JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تتمثل أهداف البروتوكول في استخدام هذا النهج من أجل 1) فهم دور البيئة المكروية لورم المعدة المثبط للمناعة و 2) التنبؤ بفعالية استجابة المريض ، وبالتالي زيادة معدل بقاء المرضى.

Abstract

تتفاعل الأورام التي تعبر عن ترابط موت الخلايا المبرمج 1 (PD-L1) مع بروتين موت الخلايا المبرمج 1 (PD-1) على الخلايا الليمفاوية التائية السامة للخلايا CD8 + (CTLs) للتهرب من المراقبة المناعية مما يؤدي إلى تثبيط انتشار CTL ، والبقاء على قيد الحياة ، ووظيفة المستجيب ، وبالتالي استمرار السرطان. ما يقرب من 40٪ من سرطانات المعدة تعبر عن PD-L1 ، ومع ذلك فإن معدل الاستجابة للعلاج المناعي هو 30٪ فقط. نقدم استخدام الزراعة المشتركة للخلايا العضوية / المناعية لسرطان المعدة الذاتي المشتق من الإنسان كنموذج قبل سريري قد يتنبأ بفعالية العلاجات المستهدفة لتحسين نتائج مرضى السرطان. على الرغم من الإبلاغ عن الثقافات العضوية المشتركة للسرطان مع الخلايا المناعية ، إلا أن نهج الزراعة المشتركة هذا يستخدم مستضد الورم لنبض الخلايا المتغصنة العارضة للمستضد. ثم يتم زراعة الخلايا المتغصنة (DCs) بخلايا CD8 + T الخاصة بالمريض لتوسيع النشاط المحلل للخلايا وتكاثر هذه الخلايا الليمفاوية التائية قبل الزراعة المشتركة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم التحقيق في التمايز والوظيفة المثبطة للمناعة للخلايا المثبطة المشتقة من النخاع (MDSCs) في الثقافة داخل نظام الزراعة المشتركة هذا. قد يكون هذا النهج العضوي ذا أهمية واسعة ومناسب للتنبؤ بفعالية العلاج ونتائج المريض في أنواع السرطان الأخرى ، بما في ذلك سرطان البنكرياس.

Introduction

سرطان المعدة هو خامس أكثر أنواع السرطان شيوعا في جميع أنحاء العالم 1. أدى التشخيص والعلاج الفعالان لبكتيريا الملوية البوابية (H. pylori) إلى انخفاض معدل الإصابة بسرطان المعدة في الولايات المتحدة 2. ومع ذلك ، فإن معدل البقاء على قيد الحياة لمدة 5 سنوات للمرضى الذين تم تشخيص إصابتهم بهذا الورم الخبيث هو 29٪ فقط ، مما يجعل سرطان المعدة تحديا طبيا مهما3. الغرض من الأساليب المعروضة هنا هو تطوير نهج للتنبؤ باستجابات العلاج المناعي لدى المرضى الفرديين بدقة. تتكون الأورام الصلبة من خلايا سرطانية وأنواع مختلفة من الخلايا اللحمية والبطانية والمكونة للدم ، بما في ذلك البلاعم والخلايا المثبطة المشتقة من النخاع (MDSCs) والخلايا الليمفاوية (تمت مراجعتها في 4،5). تؤثر التفاعلات بين الخلايا الجذعية السرطانية والبيئة المكروية للورم (TME) بشكل كبير على خصائص الورم واستجابة المريض للعلاج. يسعى هذا النهج جاهدا للسماح للباحثين باكتساب المعرفة لتطوير الأدوية قبل السريرية واكتشاف المؤشرات الحيوية للعلاج الشخصي لسرطان المعدة.

تستخدم الطريقة المعروضة هنا الثقافات العضوية الذاتية / الخلايا المناعية المشتقة من الإنسان والتي تم إنشاؤها من مرضى سرطان المعدة لفهم الدور المثبط للمناعة ل MDSCs. يتم تقديم نموذج قبل السريري قد يتنبأ بفعالية العلاجات المستهدفة لتحسين بقاء المرضى. تم الإبلاغ على نطاق واسع عن الثقافات العضوية المشتركة للسرطان مع الخلايا المناعية في مجال سرطان البنكرياس6،7،8،9،10. ومع ذلك ، لم يتم الإبلاغ عن مثل هذه الثقافات المشتركة لدراسة سرطان المعدة. بشكل عام ، توضح هذه الطريقة الزراعة المشتركة للخلايا المناعية المشتقة من الإنسان الذاتية داخل نفس بيئة المصفوفة مثل العضيات السرطانية ، مما يسمح للخلايا المناعية بالتلامس مع العضيات المستهدفة.

أفادت الدراسة التي أجراها Tiriac et al.10 أن عضيات سرطان البنكرياس المشتقة من المريض ، والتي أظهرت استجابات غير متجانسة للعلاج الكيميائي القياسي للرعاية ، يمكن تجميعها في توقيعات التعبير الجيني القائم على العضوية للحساسية الكيميائية التي يمكن أن تتنبأ بتحسن استجابات المريض للعلاج الكيميائي. اقترح الباحثون أن التنميط الجزيئي والعلاجي المشترك للعضيات لسرطان البنكرياس قد يتنبأ بالاستجابة السريرية10. أظهرت بيانات التجارب السريرية المشتركة من Yao et al.11 أيضا أن العضيات المشتقة من سرطان المستقيم تمثل فيزيولوجيا مرضية مماثلة وتغيرات جينية مشابهة لأنسجة ورم المريض استجابة للإشعاع الكيميائي. وبالتالي ، من الضروري استخدام الثقافات العضوية في سياق الخلايا المناعية للمريض والنمط الظاهري المناعي للورم عند استخدام هذه الثقافات كنماذج تنبؤية للعلاج.

تمنع الأورام التي تعبر عن PD-L1 والتي تتفاعل مع PD-1 تكاثر الخلايا الليمفاوية التائية السامة للخلايا CD8 + ، والبقاء على قيد الحياة ، ووظيفة المستجيب 12،13،14. في حين أن ما يقرب من 40٪ من سرطانات المعدة تعبر عن PD-L1 ، فإن 30٪ فقط من هؤلاء المرضى يستجيبون للعلاج المناعي15،16،17. تستخدم الأجسام المضادة ل PD1 في التجارب السريرية لعلاج سرطان المعدة18،19،20. ومع ذلك ، لا توجد حاليا نماذج قبل السريرية تسمح باختبار الفعالية العلاجية لكل مريض. من المحتمل أن يسمح تحسين الثقافة العضوية بحيث يتم تضمين الخلايا المناعية للمريض في النظام بتحديد فردي لفعالية العلاج المناعي.

Protocol

تم الحصول على الموافقة على جمع الأنسجة التي تم أخذ خزعة بشرية من أورام المرضى (1912208231R001 ، برنامج حماية الأشخاص بجامعة أريزونا. رقم بروتوكول IRB: 1099985869R001 ، برنامج حماية الأشخاص بجامعة أريزونا TARGHETS).

1. إنشاء عضيات المعدة المشتقة من المريض من الخزعات

  1. اجمع 1-2 مم من الأنسجة البشرية المأخوذة من الخزعة من منطقة الورم لمرضى سرطان المعدة الذين يخضعون لتنظير المعدة والاثني عشر للمريء في محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS) (الجدول 1).
    ملاحظة: يجب إجراء جميع الإجراءات من الآن فصاعدا في بيئة معقمة باستخدام مواد وكواشف معقمة.
  2. افرم الأنسجة التي تم أخذ الخزعة باستخدام شفرات مشرط على طبق بتري. انقل الأنسجة المفرومة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل وأضف 5-10 مل من 1x PBS.
  3. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية. أضف 1-2 مل من محلول الهضم الدافئ مسبقا (الجدول 1) إلى الأنسجة المحببة.
  4. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 15-30 دقيقة ، اعتمادا على حجم المناديل المفرومة. راقب حالة الهضم من خلال البحث تحت المجهر بحثا عن مجموعات الخلايا الصغيرة كل 5-10 دقائق.
  5. أوقف عملية الهضم عن طريق تخفيف 5 أضعاف باستخدام وسط النسر المعدل البارد من Advanced Dulbecco / وسط Ham's F-12 (Advanced DMEM / F-12). إذا كانت كتل من المواد غير المهضومة مرئية ، فقم بتصفية الأنسجة من خلال مرشحات 30 ميكرومتر. اجمع التدفق.
  6. الطرد المركزي التدفق من خلال 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتكسير الخلايا. تخلص من المادة الطافية.
  7. أعد تعليق الخلايا المحببة (10,000-100,000) في حجم مناسب (2-4 مل) من مصفوفة الغشاء القاعدي المذابة (انظر جدول المواد) على الجليد. تسقط البذور على شكل 30-50 ميكرولتر من مصفوفة غشاء الخلية القاعدية في ألواح استزراع 24 بئرا.
  8. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة للسماح لقطرات مصفوفة غشاء الخلية القاعدية بالتصلب. قم بتراكب قطرات مصفوفة غشاء الخلية القاعدية بوسط ثقافة العضوية المعدية الدافئ مسبقا (الجدول 1).
  9. حافظ على المزارع العضوية عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2. استبدل وسط الثقافة بوسط طازج كل 3-4 أيام ، اعتمادا على نمو العضوية. قم بتمرير العضيات مرة كل 7-10 أيام بنسبة 1: 3.

2. إنشاء عضيات المعدة المشتقة من المريض من العينات الجراحية

  1. اجمع أنسجة سرطان المعدة البشرية من العينات المقطوعة لمرضى سرطان المعدة أثناء العمليات الجراحية في 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS) مكمل بالمضادات الحيوية (الجدول 1).
    ملاحظة: يجب معالجة جميع الإجراءات فيما يلي في خزانة السلامة البيولوجية ، مع الحفاظ على بيئة معقمة واستخدام مواد وكواشف معقمة.
  2. افرم الأنسجة المقطوعة باستخدام شفرات مشرط جراحية على طبق بتري. اغسل المناديل المفرومة ب 5-10 مل من 1x DPBS التي تحتوي على مضادات حيوية.
  3. انقل الأنسجة إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل. أضف 10 مل من المخزن المؤقت لتجريد حمض رباعي الأسيتيك الإيثيلين ديامين (EDTA) إلى الأنسجة المفرومة. راقب حالة الهضم كل 5-10 دقائق. احتضان الأنبوب في شاكر 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  4. دع الأنسجة تستقر في قاع الأنبوب ، وقم بإزالة المخزن المؤقت EDTA دون إزعاج الأنسجة ، وأضف 10 مل من محلول EDTA الجديد. احتضان الأنبوب في شاكر 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  5. دع الأنسجة تستقر في قاع الأنبوب. قم بإزالة المخزن المؤقت EDTA واغسل الأنسجة مرتين (اتبع الخطوة 2.4) ب 10 مل من DMEM / F-12 المتقدم المكمل بالمضادات الحيوية (بدون أجهزة الطرد المركزي) (الجدول 1).
  6. أضف 5-10 مل من محلول الهضم الدافئ مسبقا (الجدول 1) إلى الأنسجة ، اعتمادا على حجم الأنسجة. احتضان الأنبوب عند 37 درجة مئوية لمدة 15-30 دقيقة مع تحريض خفيف ، اعتمادا على حجم وملمس الأنسجة. تحقق من ظهور مجموعات الخلايا تحت المجهر كل 10 دقائق.
  7. أوقف عملية الهضم عن طريق التخفيف مرتين باستخدام المضادات الحيوية المتقدمة DMEM/F-12 الباردة. قم بتصفية الأنسجة غير المهضومة من خلال مرشحات 40 ميكرومتر واجمع التدفق.
  8. الطرد المركزي التدفق من خلال 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لحبيبات الخلايا. تخلص من المادة الطافية ، واغسل الخلايا ب 1x DPBS بارد بالإضافة إلى المضادات الحيوية عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية بعناية ، وقم بتخزين الخلايا على الجليد.
  9. أعد تعليق الخلايا المحببة في حجم مناسب من مصفوفة الغشاء القاعدي على الجليد. تسقط مصفوفة غشاء الخلية القاعدية للبذور 30-50 ميكرولتر في ألواح معالجة بالخلايا المزروعة 24 أو 12 بئرا.
  10. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة للسماح لقطرات مصفوفة غشاء الخلية القاعدية بالتصلب كقبة. قم بتراكب قبة مصفوفة غشاء الخلية القاعدية بوسط ثقافة عضوي معدي مسخن مسبقا (الجدول 1).
  11. الحفاظ على المزارع العضوية عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2. استبدل وسط الثقافة بوسط طازج كل 3-4 أيام ، اعتمادا على نمو العضوية. قم بتمرير العضيات مرة كل 7-10 أيام بنسبة 1: 2 أو 1: 3 ، بناء على الكثافة العضوية.

3. صيانة وتوسيع الثقافات العضوية

ملاحظة: يجب إجراء جميع الإجراءات في بيئة معقمة باستخدام مواد وكواشف معقمة.

  1. الصيانة والتوسع
    1. حافظ على المزارع العضوية لمدة 7-10 أيام حتى تتماسك بنسبة 70-80٪. حصاد العضيات في DMEM المثلج. انقل العضيات إلى 5 مل أنابيب البوليسترين المستديرة القاع.
    2. الطرد المركزي للعضيات عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لخلايا الحبيبات. قم بإزالة المادة الطافية بعناية وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من محلول كاشف تفكك الخلايا الدافئ مسبقا. احتضان العضيات عند 37 درجة مئوية لمدة 6 دقائق.
    3. مرر العضيات برفق عبر إبرة 26 جم 4 مرات. أضف 2 مل من DMEM لإيقاف عمل كاشف تفكك الخلية.
    4. الطرد المركزي للعضيات عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لحبيبات الخلايا. تخلص من المادة الطافية بعناية وقم بتخزين الخلايا على الجليد.
    5. أعد تعليق الخلايا المحببة في حجم مناسب من مصفوفة الغشاء القاعدي على الجليد. تسقط البذور 30-50 ميكرولتر من مصفوفة غشاء الخلية القاعدية في 24 أو 12 بئرا من الصفائح المعالجة بزراعة الخلايا.
    6. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة للسماح لقطرات مصفوفة غشاء الخلية القاعدية بالتصلب كقبة. قم بتراكب قبة مصفوفة غشاء الخلية - الخلية القاعدية بوسط ثقافة عضوية معدية مدفأة مسبقا (انظر الجدول 1).
    7. الحفاظ على المزارع العضوية عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2. استبدل وسط الثقافة بوسط طازج كل 3-4 أيام ، اعتمادا على نمو العضوية. كرر مرور العضيات مرة كل 7-10 أيام بنسبة 1: 2 أو 1: 3 ، بناء على الكثافة العضوية.
  2. توسيع خطوط الخلايا المشتقة من العضوية
    1. احصد العضيات عندما تكون متقاربة بنسبة 70-80٪. قم بتغذية الخلايا الملتصقة بالصفائح البلاستيكية بوسط زراعة العضوية المعدية والحفاظ على المزرعة عن طريق إطعامها كل 3-4 أيام حسب نمو الخلية.
    2. قم بتمرير الخلايا عندما تصل إلى 80-90٪ التقاء.
      1. قم بإزالة وسط الثقافة واغسل الطبق برفق باستخدام DPBS مسخن مسبقا. أضف 1 مل من كاشف تفكك الخلايا الدافئ مسبقا.
      2. احتضان الخلايا لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. حصاد الخلايا في 2 مل من DMEM.
      3. الطرد المركزي للخلايا عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات في وسط زراعة العضوية المعدية أو وسط زراعة الخلايا الظهارية في المعدة البشرية (الجدول 1).
    3. قم بلوحة الخلايا من 3.2.2.3 إما في ألواح مغلفة بمصفوفة غشاء القاعدي أو مغلفة بالجيلاتين. الحفاظ على المزارع العضوية عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2. استبدل الوسط بوسط طازج كل يوم بديل حسب نمو الخلية. كرر مرور الخلايا مرة كل 7-10 أيام بنسبة 1: 2 أو 1: 3 ، بناء على كثافة الخلية.
      1. لطلاء الألواح بمصفوفة غشاء القاعدة ، قم بتخفيف المصفوفة في ماء درجة زراعة الخلايا المثلجة بنسبة 1:10. قم بتغطية اللوحة بشكل موحد ب 1 مل من محلول المصفوفة المخفف المثلج باستخدام موزع الخلايا ، واحتضان الصفيحة المطلية عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. قم بإزالة محلول الطلاء المتبقي واترك اللوحة تجف بدون غطاء داخل غطاء السلامة الحيوية لمدة 30 دقيقة ، قبل طلاء الخلايا مباشرة.
      2. لطلاء الألواح بالجيلاتين ، قم بتغطية اللوحة بشكل موحد ب 1 مل من محلول طلاء قائم على الجيلاتين المثلج. احتضان اللوحة المطلية في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. قم بإزالة محلول الجيلاتين المتبقي وقم بلوحة الخلايا المعلقة.

4. زراعة الخلايا المناعية من خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMCs)

ملاحظة: يجب إجراء جميع الإجراءات في بيئة معقمة باستخدام مواد وكواشف معقمة.

  1. عزل PBMC
    1. تمييع الدم الكامل بحجم متساو من 1x PBS.
    2. اعتمادا على الحجم الكلي لعينة الدم المخففة ، قم بتوزيع حجم مناسب من وسط تدرج الكثافة (انظر جدول المواد) في أنبوب سعة 15 مل.
      ملاحظة: النسبة الموصى بها هي 3 مل من وسط تدرج الكثافة إلى 4 مل من عينة الدم المخففة.
    3. ضع عينة الدم المخففة بعناية على وسط تدرج الكثافة. جهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 30 دقيقة - 1 ساعة بدون فرامل.
    4. بعد الطرد المركزي ، قم بنقل الخلايا أحادية النواة بعناية في الواجهة إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل. تمييع الخلايا أحادية النواة ب 3 أحجام من 1x PBS.
    5. جهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 10 دقائق. تخلص من المادة الطافية. كرر مرة واحدة.
    6. قم بتعليق الخلايا المحببة في وسط مناسب للتطبيقات النهائية أو حفظها بالتبريد كمخزونات مجمدة.
    7. إذا لزم الأمر ، حدد العائد وصلاحية الخلية ل PBMCs باستخدام مقايسة استبعاد صبغة التريبان الزرقاء.
  2. ثقافة الخلايا المتغصنة البشرية
    1. أعد تعليق PBMCs المعزولة في وسط PBMC (انظر جدول المواد والجدول 1) وقم بوضعها في صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 24 بئرا لمدة 1-2 ساعة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2.
    2. اضغط بقوة على لوحة الاستزراع وتخلص من وسط الاستزراع المستهلك الذي يحتوي على خلايا غير ملتصقة.
    3. أضف وسط ثقافة التيار المستمر (الجدول 1) إلى الخلايا الملتصقة. حافظ على المزارع لمدة 3 أيام عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون2. استبدل الوسط الطافي بوسط استزراع طازج في أيام بديلة.
    4. في اليوم 3 ، استبدل الوسط المستنفد بوسط نضج DC جديد (الجدول 1). الحفاظ على المزارع لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  3. مزرعة الخلايا الليمفاوية التائية السامة للخلايا البشرية (CTLs)
    1. انقل 1 مل من PBMCs إلى أنبوب دائري القاع من البوليسترين سعة 5 مل.
    2. أضف 50 ميكرولتر من كوكتيل التخصيب (انظر جدول المواد) إلى PBMCs. احتضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    3. أضف 150 ميكرولتر من الجسيمات المغناطيسية (جدول المواد) إلى العينة. احتضن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    4. قم بزيادة حجم العينة إلى 2.5 مل باستخدام المخزن المؤقت لفصل الخلايا (جدول المواد). ضع أنبوب البوليسترين ذو القاع الدائري في مغناطيس فصل الخلايا (جدول المواد) لمدة 5 دقائق لتمكين فصل الخلايا.
    5. صب معلق الخلية المخصب في أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية.
    6. أعد تعليق الخلايا المحببة والزراعة في وسط زراعة CTL (الجدول 1) لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2.
  4. زراعة الخلايا المثبطة المشتقة من النخاع البشري (MDSCs)
    1. استزراع PBMCs في وسط استزراع MDSC (الجدول 1) لمدة 7 أيام عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 لإثراء MDSCs. استبدل الوسط الطافي بوسط استزراع طازج في أيام بديلة.
  5. الثقافة المشتركة بين البلدان النامية وشبكات التبادل التجاري
    1. اجمع الوسط المكيف من الثقافات العضوية.
    2. قم بإزالة 50٪ من الوسط برفق من ثقافة التيار المستمر الناضجة واستبدله بوسط مكيف مشتق من العضوية.
    3. احتضان التيار المستمر مع الوسط المكيف المشتق من العضوية لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
    4. احصد التيار المستمر غير الملتصق بشكل فضفاض وقم بطردها عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في وسط الزراعة المشتركة RPMI ، وأضف تعليق الخلية هذا مرة أخرى إلى نفس البئر.
    5. قم بحصاد CTLs من نفس خط المريض ونقلها إلى DCs الناضجة. استمر في الاستزراع المشترك DC-CTL (الجدول 1) لمدة 72 ساعة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2.

5. إنشاء الثقافات المشتركة للخلايا العضوية / المناعية

  1. عزل CTLs عن الثقافات المشتركة للDCs و CTLs باستخدام مجموعة (انظر جدول المواد) كما هو موضح سابقا في القسم 4.3.
  2. احتضان CTLs مع 5 ميكرومتر كربوكسي فلوريسين ثنائي أسيتات إستر السكسينيمديل (CFSE) عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    ملاحظة: CFSE عبارة عن صبغة قابلة للإثارة بالليزر الأزرق تستخدم لمراقبة قياس التدفق الخلوي لانقسامات الخلايا.
  3. احصد العضيات واخلطها مع CTLs المسمى CFSE. مع الحفاظ على نسبة CTL / العضويات عند 50,000 CTLs لكل 200 عضوية ، قم بتعليق العضيات في حجم مناسب من مصفوفة الغشاء القاعدي المذابة على الجليد. تسقط البذور على شكل 25 ميكرولتر من مصفوفة غشاء الخلية القاعدية في ألواح زراعة الأنسجة المكونة من 24 بئرا.
    ملاحظة: بالنسبة للظروف التجريبية التي تتطلب MDSCs ، امزج MDSCs مع العضيات و CTLs المسمى CFSE قبل البذر. يجب أن تكون نسبة MDSC / CTL 4: 1.
  4. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة للسماح لقطرات مصفوفة غشاء الخلية القاعدية بالتصلب.
  5. قم بتراكب قطرات مصفوفة غشاء الخلية القاعدية بوسط ثقافة عضوي دافئ مسبقا.
  6. حافظ على المزارع العضوية / المناعية المشتركة عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 حتى التحليل.

النتائج

عند الانتهاء ، تظهر عضيات المعدة ككرات داخل البئر ، عادة في غضون 2-4 أيام بعد التضمين (الشكل 1). يوضح الشكل 1 أ ثقافة عضية معدية مزدهرة تظهر غشاءا منتظما. غالبا ما تظهر عضيات الورم مورفولوجيا متباينة فريدة من نوعها لعينة المريض. ستظهر الثقافا?...

Discussion

نقدم استخدام الزراعة المشتركة للخلايا العضوية / المناعية لسرطان المعدة الذاتي المشتق من الإنسان والتي يمكن استخدامها كنموذج قبل السريري للتنبؤ بفعالية العلاجات المستهدفة لتحسين نتائج العلاج وتشخيص المريض في النهاية. على الرغم من الإبلاغ عن الثقافات العضوية المشتركة ?...

Disclosures

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIAID) 5U19AI11649105 (PIs: Weiss and Wells ، قائد المشروع 1: Zavros) و NIH (NIDDK) 2 R01 DK083402-06A1 (PI: Zavros). تم دعم هذا المشروع جزئيا من قبل PHS Grant P30 DK078392 (Integrative Morphology Core) للمركز الأساسي لأبحاث أمراض الجهاز الهضمي في سينسيناتي و 5P30CA023074 مركز السرطان بجامعة أريزونا - منحة دعم مركز السرطان (PI: Sweasy). نود أن نتوجه بالمساعدة التي قدمها Chet Closson (Live Microscopy Core ، جامعة سينسيناتي) والأعضاء السابقين في مختبر Zavros ، الدكتورة نينا ستيل ولورن هولوكاي ، لمساهمتهم في تطوير نظام الاستزراع العضوي. نشكر بصدق المرضى الذين وافقوا على التبرع بالأنسجة والدم لتطوير المزارع المشتركة للخلايا العضوية / المناعية في المعدة. بدون استعدادهم للمشاركة في الدراسة ، لن يكون هذا العمل ممكنا.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
12 well plateMidwest Scientific92012
15 mL Falcon tubeFisher scientific12-565-269
24 well plateMidwest Scientific92024
30 μm filtersMiltenyi Biotec130-041-407
40 μm filters (Fisher Scientific)Fisher scientific352340
5 mL round bottom polystyrene tubesFisher scientific14956-3C
50 mL Falcon tubeFisher scientific12-565-271
Advanced DMEM/F12Thermo Fisher Scientific12634010
AIMVThermo Fisher Scientific12055091Basal medium for PBMCs and DCs
Amphotericin B/ GentamicinThermo Fisher ScientificR-01510
B-27 supplementThermo Fisher Scientific12587010
β-mercaptoethanolThermo Fisher Scientific800-120
Bone morphogenetic protein inhibitor (Noggin)Peprotech250-38
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma AldrichA7906
CabozantinibSelleckchemS1119
Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)Biolegend423801
Collagenase ASigma AldrichC9891
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)Fisher scientific14190-144cell separation buffer
EasySep BufferStem Cell Technologies20144Contains Enrichment Cocktail and Magnetic Particles used in CTL culture
EasySep Human CD8+ T Cell Enrichment KitStem Cell Technologies19053cell separation magnet
EasySep MagnetStem Cell TechnologiesSN12580
EDTASigma AldrichE6758
Epidermal Growth Factor (EGF)Peprotech315-09
Farma Series 3 Water Jacketed IncubatorThermo Fisher Scientific4120
Fetal Calf Serum (FCS)Atlanta BiologicalsSI2450H
Fibroblast growth factor 10 (FGF-10)Peprotech100-26density gradient medium
Ficoll-PaqueGE Healthcare171440-02
Gastrin 1Tocris30061
GelatinCell Biologics6950
GM-CSFThermo Fisher ScientificPHC6025
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Thermo Fisher Scientific14175095
HEPES (2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid)Fisher scientificBP299-100
Human Epithelial Cell Basal MediumCell BiologicsH6621
human serum ABGemini Bioscience21985023
Hyaluronidase Type IV-SSigma AldrichH3884
Insulin-Transferrin-SeleniumThermo Fisher Scientific41400045
Interleukin 1β (IL-1β)Thermo Fisher ScientificRIL1BI
Interleukin 6 (IL-6)Thermo Fisher ScientificRIL6I
Interleukin 7 (IL-7)Thermo Fisher ScientificRP-8645
KanamycinThermo Fisher Scientific11815024
L-glutamineFisher scientific350-50-061basement membrane matrix
Matrigel (Corning Life Sciences, Corning, NY)Fisher scientificCB40230C
N-2 supplementThermo Fisher Scientific17502048
N-acetyl-L-cysteineSigma AldrichA7250
Nicotinamide (Nicotinamide)Sigma AldrichN0636
PD-L1 inhibitorSelleckchemA2002
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher ScientificSV3000
PetridishFisher scientific07-202-030
Potassium chloride (KCl)Fisher scientific18-605-517
Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4)Fisher scientificNC0229895
prostaglandin E2 (PGE2)Sigma AldrichP0409
RPMI 1640Thermo Fisher Scientific11875119
Sodium chloride (NaCl)Fisher scientific18-606-419
Sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4)Fisher scientificNC0229893cell dissociation reagent
StemPro Accutase solutionThermo Fisher ScientificA1110501
Transforming growth factor beta 1 (TGF-β1)Thermo Fisher Scientific7754-BH-005/CF
Tumor necrosis factor α (TNF-α)Thermo Fisher ScientificPHC3015
Vascular endothelial growth factor (VEGF)Thermo Fisher ScientificRVGEFI
Y-27632 ROCK inhibitorSigma AldrichY0350

References

  1. Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. International Journal of Cancer. 136 (5), 359-386 (2015).
  2. Piazuelo, M. B., Epplein, M., Correa, P. Gastric cancer: an infectious disease. Infectious Disease Clinics of North America. 24 (4), 853-869 (2010).
  3. Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. Cancer statistics. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 63 (1), 11-30 (2013).
  4. Quante, M., Wang, T. C. Inflammation and stem cells in gastrointestinal carcinogenesis. Physiology. 23, 350-359 (2008).
  5. Quante, M., Varga, J., Wang, T. C., Greten, F. R. The gastrointestinal tumor microenvironment. Gastroenterology. 145 (1), 63-78 (2013).
  6. Tsai, S., et al. Development of primary human pancreatic cancer organoids, matched stromal and immune cells and 3D tumor microenvironment models. BMC Cancer. 18 (1), 335 (2018).
  7. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  8. Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
  9. Tiriac, H., et al. Successful creation of pancreatic cancer organoids by means of EUS-guided fine-needle biopsy sampling for personalized cancer treatment. Gastrointestinal Endoscopy. 87 (6), 1474-1480 (2018).
  10. Tiriac, H., et al. Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
  11. Yao, Y., et al. Patient-derived organoids predict chemoradiation responses of locally advanced rectal cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
  12. Ahmadzadeh, M., et al. Tumor antigen-specific CD8 T cells infiltrating the tumor express high levels of PD-1 and are functionally impaired. Blood. 114 (8), 1537-1544 (2009).
  13. Chen, Z., et al. Intratumoral CD8(+) cytotoxic lymphocyte is a favorable prognostic marker in node-negative breast cancer. PLoS One. 9 (4), 95475 (2014).
  14. Reissfelder, C., et al. Tumor-specific cytotoxic T lymphocyte activity determines colorectal cancer patient prognosis. Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 739-751 (2015).
  15. Muro, K., et al. Pan-Asian adapted ESMO Clinical Practice Guidelines for the management of patients with metastatic gastric cancer: a JSMO-ESMO initiative endorsed by CSCO, KSMO, MOS, SSO and TOS. Annals of Oncology. 30 (1), 19-33 (2019).
  16. Subhash, V. V., Yeo, M. S., Tan, W. L., Yong, W. P. Strategies and advancements in harnessing the immune system for gastric cancer immunotherapy. Journal of Immunology Research. 2015, 308574 (2015).
  17. Muro, K., et al. Pembrolizumab for patients with PD-L1-positive advanced gastric cancer (KEYNOTE-012): a multicentre, open-label, phase 1b trial. Lancet Oncology. 17 (6), 717-726 (2016).
  18. Abdel-Rahman, O. PD-L1 expression and outcome of advanced melanoma patients treated with anti-PD-1/PD-L1 agents: a meta-analysis. Immunotherapy. 8 (9), 1081-1089 (2016).
  19. Abdel-Rahman, O. Correlation between PD-L1 expression and outcome of NSCLC patients treated with anti-PD-1/PD-L1 agents: A meta-analysis. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 101, 75-85 (2016).
  20. Abdel-Rahman, O. Immune checkpoints aberrations and gastric cancer; assessment of prognostic value and evaluation of therapeutic potentials. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 97, 65-71 (2016).
  21. Dijkstra, K. K., et al. Generation of tumor-reactive T cells by co-culture of peripheral blood lymphocytes and tumor organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
  22. Neal, J. T., et al. Organoid modeling of the tumor immune microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
  23. Peng, C., Liu, J., Yang, G., Li, Y. The tumor-stromal ratio as a strong prognosticator for advanced gastric cancer patients: proposal of a new TSNM staging system. Journal of Gastroenterology. 53 (5), 606-617 (2018).
  24. Steele, N. G., et al. An organoid-based preclinical model of human gastric cancer. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7 (1), 161-184 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

PD L1 PD 1 CD8 T MDSCs

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved