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Method Article
Les méthodes actuelles de chargement des plaques de 96 puits pour les extractions d’ADN peuvent être sujettes à la contamination. Nous détaillons une nouvelle méthode de chargement des plaques de 96 puits qui réduit le risque de contamination croisée entre les puits. Notre méthode aidera d’autres chercheurs à tirer parti de l’efficacité des techniques d’extraction de l’ADN à haut débit et à minimiser les risques de contamination.
Les techniques de séquençage de l’ADN à haut débit ont grandement contribué aux progrès de notre compréhension des relations entre les communautés microbiennes, des caractéristiques de l’hôte et des fonctions plus larges de l’écosystème. Avec cette augmentation rapide de l’ampleur et de la profondeur des capacités de séquençage sont venus des méthodes pour extraire, amplifier, analyser et interpréter l’ADN environnemental avec succès avec une efficacité maximale. Malheureusement, l’extraction rapide de l’ADN peut se faire au prix d’augmenter le risque de contamination entre les échantillons. En particulier, les extractions à haut débit qui sont basées sur des échantillons contenus dans une plaque de 96 puits offrent une méthode relativement rapide, par rapport aux extractions à tube unique, mais augmentent également les possibilités de contamination croisée bien-à-bien. Afin de minimiser le risque de contamination croisée entre les échantillons, tout en conservant les avantages des techniques d’extraction à haut débit, nous avons mis au point une nouvelle méthode de chargement d’échantillons environnementaux dans des plaques de 96 puits. Nous avons utilisé des films d’étanchéité PCR perçables pour couvrir chaque plaque pendant le chargement des échantillons et ajouté des échantillons d’abord aux tubes PCR avant de les déplacer dans des puits; ensemble, ces pratiques réduisent le risque de dérive des échantillons et de double chargement involontaire des puits. La méthode décrite dans le présent document fournit aux chercheurs une approche pour maximiser les techniques d’extraction à haut débit disponibles tout en réduisant le risque de contamination croisée inhérent aux plaques de 96 puits. Nous fournissons un aperçu détaillé étape par étape de la façon de passer de la collecte d’échantillons à l’extraction de l’ADN tout en minimisant le risque de contamination croisée non désirée.
Les progrès récents dans le séquençage à haut débit des communautés microbiennes fournissent une profondeur de séquençage inégalée et, par conséquent, un aperçu sans précédent du fonctionnement et de la diversité du microbiome de la Terre1. À mesure que la capacité de multiplex sur une seule voie de séquençage augmente, l’extraction de l’ADN à tube unique pourrait devenir une étape limitant les taux dans la production de données écologiques. Toutefois, les nouvelles méthodes d’extraction d’ADN à haut débit sont prometteuses pour le traitement de grandes quantités d’échantillons environnementaux avec une plus grande efficacité qu’auparavant2. Ces méthodes impliquent souvent l’utilisation de plaques de 96 puits au lieu de tubes simples, augmentant ainsi le nombre possible d’extractions qui peuvent se produire simultanément. En tant que tel, l’aspect pratique et l’efficacité des méthodes d’extraction à haut débit sont évidents et ont été mis en œuvre pour le traitement d’échantillons environnementaux allant du sol3,4 et les tissus végétaux3,5 à la matière fécale humaine2.
Bien que ces méthodes puissent accélérer considérablement le traitement des échantillons et l’extraction de l’ADN, la première étape du chargement du sol et d’autres échantillons écologiques dans des plaques de 96 puits est susceptible de contamination par des échantillons croisés. Ce type de contamination bien-à-puits peut se produire pendant les extractions d’ADN6,,7,8 , et les puits sontparticulièrementvulnérables dans cette première étape avant que les échantillons soient suspendus dans une solution tampon. McPherson et coll.9 démontrent une méthode pour charger les sols rhizosphères en plaques de 96 puits à l’aide d’entonnoirs et de couvertures de bandes DE PCR de 8 puits, mais bien que leur méthode soit une approche plus contrôlée des plaques de chargement, elle offre encore amplement d’occasions de contamination des puits voisins lors du chargement de chaque échantillon. De plus, les puits ouverts permettent à un chercheur distrait de placer un échantillon dans le puits incorrect ou d’ajouter un échantillon dans un puits qui a déjà été chargé. En outre, une variété de types d’échantillons s’avèrent mal adaptés au chargement avec cette méthode; les échantillons humides collent souvent aux entonnoirs et les échantillons secs « sautent » entre les puits en raison de l’électricité statique.
Afin de réduire les possibilités de contamination entre les puits dans la première étape des extractions d’ADN à haut débit, nous avons développé une nouvelle approche pour charger les échantillons de sol dans des plaques de 96 puits. Nos méthodes protègent les puits contre l’exposition à l’environnement et nous empêchent de charger accidentellement plusieurs échantillons dans un puits (double chargement). Nous croyons que la méthode rapportée ci-dessous offre la promesse de réduire le potentiel de contamination et en tant que telle fournit un moyen plus contrôlé de charger des plaques de 96 puits pour l’extraction ultérieure d’ADN.
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1. Banc de laboratoire et préparation d’outils pour le chargement d’une plaque de 96 puits
2. Sous-échantillonnage et préparation d’échantillons
3. Préparation des plaques
4. Transfert de sous-échantillons
REMARQUE : Voir l’étape 4.13 pour les modifications lorsque l’échantillon de sol est très petit.
5. Comparaison des méthodes de chargement des plaques
REMARQUE : Afin de vérifier notre nouvelle méthode de chargement des plaques d’extraction d’ADN de 96 puits, nous avons divisé une seule plaque de 96 puits en trois sections. Nous avons utilisé trois méthodes différentes de chargement des plaques pour comparer le potentiel de chargement involontaire du sol et de contamination croisée. Les trois méthodes que nous avons utilisées étaient les méthodes décrites dans McPherson et coll.9, le protocole de chargement par défaut10de Qiagen et le protocole que nous décrivons dans cette publication.
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Cette nouvelle méthode a été utilisée avec succès pour charger des plaques d’extraction d’ADN de 96 puits. La comparaison des méthodes de chargement des plaques a montré que notre méthode avait la plus faible concentration d’ADN dans les puits vides. La concentration d’ADN dans les puits vierges était significativement inférieure à la méthode proposée par McPherson et coll.9 (p < 0,05), bien que les concentrations d’ADN dans notre méthode n’aient pas été statistiquement...
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Cette méthode réduit les possibilités de contamination croisée bien à bien tout en chargeant des plaques d’extraction d’échantillons à haut débit et offre un moyen plus contrôlé de charger des plaques de 96 puits au-delà des stratégies existantes de chargement des plaques9,10. La contamination entre les puits peut être plus répandue dans les extractions de plaques de 96 puits que dans les extractions à un seul tube, en particulier lorsqu’elle...
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Les auteurs ne signalent aucun conflit d’intérêts et n’ont rien à divulguer.
Cette recherche a été soutenue par la Microbial Ecology Collaborative avec un financement du prix NSF #EPS-1655726.
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Name | Company | Catalog Number | Comments |
18 oz WhirlPak | Nasco | B01065 | |
2 mL centrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-129 | |
200 µL micro-PCR tubes | Thermo Scientific | AB 2000 | |
96-well PowerSoil DNA extraction kit | Qiagen | 12955-4 | We used a soil extraction kit but any 96-well format kit would work. |
Ice block for 2 mL centrifuge tubes | Any | Any | Any ice block made for 2 mL tubes will work |
Ice block for 200 µL micro-PCR tubes | Any | Any | Any ice block made for 200 µL tubes will work |
Micro scoopula | Any | Any | |
Precut Pierceable Sealing Film | Excel Scientific | XPS25 | |
Spatula | Any | Any | |
Surgical scissors | Any | Any |
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