하여 각 블록을 로드합니다.
   2. 토양을 다른 모든 우물에 적재하여 샘플과 빈 우물이 비틀거리게 됩니다. 이 배열을 통해 부주의한 시료 적재 및 교차 오염에 대한 최대 기회를 허용합니다.
   3. DNA 추출될 때까지 -20°C에서 96웰 플레이트를 동결합니다.
2. DNA 추출
   1. 제조업체의 96웰 플레이트 추출^{프로토콜(10)에}따라 DNA를 추출한다.
   2. DNA 추출물을 추가 분석할 때까지 -20°C에 저장합니다.
3. 빈 우물에서 DNA의 정량화
   1. 실온, 소용돌이에서 DNA 추출물을 해동하고 플레이트 스피너를 사용하여 아래로 회전합니다.
   2. 분광광계를 사용하여 빈 우물의 DNA 농도를 측정하고 기록합니다.
   3. ANVOA와 Tukey의 포스트 혹 후 테스트를 사용하여 빈 우물의 평균 DNA 농도의 차이를 분석하십시오.
      참고: α = 0.05에서 상당한 차이가 보고되었습니다.

결과

이 새로운 방법은 96웰 의 DNA 추출 플레이트를 로드하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 플레이트 로딩 방법의 비교는 빈 우물에서 가장 낮은 DNA 농도를 갖는 우리의 방법을 보여 주었다. 빈 우물의 DNA 농도는 내 맥퍼슨 외⁹ (p< 0.05)를 제안한 방법보다 현저히 낮았지만, 우리의 방법의 DNA 농도는 Qiagen 기본 방법(도 2)과통계적으로 다르지 않았다. 생성된 세 ...

토론

이 방법은 높은 처리량 샘플 추출 플레이트를 적재하는 동안 잘 교차 오염에 대한 기회를 줄이고 기존 플레이트 로딩 전략^9,,10을넘어 96 웰 플레이트를 로드하는 보다 제어된 수단을 제공한다. 우물 간의 오염은 단일 튜브 추출보다 96웰 의 플레이트 추출에 더 널리 퍼질 수 있으며, 특히^{자동화된 6,,7의}경우, 어...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 oz WhirlPak	Nasco	B01065
2 mL centrifuge tubes	Fisherbrand	05-408-129
200 µL micro-PCR tubes	Thermo Scientific	AB 2000
96-well PowerSoil DNA extraction kit	Qiagen	12955-4	We used a soil extraction kit but any 96-well format kit would work.
Ice block for 2 mL centrifuge tubes	Any	Any	Any ice block made for 2 mL tubes will work
Ice block for 200 µL micro-PCR tubes	Any	Any	Any ice block made for 200 µL tubes will work
Micro scoopula	Any	Any
Precut Pierceable Sealing Film	Excel Scientific	XPS25
Spatula	Any	Any
Surgical scissors	Any	Any