用于预测靶向治疗疗效的临床前人源性自体胃癌类器官/免疫细胞共培养模型

摘要

该方案的目标是使用这种方法 1） 了解免疫抑制性胃肿瘤微环境的作用，以及 2） 预测患者反应的疗效，从而提高患者的存活率。

摘要

表达程序性细胞死亡配体 1 （PD-L1） 的肿瘤与 CD8+ 细胞毒性 T 淋巴细胞 （CTL） 上的程序性细胞死亡蛋白 1 （PD-1） 相互作用，以逃避免疫监视，导致 CTL 增殖、存活和效应功能受到抑制，随后导致癌症持续存在。大约 40% 的胃癌表达 PD-L1，但对免疫治疗的反应率仅为 30%。我们提出了使用人源性自体胃癌类器官/免疫细胞共培养作为临床前模型，可以预测靶向治疗改善癌症患者预后的疗效。尽管已经报道了癌症类器官与免疫细胞共培养，但这种共培养方法使用肿瘤抗原来脉冲抗原呈递的树突状细胞。然后将树突状细胞 （DC） 与患者的 CD8+ T 细胞一起培养，以扩大这些 T 淋巴细胞的溶细胞活性和增殖，然后再共培养。此外，在该共培养系统中研究了培养物中髓源性抑制细胞 （MDSC） 的分化和免疫抑制功能。这种类器官方法可能具有广泛的兴趣，并适用于预测其他癌症（包括胰腺癌）的治疗效果和患者预后。

引言

胃癌是全球第五大最常见的癌症 ¹。幽门螺杆菌 （H. pylori） 的有效诊断和治疗使美国胃癌的发病率较低 ²。然而，被诊断患有这种恶性肿瘤的患者的 5 年生存率仅为 29%，这使得胃癌成为一项重要的医学挑战³。这里介绍的方法的目的是开发一种方法来准确预测个体患者的免疫治疗反应。实体瘤由癌细胞和各种类型的基质细胞、内皮细胞和造血细胞组成，包括巨噬细胞、髓源性抑制细胞 （MDSC） 和淋巴细胞（^{4,5 中已}论述）。癌症干细胞与肿瘤微环境 （TME） 之间的相互作用会严重影响肿瘤特征和患者对治疗的反应。这种方法旨在让研究人员获得临床前药物开发和生物标志物发现的知识，以个性化治疗胃癌。

这里介绍的方法使用胃癌患者产生的人源自体类器官/免疫细胞共培养物来了解 MDSC 的免疫抑制作用。提出的是一个临床前模型，可以预测靶向治疗提高患者生存率的疗效。癌症类器官与免疫细胞共培养已在胰腺癌领域广泛报道 ^6,7,8,9,10。然而，尚未报道这种共培养物可用于研究胃癌。总体而言，该方法证明了自体人源免疫细胞在与癌症类器官相同的基质环境中共培养，从而允许免疫细胞与目标类器官接触。

Tiriac 等人¹⁰ 的研究报告说，对标准护理化疗药物表现出异质反应的患者来源的胰腺癌类器官可以归类为基于类器官的化疗敏感性基因表达特征，可以预测患者对化疗反应的改善。研究人员提出，胰腺癌类器官的分子和治疗分析相结合可以预测临床反应¹⁰。来自 Yao 等人¹¹ 的联合临床试验数据还表明，直肠癌衍生的类器官代表与响应放化疗的患者肿瘤组织相似的病理生理学和遗传变化。因此，在使用这些培养物作为治疗的预测模型时，在患者的免疫细胞和肿瘤免疫表型的背景下使用类器官培养物至关重要。

表达 PD-L1 的肿瘤与 PD-1 相互作用会抑制 CD8+ 细胞毒性 T 淋巴细胞的增殖、存活和效应功能 12,13,14。虽然大约 40% 的胃癌表达 PD-L1，但这些患者中只有 30% 对免疫治疗有反应 15,16,17。抗 PD1 抗体用于胃癌治疗的临床试验 18,19,20。然而，目前还没有临床前模型可以测试每位患者的治疗效果。优化类器官培养，使患者的免疫细胞包含在系统中，将有可能允许对免疫疗法的疗效进行个体化鉴定。

研究方案

获得批准从患者肿瘤中采集人体活检组织（1912208231R001，亚利桑那大学人类受试者保护计划;IRB 协议编号：1099985869R001，亚利桑那大学人类受试者保护计划 TARGHETS）。

1. 从活检中建立患者来源的胃类器官

1. 在 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中，从接受食管胃十二指肠镜检查的胃癌患者的肿瘤区域收集 1-2 mm 的人活检组织（表 1）。
   注意：此后所有程序均应在无菌环境中使用无菌材料和试剂进行。
2. 在培养皿上使用手术刀刀片将活检的组织切碎。将切碎的组织转移到 15 ml 锥形管中，并加入 5-10 mL 的 1x PBS。
3. 在室温下以 300 × g 离心 5 分钟。丢弃上清液。向沉淀组织中加入 1-2 mL 预热的消化缓冲液（表 1）。
4. 在 37 °C 下孵育 15-30 分钟，具体取决于切碎组织的大小。通过在显微镜下每 5-10 分钟观察一次小细胞簇来监测消化状态。
5. 用冷的 Advanced Dulbecco 改良 Eagle 培养基/Ham's F-12 培养基 （Advanced DMEM/F-12） 稀释 5 倍，终止消化。如果可以看到未消化的物质块，请通过 30 μm 过滤器过滤组织。收集流出。
6. 在室温下以 300 × g 离心流出液 5 分钟以沉淀细胞。丢弃上清液。
7. 将沉淀的细胞 （10,000-100,000） 重悬于适当体积 （2-4 mL） 解冻的基底膜基质（参见 材料表）中。以 30-50 μL 细胞基底膜基质滴的形式接种在 24 孔培养板中。
8. 将板在 37 °C 下孵育 15 分钟，以使细胞基底膜基质液滴凝固。用预热的胃类器官培养基覆盖细胞基底膜基质液滴（表 1）。
9. 将类器官培养物维持在 37 °C 和 5% CO₂ 中。根据类器官的生长情况，每 3-4 天用新鲜培养基更换一次培养基。每 7-10 天以 1：3 的比例传代类器官一次。

2. 从手术标本中建立患者来源的胃类器官

1. 在外科手术过程中，在补充有抗生素的 1x Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 中从胃癌患者切除的标本中收集人胃癌组织（表 1）。
   注意：此后的所有程序都应在生物安全柜中进行，保持无菌环境并使用无菌材料和试剂。
2. 在培养皿上使用手术手术刀刀片将切除的组织切碎。用 5-10 mL 含有抗生素的 1x DPBS 洗涤切碎的组织。
3. 将组织转移到 50 mL 锥形管中。向切碎的组织中添加 10 mL 预热的乙二胺四乙酸 （EDTA） 剥离缓冲液。每 5-10 分钟监测一次消化状态。将试管在 37 °C 摇床中孵育 10 分钟。
4. 让组织沉淀在管底部，去除 EDTA 缓冲液而不干扰组织，然后加入 10 mL 新鲜的 EDTA 缓冲液。将试管在 37 °C 摇床中孵育 5 分钟。
5. 让组织沉淀在管子底部。取出 EDTA 缓冲液，用 10 mL 补充有抗生素（无离心机）的高级 DMEM/F-12 洗涤组织两次（按照步骤 2.4）（表 1）。
6. 根据组织大小，向组织中加入 5-10 mL 预热的消化缓冲液（表 1）。将试管在 37 °C 下孵育 15-30 分钟，并轻轻搅拌，具体取决于组织的大小和质地。每 10 分钟在显微镜下检查一次细胞簇的外观。
7. 用冷的 Advanced DMEM/F-12 加抗生素稀释两倍来终止消化。通过 40 μm 过滤器过滤未消化的组织并收集流出物。
8. 在 4 °C 下以 400 × g 离心流通液 5 分钟以沉淀细胞。弃去上清液，并在 4 °C 下用 400 × g 的冷 1x DPBS 加抗生素洗涤细胞 5 分钟。 小心丢弃上清液，并将细胞储存在冰上。
9. 将沉淀的细胞重悬于冰上适当体积的基底膜基质中。在 24 或 12 孔细胞培养处理板中接种 30-50 μL 细胞基底膜基质液滴。
10. 将板在 37 °C 下孵育 15 分钟，以使细胞基底膜基质液滴凝固为圆顶。用预热的胃类器官培养基覆盖细胞基底膜基质圆顶（表 1）。
11. 将类器官培养物保持在 37 °C 和 5% CO₂ 中。根据类器官的生长情况，每 3-4 天用新鲜培养基更换一次培养基。根据类器官密度，每 7-10 天以 1：2 或 1：3 的比例传代类器官一次。

3. 类器官培养物的维持和扩增

注意：所有程序都应在无菌环境中使用无菌材料和试剂进行。

1. 维护和扩展
   1. 将类器官培养物维持 7-10 天，直到它们达到 70-80% 汇合。在冰冷的 DMEM 中收获类器官。将类器官转移到 5 mL 圆底聚苯乙烯管中。
   2. 将类器官在 4 °C 下以 400 × g 离心 5 分钟以沉淀细胞。小心去除上清液，并将沉淀重悬于 1 mL 预热的细胞解离试剂溶液中。将类器官在 37 °C 下孵育 6 分钟。
   3. 轻轻地将类器官通过 26 G 针 4 次。加入 2 mL DMEM 以停止细胞解离试剂的作用。
   4. 将类器官在 4 °C 下以 400 × g 离心 5 分钟以沉淀细胞。小心丢弃上清液并将细胞储存在冰上。
   5. 将沉淀的细胞重悬于冰上适当体积的基底膜基质中。在 24 或 12 孔细胞培养处理板中接种 30-50 μL 细胞基底膜基质滴。
   6. 将板在 37 °C 下孵育 15 分钟，以使细胞基底膜基质液滴凝固为圆顶。用预热的胃类器官培养基覆盖细胞 - 细胞 - 基底膜基质圆顶（见 表 1）。
   7. 将类器官培养物保持在 37 °C 和 5% CO₂ 中。根据类器官的生长情况，每 3-4 天用新鲜培养基更换一次培养基。根据类器官密度，每 7-10 天以 1：2 或 1：3 的比例重复一次类器官传代。
2. 类器官来源细胞系的扩增
   1. 当类器官汇合 70-80% 时收获它们。用胃类器官培养基喂养粘附在塑料板上的细胞，并根据细胞生长情况每 3-4 天喂食一次来维持培养。
   2. 当细胞达到 80-90% 汇合时传代细胞。
      1. 取出培养基，用预热的 DPBS 轻轻洗涤板。加入 1 mL 预热的细胞解离试剂。
      2. 将细胞在 37 °C 下孵育 5 分钟。 在 2 mL DMEM 中收获细胞。
      3. 将细胞在 4 °C 下以 400 × g 离心 5 分钟。 去除上清液并将沉淀重悬于胃类器官培养基或人胃上皮细胞培养基中（表 1）。
   3. 将 3.2.2.3 中的细胞接种在基底膜基质包被或明胶包被的板中。将类器官培养物保持在 37 °C 和 5% CO₂ 中。根据细胞生长情况，每隔一天用新鲜培养基更换培养基。根据细胞密度，每 7-10 天以 1：2 或 1：3 的比例重复细胞传代一次。
      1. 要用基底膜基质包被板，请以 1：10 的比例在冰冷的细胞培养级水中稀释基质。使用细胞涂布器用 1 mL 冰冷的稀释基质溶液均匀涂布板，并将涂布板在 37 °C 下孵育 2 小时。取出剩余的涂层溶液，让板在没有盖子的情况下在生物安全罩内干燥 30 分钟，然后铺板细胞。
      2. 要用明胶涂覆板，请用 1 mL 冰冷的明胶基涂层溶液均匀地涂覆板。将涂层板在室温下孵育 5 分钟。取出剩余的明胶溶液，将重悬的细胞铺板。

4. 从外周血单核细胞 （PBMC） 中培养免疫细胞

注意：所有程序均应在无菌环境中使用无菌材料和试剂进行。

1. PBMC 分离
   1. 用等体积的 1x PBS 稀释全血。
   2. 根据稀释血液样品的总体积，将适当体积的密度梯度介质（参见 材料表）分配到 15 mL 试管中。
      注：建议的比例为 3 mL 密度梯度培养基与 4 mL 稀释血液样品。
   3. 小心地将稀释的血液样品分层到密度梯度介质上。以 400 × g 离心 30 分钟 - 1 小时，无需制动。
   4. 离心后，小心地将界面处的单核细胞转移到新的 15 mL 锥形管中。用 3 体积的 1x PBS 稀释单核细胞。
   5. 以 400 × g 离心 10 分钟。丢弃上清液。重复一次。
   6. 将沉淀的细胞重悬于合适的培养基中用于下游应用，或作为冷冻储备液进行冻存。
   7. 如果需要，使用台盼蓝染料排除测定法测定 PBMC 的产量和细胞活力。
2. 人树突状细胞的培养
   1. 将分离的 PBMC 重悬于 PBMC 培养基中（参见 材料表 和 表 1），并将它们在 24 孔组织培养板中于 37 °C 和 5% CO₂ 中接种 1-2 小时。
   2. 用力敲击培养板，丢弃含有非贴壁细胞的用过的培养基。
   3. 将 DC 培养基（表 1）添加到贴壁细胞中。将培养物在 37 °C 和 5% CO₂ 中维持 3 天。隔天用新鲜培养基替换上清液培养基。
   4. 第 3 天，用新鲜的 DC 成熟培养基替换用完的培养基（表 1）。将培养物在 37 °C 和 5% CO₂ 中维持 24 小时。
3. 人细胞毒性 T 淋巴细胞 （CTL） 的培养
   1. 将 1 mL PBMC 转移到 5 mL 聚苯乙烯圆底管中。
   2. 向 PBMC 中加入 50 μL 富集混合物（参见 材料表），在室温下孵育 10 分钟。
   3. 向样品中加入 150 μL 磁性颗粒（材料表）。在室温下孵育 5 分钟。
   4. 使用细胞分离缓冲液将样品体积增加到 2.5 mL（材料表）。将聚苯乙烯圆底管放入细胞分离磁体（材料表）中 5 分钟，以便进行细胞分离。
   5. 将富集的细胞悬液倒入新的 15 mL 锥形管中。以 300 × g 离心 5 分钟。丢弃上清液。
   6. 重悬沉淀的细胞，并在 CTL 培养基（表 1）中于 37 °C 和 5% CO₂ 中培养 24 小时。
4. 人髓源性抑制细胞 （MDSC） 的培养
   1. 在 MDSC 培养基（表 1）中，在 37 °C 的 5% CO₂ 中培养 PBMC 7 天，以富集 MDSC。隔天用新鲜培养基替换上清液培养基。
5. DC 和 CLL 的共培养
   1. 从类器官培养物中收集条件培养基。
   2. 从成熟的 DC 培养物中轻轻去除 50% 的培养基，并用类器官衍生的条件培养基替换它。
   3. 将 DC 与类器官衍生的条件培养基在 37 °C 和 5% CO₂ 中孵育 2 小时。
   4. 收获松散粘附的 DC，并在 4 °C 下以 300 × g 离心 5 分钟。 去除上清液，将沉淀重悬于 RPMI 共培养基中，然后将该细胞悬液重新加入同一孔中。
   5. 从同一患者系收获 CTL 并将其转移到成熟的 DC。在 37 °C 和 5% CO 2 中继续 DC-CTL 共培养（表 1）72 小时。

5. 建立类器官/免疫细胞共培养

1. 如前面的第 4.3 节所述，使用试剂盒（参见 材料表）从 DC 和 CTL 的共培养物中分离 CTL。
2. 将 CTL 与 5 μM 羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯 （CFSE） 在 37 °C 下孵育 20 分钟。
   注：CFSE 是一种蓝色激光可激发染料，用于细胞分裂的流式细胞术监测。
3. 收获类器官并将它们与 CFSE 标记的 CTL 混合。将 CTL/类器官比率保持在每 200 个类器官 50,000 个 CTL，将类器官重悬于冰上适当体积的解冻基底膜基质中。以 25 μL 细胞基底膜基质滴的形式接种在 24 孔组织培养板中。
   注：对于需要 MDSC 的实验条件，在接种前将 MDSCs 与类器官和 CFSE 标记的 CTL 混合。MDSC/CTL 比率应为 4：1。
4. 将板在 37 °C 下孵育 15 分钟，以使细胞基底膜基质液滴凝固。
5. 用预热的类器官培养基覆盖细胞基底膜基质液滴。
6. 将类器官/免疫细胞共培养物保持在 37 °C 和 5% CO₂ 中直至分析。

结果

完成后，胃类器官通常在包埋后 2-4 天内在孔内显示为球体（图 1）。 图 1A 展示了一种蓬勃发展的胃类器官培养物，它表现出规则的膜。肿瘤类器官通常会表现出患者样本独有的不同形态。不成功的培养物会显得致密或没有表现出组织初始消化的任何生长（图 1B）。健壮且积极生长的培养物将按照方案中...

讨论

我们介绍了人源性自体胃癌类器官/免疫细胞共培养的使用，该共培养可用作临床前模型来预测靶向治疗的疗效，最终改善治疗结果和患者预后。尽管已经报道了癌症类器官与免疫细胞的共培养，但这是这种用于胃癌研究的共培养系统的首次报道。许多其他基于类器官的患者分析工作在多个机构中得到了很好的发展，包括共培养模型。据我们所知，已经开发了三种主要的?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 well plate	Midwest Scientific	92012
15 mL Falcon tube	Fisher scientific	12-565-269
24 well plate	Midwest Scientific	92024
30 μm filters	Miltenyi Biotec	130-041-407
40 μm filters (Fisher Scientific)	Fisher scientific	352340
5 mL round bottom polystyrene tubes	Fisher scientific	14956-3C
50 mL Falcon tube	Fisher scientific	12-565-271
Advanced DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	12634010
AIMV	Thermo Fisher Scientific	12055091	Basal medium for PBMCs and DCs
Amphotericin B/ Gentamicin	Thermo Fisher Scientific	R-01510
B-27 supplement	Thermo Fisher Scientific	12587010
β-mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	800-120
Bone morphogenetic protein inhibitor (Noggin)	Peprotech	250-38
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7906
Cabozantinib	Selleckchem	S1119
Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)	Biolegend	423801
Collagenase A	Sigma Aldrich	C9891
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Fisher scientific	14190-144	cell separation buffer
EasySep Buffer	Stem Cell Technologies	20144	Contains Enrichment Cocktail and Magnetic Particles used in CTL culture
EasySep Human CD8+ T Cell Enrichment Kit	Stem Cell Technologies	19053	cell separation magnet
EasySep Magnet	Stem Cell Technologies	SN12580
EDTA	Sigma Aldrich	E6758
Epidermal Growth Factor (EGF)	Peprotech	315-09
Farma Series 3 Water Jacketed Incubator	Thermo Fisher Scientific	4120
Fetal Calf Serum (FCS)	Atlanta Biologicals	SI2450H
Fibroblast growth factor 10 (FGF-10)	Peprotech	100-26	density gradient medium
Ficoll-Paque	GE Healthcare	171440-02
Gastrin 1	Tocris	30061
Gelatin	Cell Biologics	6950
GM-CSF	Thermo Fisher Scientific	PHC6025
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Thermo Fisher Scientific	14175095
HEPES (2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid)	Fisher scientific	BP299-100
Human Epithelial Cell Basal Medium	Cell Biologics	H6621
human serum AB	Gemini Bioscience	21985023
Hyaluronidase Type IV-S	Sigma Aldrich	H3884
Insulin-Transferrin-Selenium	Thermo Fisher Scientific	41400045
Interleukin 1β (IL-1β)	Thermo Fisher Scientific	RIL1BI
Interleukin 6 (IL-6)	Thermo Fisher Scientific	RIL6I
Interleukin 7 (IL-7)	Thermo Fisher Scientific	RP-8645
Kanamycin	Thermo Fisher Scientific	11815024
L-glutamine	Fisher scientific	350-50-061	basement membrane matrix
Matrigel (Corning Life Sciences, Corning, NY)	Fisher scientific	CB40230C
N-2 supplement	Thermo Fisher Scientific	17502048
N-acetyl-L-cysteine	Sigma Aldrich	A7250
Nicotinamide (Nicotinamide)	Sigma Aldrich	N0636
PD-L1 inhibitor	Selleckchem	A2002
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	SV3000
Petridish	Fisher scientific	07-202-030
Potassium chloride (KCl)	Fisher scientific	18-605-517
Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4)	Fisher scientific	NC0229895
prostaglandin E2 (PGE2)	Sigma Aldrich	P0409
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	11875119
Sodium chloride (NaCl)	Fisher scientific	18-606-419
Sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4)	Fisher scientific	NC0229893	cell dissociation reagent
StemPro Accutase solution	Thermo Fisher Scientific	A1110501
Transforming growth factor beta 1 (TGF-β1)	Thermo Fisher Scientific	7754-BH-005/CF
Tumor necrosis factor α (TNF-α)	Thermo Fisher Scientific	PHC3015
Vascular endothelial growth factor (VEGF)	Thermo Fisher Scientific	RVGEFI
Y-27632 ROCK inhibitor	Sigma Aldrich	Y0350