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Method Article
Los métodos actuales para la carga de placas de 96 pozos para extracciones de ADN pueden ser propensos a la contaminación. Detallamos un nuevo método para cargar placas de 96 pozos que reduce el riesgo de contaminación cruzada entre pozos. Nuestro método ayudará a otros investigadores a capitalizar la eficiencia de las técnicas de extracción de ADN de alto rendimiento y minimizar el riesgo de contaminación.
Las técnicas de secuenciación de ADN de alto rendimiento han contribuido sustancialmente a los avances en nuestra comprensión de las relaciones entre las comunidades microbianas, las características del huésped y las funciones más amplias del ecosistema. Con este rápido aumento en la amplitud y profundidad de las capacidades de secuenciación han llegado métodos para extraer, amplificar, analizar e interpretar el ADN ambiental con éxito con la máxima eficiencia. Desafortunadamente, realizar extracciones de ADN rápidamente puede venir a costa de aumentar el riesgo de contaminación entre las muestras. En particular, las extracciones de alto rendimiento que se basan en muestras contenidas en una placa de 96 pozos ofrecen un método relativamente rápido, en comparación con las extracciones de un solo tubo, pero también aumentan las oportunidades de contaminación cruzada bien a pozo. Para minimizar el riesgo de contaminación cruzada entre muestras, conservando al mismo tiempo los beneficios de las técnicas de extracción de alto rendimiento, desarrollamos un nuevo método para cargar muestras ambientales en placas de 96 pozos. Usamos películas de sellado de PCR perforables para cubrir cada placa mientras cargamos muestras y agregamos muestras primero a los tubos de PCR antes de moverlas a pozos; juntos, estas prácticas reducen el riesgo de deriva de la muestra y la doble carga no intencionada de pozos. El método descrito en este artículo proporciona a los investigadores un enfoque para maximizar las técnicas de extracción de alto rendimiento disponibles y, al mismo tiempo, reducir el riesgo de contaminación cruzada inherente a las placas de 96 pozos. Proporcionamos un esquema detallado paso a paso de cómo pasar de la recolección de muestras a la extracción de ADN, minimizando al mismo tiempo el riesgo de contaminación cruzada no deseada.
Los recientes avances en la secuenciación de alto rendimiento de las comunidades microbianas están proporcionando una profundidad de secuenciación sin precedentes y, en consecuencia, una visión poco preciada del funcionamiento y la diversidad del microbioma de la Tierra1. A medida que aumenta la capacidad de multiplexar más y más muestras en un solo carril de secuenciación, la extracción de ADN de un solo tubo tiene el potencial de convertirse en un paso de limitación de velocidad en la generación de datos ecológicos. Sin embargo, los nuevos métodos en extracciones de ADN de alto rendimiento prometen el procesamiento de grandes cantidades de muestras ambientales con mayor eficiencia de la que ha sido posibleanteriormente 2. Estos métodos a menudo implican el uso de placas de 96 pozos en lugar de tubos individuales, aumentando así el número posible de extracciones que pueden ocurrir simultáneamente. Como tal, la practicidad y eficiencia de los métodos de extracción de alto rendimiento son evidentes y se han implementado para el procesamiento de muestras ambientales que van desde el suelo3,4 y los tejidos vegetales3,5 a la materia fecal humana2.
Si bien estos métodos pueden acelerar drásticamente el procesamiento de muestras y la extracción de ADN, el paso inicial de cargar el suelo y otras muestras ecológicas en placas de 96 pozos es susceptible a la contaminación de la muestra cruzada. Este tipo de contaminación a pozo puede ocurrir durante las extracciones de ADN6,7,8, y los pozos son particularmente vulnerables en este primer paso antes de que las muestras se suspenden en una solución tampón. 9 demuestran un9 método para cargar suelos de rizosfera en placas de 96 pozos utilizando embudos y cubiertas de tiras de PCR de 8 pozos, pero si bien su método es un enfoque más controlado para las placas de carga, todavía proporciona una amplia oportunidad para la contaminación de los pozos vecinos al cargar cada muestra. Además, los pozos abiertos permiten la posibilidad de que un investigador distraído coloque una muestra en el pozo incorrecto o agregue una muestra a un pozo que ya se ha cargado. Además, una variedad de tipos de muestras resultan ser poco adecuadas para la carga con este método; las muestras húmedas a menudo se pegan a los embudos y las muestras secas "saltan" entre los pozos debido a la electricidad estática.
Para reducir las oportunidades de contaminación entre pozos en el primer paso de las extracciones de ADN de alto rendimiento, desarrollamos un nuevo enfoque para cargar muestras de suelo en placas de 96 pozos. Nuestros métodos protegen los pozos de la exposición ambiental y nos impiden cargar accidentalmente varias muestras en un pozo (doble carga). Creemos que el método reportado a continuación ofrece la promesa de reducir el potencial de contaminación y como tal proporciona un medio más controlado para cargar placas de 96 pozos para la extracción posterior del ADN.
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1. Banco de laboratorio y preparación de herramientas para cargar una placa de 96 pozos
2. Submuestreo y preparación de muestras
3. Preparación de placas
4. Transferencia de subsesc muestras
NOTA: Consulte el paso 4.13 para ver las modificaciones cuando la muestra de suelo es muy pequeña.
5. Comparación de los métodos de carga de placas
NOTA: Para verificar nuestro novedoso método para la carga de placas de extracción de ADN de 96 pozos, dividimos una sola placa de 96 pozos en tres secciones. Utilizamos tres métodos diferentes de carga de placas para comparar el potencial de carga involuntaria del suelo y la contaminación cruzada. Los tres métodos que utilizamos fueron los métodos descritos en McPherson et al.9, el protocolo de carga predeterminado10de Qiagen y el protocolo que describimos en esta publicación.
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Este novedoso método se utilizó con éxito para cargar placas de extracción de ADN de 96 pozos. La comparación de los métodos de carga de placas mostró que nuestro método tenía la concentración de ADN más baja en los pozos en blanco. La concentración de ADN en los pozos en blanco fue significativamente menor que el método propuesto mi McPherson et al.9 (p < 0.05), aunque las concentraciones de ADN en nuestro método no eran estadísticamente diferentes del método predeterminado Qiagen...
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Este método reduce las oportunidades de contaminación cruzada bien a pozo mientras se cargan placas de extracción de muestras de alto rendimiento y ofrece un medio más controlado para cargar placas de 96 pozos más allá de las estrategias de carga de placas existentes9,,10. La contaminación entre pozos puede ser más generalizada en extracciones de placas de 96 pozos que en extracciones de un solo tubo, especialmente cuando seautomatizan 6...
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Los autores no reportan conflictos de intereses y no tienen nada que revelar.
Esta investigación fue apoyada por microbial Ecology Collaborative con financiación del premio NSF #EPS-1655726.
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Name | Company | Catalog Number | Comments |
18 oz WhirlPak | Nasco | B01065 | |
2 mL centrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-129 | |
200 µL micro-PCR tubes | Thermo Scientific | AB 2000 | |
96-well PowerSoil DNA extraction kit | Qiagen | 12955-4 | We used a soil extraction kit but any 96-well format kit would work. |
Ice block for 2 mL centrifuge tubes | Any | Any | Any ice block made for 2 mL tubes will work |
Ice block for 200 µL micro-PCR tubes | Any | Any | Any ice block made for 200 µL tubes will work |
Micro scoopula | Any | Any | |
Precut Pierceable Sealing Film | Excel Scientific | XPS25 | |
Spatula | Any | Any | |
Surgical scissors | Any | Any |
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