Yüksek İşlemli DNA Çıkarma Plakalarının Yüklenmesinde Modifiye Yöntemler Kontaminasyon Potansiyelini Azaltır

Özet

DNA ekstraksiyonları için 96 kuyulu plakayükleme için mevcut yöntemler kontaminasyona yatkın olabilir. Kuyular arasında çapraz kontaminasyon riskini azaltan 96 kuyulu plakaların yüklenmesi için yeni bir yöntem ayrıntılı olarak inceleniyoruz. Yöntemimiz, diğer araştırmacıların yüksek verimli DNA çıkarma tekniklerinin verimliliğinden yararlanmalarına ve kontaminasyon riskini en aza indirmelerine yardımcı olacaktır.

Özet

Yüksek verimli DNA dizileme teknikleri mikrobiyal topluluklar, ev sahibi özellikleri ve daha geniş ekosistem fonksiyonları arasındaki ilişkileri anlamamızda önemli ölçüde katkıda bulunmuştur. Genişlik ve sıralama yetenekleri derinliği bu hızlı artış ile ayıklamak için yöntemler geldi, yükseltmek, analiz etmek, ve maksimum verimlilik ile başarılı bir şekilde çevresel DNA yorumlamak. Ne yazık ki, hızlı bir şekilde DNA çıkarma gerçekleştirme örnekleri arasında kontaminasyon riskini artırma pahasına gelebilir. Özellikle, 96 kuyulu bir plakada bulunan numunelere dayanan yüksek iş çıkarmalar, tek tüplü ekstraksiyonlara kıyasla nispeten hızlı bir yöntem sunmakla birlikte, iyiye çapraz kontaminasyon olanaklarını da artırır. Numuneler arasında çapraz kontaminasyon riskini en aza indirmek için, yüksek iş hacmi çıkarma tekniklerinin avantajlarını korurken, çevresel numuneleri 96 kuyulu plakalara yüklemek için yeni bir yöntem geliştirdik. Numuneleri yüklerken her plakayı kapsayacak şekilde delilebilir PCR sızdırmazlık filmlerini kullandık ve numuneleri kuyulara taşımadan önce PCR tüplere ekledik; birlikte, bu uygulamalar örnek sürüklenme ve kuyuların istenmeyen çift yükleme riskini azaltır. Bu makalede özetlenen yöntem, araştırmacılara mevcut yüksek iş gücü çıkarma tekniklerini en üst düzeye çıkarma yaklaşımı sağlarken, 96 kuyulu plakalara doğal çapraz kontaminasyon riskini de azaltır. İstenmeyen çapraz kontaminasyon riskini en aza indirirken örnek toplamadan DNA çıkarmasına nasıl geçebileceğimize dair adım adım ayrıntılı bir adım sayılmayı sağlıyoruz.

Giriş

Mikrobiyal toplulukların yüksek iş bölümü ndeki son gelişmeler benzersiz sıralama derinliği ve sonuç olarak, Dünya'nın mikrobiyom^1'inişleyişi ne ve çeşitliliğine emsalsiz bir bakış sağlamaktadır. Tek bir sıralama şeridine daha fazla numune katlandırma yeteneği arttıkça, tek tüpLÜ DNA çıkarma, ekolojik veri üretiminde hız sınırlayıcı bir adım olma potansiyeline sahiptir. Ancak, yüksek verimli DNA ekstraksiyonları yeni yöntemler daha önce mümkün olandan daha fazla verimlilik ile çevresel örneklerin büyük miktarlarda işlenmesi için söz tutun². Bu yöntemler genellikle tek tüpler yerine 96-iyi plakalar kullanarak, bu nedenle aynı anda oluşabilir ekstraksiyon olası sayısını artırarak içerir. Bu nedenle, yüksek verimli çıkarma yöntemlerinin pratikliği ve verimliliği belirgindir ve toprak^3,,4 ve bitki dokularından^3,,5'e, insan dışkı madde^2'yekadar değişen çevresel örneklerin işlenmesi için uygulanmıştır.

Bu yöntemler numune işleme ve DNA çıkarma boyunca önemli ölçüde hız alabilse de, toprak ve diğer ekolojik numuneleri 96 kuyulu plakalara yüklemenin ilk adımı çapraz numune kontaminasyonuna karşı hassastır. Dna ekstraksiyonu sırasında iyi-to-well kontaminasyon Bu tür^{oluşabilir 6,7,8}, ve kuyular örnekler bir tampon çözeltisi askıya önce bu ilk adımda özellikle savunmasızdır. McPherson ve ark.⁹ huniler ve 8-iyi PCR şerit kapakları kullanarak 96-iyi plakalar içine rizosfer toprak yüklemek için bir yöntem göstermek, ancak onların yöntemi yükleme plakaları için daha kontrollü bir yaklaşım olsa da, hala her örnek yükleme komşu kuyuların kirlenmesi için yeterli fırsat sağlar. Ayrıca, açık kuyular, dikkati dağılmış bir araştırmacının yanlış kuyuya bir örnek yerleştirmesine veya zaten yüklenmiş bir kuyuya numune eklemesine olanak sağlar. Buna ek olarak, çeşitli örnek türleri bu yöntemle yükleme için uygun olmadığını kanıtlamaktadır; ıslak numuneler genellikle hunilere yapışır ve kuru numuneler statik elektrik nedeniyle kuyular arasında 'atlatır'.

Yüksek iş türündeki DNA çıkarmalarının ilk adımında kuyular arasında kontaminasyon olanaklarını azaltmak için, toprak örneklerini 96 kuyulu plakalara yüklemek için yeni bir yaklaşım geliştirdik. Yöntemlerimiz hem kuyuları çevreye maruz kalmaktan korur hem de yanlışlıkla birden fazla numuneyi tek bir kuyuya yüklememizi engeller (çift yükleme). Aşağıda bildirilen yöntemin kontaminasyon potansiyelini azaltma sözü verdiğine ve bu nedenle sonraki DNA ekstraksiyonu için 96 kuyuluk plakaları yüklemek için daha kontrollü bir araç sağladığına inanıyoruz.

Protokol

1. 96 kuyulu bir plakanın yüklenmesi için laboratuvar tezgahı ve takım hazırlığı

1. % 70 etanol ile sisleme tarafından tezgah üst temizleyin. % 10 çamaşır suyu ile tezgah üst püskürtme önce silin ve hava kuru izin. Tezgahın üstlerini kurutun.
2. Mikro-scoopula sterilize, spatula, ve cerrahi makas (kavisli) daldırma tarafından 95% etanol ve daha sonra bir alev maruz. Her biri %10 çamaşır suyu daldırın ve kullanmadan önce havanın kurumasını bekleyin.
   NOT: Araçlar her numune arasında sterilize edilmelidir.

2. Alt örnekleme ve numune hazırlama

1. Alt örnekleme den önce etanol kullanarak eldivenleri sterilize edin.
2. Alt örneklemeden önce toprak örneklerini iyice homojenize edin.
3. Sterilize edilmiş aletler kullanarak, yaklaşık yarısı dolana kadar numune ile etiketlenmiş 2 mL santrifüj tüp yükleyin.
4. 95 numunenin tümü etiketli 2 mL santrifüj tüpe alt örneklenene kadar adım 2.2'yi tekrarlayın. 96^kuyu bir çıkarma boş olarak kullanılmalıdır.
   NOT: Gerekli depolama alanını en aza indirmek ve aşırı veya çift örneklemeyi önlemek için 2.3 ve 2.4 adımları yapılır.
5. Plaka yüklenirken 2 mL alt numune tüpünü buz üzerinde saklayın.
6. Etiket 96 steril 200 μL düz kapaklı PCR tüpler A1\u2012A12, B1\u2012B12, .... H1\u2012H12. 96-iyi raf içine sırayla bu tüpler yerleştirin.
7. İyi bir konuma (A1\u2012H12) sahip örnek bir kimlik atayın ve kaydedin.

3. Plaka hazırlama

1. Kauçuk kapağı 96 kuyulu plakadan çıkarın(Şekil 1A–1C)ve steril bir plastik torbaya yerleştirin (bkz. Malzemeler Tablosu). Kontaminasyonu önlemek için plastik torbayı kapatın.
2. 96 kuyulu plakayı sızdırmazlık filmi ile kaplayın (Şekil 1D-1E); örneğin, önceden kesilebilir bir sızdırmazlık filmi kullanın (Bkz. Malzemeler Tablosu). Bir kauçuk rulo ile haddeleme tarafından mühür emin olun.
   NOT: Delinebilir silikon paspaslar potansiyel olarak kullanımlar arasında uygun temizlik sağlanan yeniden kullanılabilir bir seçenek sunabilir, ancak test ettiğimiz silikon paspaslar delikler boyunca kolayca bölünebilir ve aşağıdaki plakalara eşit koruma sağlamaz.
3. Serin tutmak için tabağı buzdolabına (4 °C) yerleştirin.

4. Alt numunelerin transferi

NOT: Toprak numunesi çok küçük olduğunda modifikasyonlar için 4.13.

1. 2 mL alt numuneden 24'ünün soğuk hava depolanması için bir buz bloğuna yerleştirin.
2. Örnek adı ve iyi konum sayfasını kullanarak doğru 200 μL düz kapaklı PCR tüp seçin.
3. Homojenizasyonu sağlamak için ~5 s için 2 mL alt numune tüpü ve girdap alın.
4. Alev ve çamaşır suyu sterilize edilmiş aletlerin kullanılması, ilk numunenin ~200 μL'sini doğru düz kapaklı PCR tüpüne yükler(Şekil 1F).
5. 24 numunenin tümü yüklenene kadar 4.2\u20124.4 adımlarını yineleyin. Sonra adım 4.6'ya geç.
6. Ağartıcı daldırma kağıt silme kullanarak, 200°L düz kapaklı PCR tüpünün dışını temizleyin.
7. Tüpü ters çevirin ve numuneyi tüpün üstüne taşımak için tezgaha dokunun. Ağartılmış ve alev lesterilize edilmiş makaslarla, pcr tüpünün alt kısmını keserek numunenin 96 kuyulu plakaya düşmesi için bir açıklık oluşturabilirsiniz(Şekil 1G).
8. 96-iyi plaka üzerinde doğru iyi bulmak ve kesme ucu o kadar bakan plaka boyunca tüp geçmek kadar iyi ulaşana kadar. Önceden kesilebilir sızdırmazlık filminin delinmesini kolaylaştırmak için plakayı hafifçe yatırın ve sadece tüp doğrudan doğru kuyunun üzerinde olduğunda, kesme ucunun kuyuya sığması için dikkatlice ters çevirin. Sterilize edilmiş aletler kullanarak, tüm toprak tüpten kuyuya düşene kadar PCR tüpünün üst kısmına dokunun. Kapağı kapalı kuyu içinde tüp bırakın (Şekil 1H-1J).
9. Bir seferde bir adet düz kapaklı 200°L PCR tüpçıkarın ve bu kuyuya 750 μL boncuk çözeltisi ekleyin (Şekil 1K). 200 μL düz kapaklı PCR tüpünü kuyuya kadar itin ve bu kuyunun yüklendiğini belirtmek için üstünü sharpie ile işaretleyin. Her örnek için bunu tekrarlayın.
10. 24 numunenin tümü yüklendikten ve boncuk çözeltisi eklendikten sonra, 2 mL alt numune tüpünü çıkarın ve 24 örneklenmemiş tüple değiştirin.
11. Tüm 95 kuyu örnek veya boş ve boncuk çözeltisi ile yüklenene kadar adımları 4.1\u20124.10 tekrarlayın. Tüpleri açık kuyuların üzerinden geçirmeden çıkarın (Şekil 1L).
12. Delilebilir filmi dikkatlice çıkarın ve plakayı korumak için kauçuk kapağı değiştirin (Şekil 1M–1O).
13. Aynı zamanda ince taneli olan çok az miktarda toprak için, numune tüpüne 750 μL boncuk çözeltisi ekleyin ve tüm içeriği uygun kuyuya aktarmak için geniş delikli pipet ucu kullanın. Çift yüklemeyi önlemek için PCR tüpünü açıklığa yerleştirin.
    NOT: Bu değişikliği, pipet ucunun deliklerinden daha büyük partikül organik madde veya küçük kaya parçaları pipetleri tıkayabileceği ve numune bulamacının transferini zorlaştırabileceği için uygularken dikkatli olun.
14. Gerektiğinde -20 °C'de dondurularak, numune ve boncuk çözeltisi yüklü plakalar planlı ekstraksiyona kadar dondurulmalıdır.

5. Plaka yükleme yöntemlerinin karşılaştırılması

NOT: 96 kuyulu DNA çıkarma plakalarının yüklenmesi için yeni yöntemimizi doğrulamak için tek bir 96 kuyuluk plakayı üç bölüme ayırdık. Toprak ve çapraz kontaminasyon un kasıtsız yüklenmesi potansiyelini karşılaştırmak için üç farklı plaka yükleme yöntemi kullandık. Kullandığımız üç yöntem McPherson ve ark.^9,Qiagen varsayılan yükleme protokolü¹⁰özetlenen yöntemler ve bu yayında anahat protokolü vardı.

1. Toprağıtaba yükleme
   1. Bölüm 96-iyi plaka üç dört sütunblokları içine. Yukarıda belirtilen üç yöntemden birini kullanarak her bloğu yükleyin.
   2. Örnek ve boş kuyular sendelenmiş böylece her kuyuya toprak yükleyin. Bu düzenleme, yanlışlıkla numune yüklemesi ve çapraz kontaminasyon için maksimum fırsat sağlar.
   3. 96 kuyulu plakayı -20 °C'de DNA çıkarAna kadar dondurun.
2. DNA ekstraksiyonu
   1. Üreticinin 96 kuyulu plaka çıkarma protokolü^10'agöre DNA ayıklayın.
   2. DNA ekstrelerini ileri analize kadar -20 °C'de saklayın.
3. Boş kuyularda DNA'nın sayısallaştırılması
   1. Oda sıcaklığında ÇÖZÜLME DNA özleri, girdap ve bir plaka spinner kullanarak aşağı spin.
   2. Spektrofotometre kullanarak boş kuyuların DNA konsantrasyonlarını ölçün ve kaydedin.
   3. Boş kuyularda ortalama DNA konsantrasyonu farklılıklarını analiz etmek için ANVOA ve Tukey'in post-hoc testini kullanın.
      NOT: Α = 0.05'te önemli farklılıklar bildirilmiştir.

Sonuçlar

Bu yeni yöntem 96 kuyulu DNA çıkarma plakalarını yüklemek için başarıyla kullanılmıştır. Plaka yükleme yöntemlerinin karşılaştırılması, metoduzun boş kuyularda en düşük DNA konsantrasyonuna sahip olduğunu gösterdi. Boş kuyularda DNA konsantrasyonu benim McPherson et al.⁹ (p < 0.05) önerilen yöntemden önemli ölçüde daha düşüktü, ancak yöntemimizdeki DNA konsantrasyonları istatistiksel olarak Qiagen varsayılan yönteminden istatistiksel olarak farklı değild...

Tartışmalar

Bu yöntem, yüksek üretim numune çıkarma plakaları yüklerken iyi-to-well çapraz kontaminasyon için fırsatları azaltır ve mevcut plaka yükleme stratejileri 9 ötesinde 96-iyi plakalar yüklemek için daha kontrollü bir araç sunuyor^9,10. Kuyular arasında kontaminasyon tek tüp çıkarmalarda daha 96-iyi plaka ekstraksiyon daha yaygın olabilir, özellikle otomatik^6,7, ve, herhangi bir metodol...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 oz WhirlPak	Nasco	B01065
2 mL centrifuge tubes	Fisherbrand	05-408-129
200 µL micro-PCR tubes	Thermo Scientific	AB 2000
96-well PowerSoil DNA extraction kit	Qiagen	12955-4	We used a soil extraction kit but any 96-well format kit would work.
Ice block for 2 mL centrifuge tubes	Any	Any	Any ice block made for 2 mL tubes will work
Ice block for 200 µL micro-PCR tubes	Any	Any	Any ice block made for 200 µL tubes will work
Micro scoopula	Any	Any
Precut Pierceable Sealing Film	Excel Scientific	XPS25
Spatula	Any	Any
Surgical scissors	Any	Any