Un modelo preclínico de cocultivo de organoide y células inmunitarias de cáncer gástrico autólogo derivado del ser humano para predecir la eficacia de las terapias dirigidas

Resumen

Los objetivos del protocolo son utilizar este enfoque para 1) comprender el papel del microambiente del tumor gástrico inmunosupresor y 2) predecir la eficacia de la respuesta del paciente, aumentando así la tasa de supervivencia de los pacientes.

Resumen

Los tumores que expresan el ligando 1 de muerte celular programada (PD-L1) interactúan con la proteína de muerte celular programada 1 (PD-1) en los linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+ para evadir la vigilancia inmunitaria, lo que conduce a la inhibición de la proliferación, la supervivencia y la función efectora de CTL y, posteriormente, la persistencia del cáncer. Aproximadamente el 40% de los cánceres gástricos expresan PD-L1, pero la tasa de respuesta a la inmunoterapia es solo del 30%. Presentamos el uso del cocultivo de organoides y células inmunitarias de cáncer gástrico autólogo de origen humano como modelo preclínico que puede predecir la eficacia de las terapias dirigidas para mejorar el resultado de los pacientes con cáncer. Aunque se han reportado cocultivos de organoides cancerosos con células inmunitarias, este enfoque de cocultivo utiliza antígeno tumoral para pulsar las células dendríticas presentadoras de antígeno. A continuación, las células dendríticas (CD) se cultivan con las células T CD8+ del paciente para ampliar la actividad citolítica y la proliferación de estos linfocitos T antes del cocultivo. Además, se investiga la diferenciación y la función inmunosupresora de las células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) en cultivo dentro de este sistema de cocultivo. Este enfoque de organoides puede ser de amplio interés y apropiado para predecir la eficacia del tratamiento y el resultado del paciente en otros cánceres, incluido el cáncer de páncreas.

Introducción

El cáncer gástrico es el quinto cáncer más común en todo el mundo ¹. El diagnóstico y tratamiento efectivos de Helicobacter pylori (H. pylori) han resultado en una baja incidencia de cáncer gástrico en los Estados Unidos ². Sin embargo, la tasa de supervivencia a 5 años para los pacientes diagnosticados con esta neoplasia maligna es solo del 29%, lo que convierte al cáncer gástrico en un desafío médico importante³. El propósito de los métodos presentados aquí es desarrollar un enfoque para predecir con precisión las respuestas a la inmunoterapia en pacientes individuales. Los tumores sólidos consisten en células cancerosas y varios tipos de células estromalas, endoteliales y hematopoyéticas, como macrófagos, células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) y linfocitos (revisado en ^4,5). Las interacciones entre las células madre cancerosas y el microambiente tumoral (TME, por sus siglas en inglés) tienen un impacto sustancial en las características del tumor y en la respuesta del paciente al tratamiento. Este enfoque se esfuerza por permitir que los investigadores adquieran conocimientos para el desarrollo preclínico de fármacos y el descubrimiento de biomarcadores para el tratamiento personalizado del cáncer gástrico.

El método que se presenta aquí utiliza cocultivos de organoides autólogos/células inmunitarias de origen humano generados a partir de pacientes con cáncer gástrico para comprender el papel inmunosupresor de las MDSC. Se presenta un modelo preclínico que puede predecir la eficacia de las terapias dirigidas para mejorar la supervivencia de los pacientes. Los cocultivos de organoides cancerosos con células inmunitarias han sido ampliamente reportados en el campo del cáncer de páncreas 6,7,8,9,10. Sin embargo, no se ha informado que estos cocultivos estudien el cáncer gástrico. En general, este método demuestra el cocultivo de células inmunitarias autólogas derivadas de humanos dentro del mismo entorno de matriz que los organoides cancerosos, lo que permite que las células inmunitarias estén en contacto con los organoides objetivo.

El estudio de Tiriac et ^al.10 informó que los organoides de cáncer de páncreas derivados de pacientes, que mostraron respuestas heterogéneas a los quimioterapéuticos estándar, podrían agruparse en firmas de expresión génica de quimiosensibilidad basadas en organoides que podrían predecir mejores respuestas de los pacientes a la quimioterapia. Los investigadores propusieron que el perfil molecular y terapéutico combinado de los organoides del cáncer de páncreas puede predecir la respuesta clínica¹⁰. Los datos de los ensayos clínicos de Yao et ^al.11 también mostraron que los organoides derivados del cáncer de recto representan una fisiopatología y cambios genéticos similares a los tejidos tumorales del paciente en respuesta a la quimiorradiación. Por lo tanto, es fundamental que los cultivos de organoides se utilicen en el contexto de las células inmunitarias del paciente y del fenotipo inmunitario tumoral cuando se utilizan estos cultivos como modelos predictivos para la terapia.

Los tumores que expresan PD-L1 y que interactúan con PD-1 inhiben la proliferación, supervivencia y función efectora de los linfocitos T citotóxicos CD8+ 12,13,14. Mientras que aproximadamente el 40% de los cánceres gástricos expresan PD-L1, solo el 30% de estos pacientes responden a la inmunoterapia 15,16,17. Los anticuerpos anti-PD1 se utilizan en ensayos clínicos para el tratamiento del cáncer gástrico 18,19,20. Sin embargo, en la actualidad no existen modelos preclínicos que permitan testear la eficacia terapéutica para cada paciente. La optimización del cultivo de organoides de modo que las células inmunitarias del paciente se incluyan en el sistema permitiría potencialmente la identificación individualizada de la eficacia de la inmunoterapia.

Protocolo

Se obtuvo la aprobación para la recolección de tejidos de biopsia humana de tumores de pacientes (1912208231R001, Programa de Protección de Sujetos Humanos de la Universidad de Arizona; Número de protocolo IRB: 1099985869R001 , Programa de Protección de Sujetos Humanos de la Universidad de Arizona TARGHETS).

1. Establecimiento de organoides gástricos derivados del paciente a partir de biopsias

1. Recolectar 1-2 mm de tejidos de biopsia humana de la región tumoral de pacientes con cáncer gástrico sometidos a gastroduodenoscopia esofágica en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x (Tabla 1).
   NOTA: A partir de ahora, todos los procedimientos deben realizarse en un entorno aséptico utilizando materiales y reactivos estériles.
2. Picar los tejidos de la biopsia con hojas de bisturí en una placa de Petri. Transfiera los pañuelos picados a un tubo cónico de 15 ml y agregue 5-10 mL de 1x PBS.
3. Centrifugar a 300 × g durante 5 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante. Agregue 1-2 mL de tampón de digestión precalentado (Tabla 1) a los pañuelos granulados.
4. Incubar a 37 °C durante 15-30 min, dependiendo del tamaño de los tejidos picados. Controle el estado de la digestión observando bajo el microscopio en busca de grupos de células pequeñas cada 5-10 minutos.
5. Detenga la digestión diluyendo 5 veces con frío Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham F-12 medium (Advanced DMEM/F-12). Si se ven grumos de material no digerido, filtre los tejidos a través de filtros de 30 μm. Recoja el flujo continuo.
6. Centrifugar el flujo a 300 × g durante 5 min a temperatura ambiente para peletizar las células. Deseche el sobrenadante.
7. Vuelva a suspender las células peletizadas (10.000-100.000) en un volumen adecuado (2-4 mL) de matriz de membrana basal descongelada (véase la Tabla de Materiales) en hielo. Siembra como 30-50 μL de matriz de membrana basal de células en placas de cultivo de 24 pocillos.
8. Incubar las placas a 37 °C durante 15 min para permitir que las gotas de la matriz de la membrana basal celular se solidifiquen. Superponga las gotas de la matriz de la membrana basal celular con medio de cultivo de organoides gástricos precalentado (Tabla 1).
9. Mantener los cultivos de organoides a 37 °C en 5% de CO₂. Reemplace el medio de cultivo con medio fresco cada 3-4 días, dependiendo del crecimiento del organoide. Pase los organoides una vez cada 7-10 días en una proporción de 1:3.

2. Establecimiento de organoides gástricos derivados del paciente a partir de muestras quirúrgicas

1. Recolecte tejidos de cáncer gástrico humano de muestras resecadas de pacientes con cáncer gástrico durante procedimientos quirúrgicos en solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco suplementada con antibióticos (Tabla 1).
   NOTA: Todos los procedimientos a partir de ahora deben procesarse en una cabina de bioseguridad, manteniendo un entorno aséptico y utilizando materiales y reactivos estériles.
2. Picar los tejidos resecados con hojas de bisturí quirúrgico en una placa de Petri. Lave los pañuelos picados con 5-10 mL de 1x DPBS que contenga antibióticos.
3. Transfiera el tejido a un tubo cónico de 50 mL. Agregue 10 mL de tampón de extracción de ácido etilendiaminérgico tetraacético (EDTA) precalentado a los tejidos picados. Controlar el estado de la digestión cada 5-10 min. Incubar el tubo en un agitador a 37 °C durante 10 min.
4. Deje que los tejidos se asienten en el fondo del tubo, retire el tampón EDTA sin alterar los tejidos y agregue 10 ml de tampón EDTA fresco. Incubar el tubo en un agitador a 37 °C durante 5 min.
5. Deje que los pañuelos se asienten en el fondo del tubo. Retire el tampón EDTA y lave los tejidos dos veces (siga el paso 2.4) con 10 mL de DMEM/F-12 avanzado suplementado con antibióticos (sin centrífuga) (Tabla 1).
6. Agregue 5-10 mL de tampón de digestión precalentado (Tabla 1) a los tejidos, dependiendo del tamaño del tejido. Incubar el tubo a 37 °C durante 15-30 min con una leve agitación, dependiendo del tamaño y la textura de los tejidos. Verifique la apariencia de grupos de células bajo un microscopio cada 10 minutos.
7. Detenga la digestión diluyendo dos veces con DMEM/F-12 avanzado frío más antibióticos. Filtre los tejidos no digeridos a través de filtros de 40 μm y recoja el flujo a través.
8. Centrifugar el flujo a 400 × g durante 5 min a 4 °C para granular las células. Deseche el sobrenadante y lave las células con 1x DPBS frío más antibióticos a 400 × g durante 5 min a 4 °C. Deseche con cuidado el sobrenadante y guarde las células en hielo.
9. Vuelva a suspender las células peletizadas en un volumen adecuado de la matriz de la membrana basal en hielo. Siembra gotas de matriz de membrana basal celular de 30-50 μL en placas tratadas con cultivo celular de 24 o 12 pocillos.
10. Incubar las placas a 37 °C durante 15 min para permitir que las gotas de la matriz de la membrana basal de la célula se solidifiquen como una cúpula. Superponga la cúpula de la matriz de la membrana basal celular con un medio de cultivo de organoide gástrico precalentado (Tabla 1).
11. Mantener los cultivos de organoides a 37 °C en 5% de CO₂. Reemplace el medio de cultivo con medio fresco cada 3-4 días, dependiendo del crecimiento del organoide. Pase los organoides una vez cada 7-10 días en una proporción de 1:2 o 1:3, según la densidad del organoide.

3. Mantenimiento y expansión de cultivos de organoides

NOTA: Todos los procedimientos deben realizarse en un entorno aséptico utilizando materiales y reactivos estériles.

1. Mantenimiento y ampliación
   1. Mantenga los cultivos de organoides durante 7-10 días hasta que tengan un 70-80% de confluente. Coseche los organoides en DMEM helado. Transfiera los organoides a tubos de poliestireno de fondo redondo de 5 mL.
   2. Centrifugar los organoides a 400 × g durante 5 min a 4 °C para granular las células. Retire con cuidado el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 1 ml de solución reactiva de disociación celular precalentada. Incubar los organoides a 37 °C durante 6 min.
   3. Pase suavemente los organoides a través de una aguja de 26 G 4 veces. Añadir 2 mL de DMEM para detener la acción del reactivo de disociación celular.
   4. Centrifugar los organoides a 400 × g durante 5 min a 4 °C para granular las células. Deseche con cuidado el sobrenadante y guarde las células en hielo.
   5. Vuelva a suspender las células peletizadas en un volumen adecuado de matriz de membrana basal sobre hielo. Siembra 30-50 μL de la matriz de la membrana basal de la célula en placas tratadas con cultivo celular de 24 o 12 pocillos.
   6. Incubar las placas a 37 °C durante 15 min para permitir que las gotas de la matriz de la membrana basal de la célula se solidifiquen como una cúpula. Superponga la cúpula de la matriz de la membrana basal de la célula con un medio de cultivo de organoides gástricos precalentado (ver Tabla 1).
   7. Mantener los cultivos de organoides a 37 °C en 5% de CO₂. Reemplace el medio de cultivo con medio fresco cada 3-4 días, dependiendo del crecimiento del organoide. Repita el paso de los organoides una vez cada 7-10 días en una proporción de 1:2 o 1:3, según la densidad de organoides.
2. Expansión de líneas celulares derivadas de organoides
   1. Coseche los organoides cuando estén 70-80% confluentes. Alimente las células adheridas a las placas de plástico con medio de cultivo de organoides gástricos y mantenga el cultivo alimentándolas cada 3-4 días dependiendo del crecimiento celular.
   2. Pasa las células cuando alcanzan el 80-90% de confluencia.
      1. Retire el medio de cultivo y lave suavemente la placa con DPBS precalentado. Añadir 1 mL de reactivo de disociación celular precalentado.
      2. Incubar las células durante 5 min a 37 °C. Coseche las células en 2 mL de DMEM.
      3. Centrifugar las células a 400 × g durante 5 min a 4 °C. Retirar el sobrenadante y resuspender el pellet en medio de cultivo de organoides gástricos o en medio de cultivo de células epiteliales gástricas humanas (Tabla 1).
   3. Coloque las células de 3.2.2.3 en placas recubiertas de matriz de membrana basal o recubiertas de gelatina. Mantener los cultivos de organoides a 37 °C en 5% de CO₂. Reemplace el medio con medio fresco cada dos días dependiendo del crecimiento celular. Repita el paso de las células una vez cada 7-10 días en una proporción de 1:2 o 1:3, según la densidad de las células.
      1. Para recubrir las placas con matriz de membrana basal, diluya la matriz en agua helada de grado de cultivo celular en una proporción de 1:10. Cubra uniformemente la placa con 1 mL de solución de matriz diluida helada utilizando un esparcidor de células e incube la placa recubierta a 37 °C durante 2 h. Retire la solución de recubrimiento restante y deje que la placa se seque sin la tapa dentro de la campana de bioseguridad durante 30 minutos, justo antes de colocar las celdas.
      2. Para cubrir las placas con gelatina, cubra uniformemente la placa con 1 ml de una solución de recubrimiento a base de gelatina helada. Incubar la placa recubierta a temperatura ambiente durante 5 min. Retire la solución de gelatina restante y coloque las células resuspendidas.

4. Cultivo de células inmunitarias a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC)

NOTA: Todos los procedimientos deben realizarse en un entorno aséptico utilizando materiales y reactivos estériles.

1. Aislamiento de PBMC
   1. Diluya la sangre entera con un volumen igual de 1x PBS.
   2. Dependiendo del volumen total de la muestra de sangre diluida, dispense un volumen apropiado de medio de gradiente de densidad (consulte la Tabla de materiales) en un tubo de 15 mL.
      NOTA: La proporción recomendada es de 3 mL del medio de gradiente de densidad por 4 mL de la muestra de sangre diluida.
   3. Coloque cuidadosamente la muestra de sangre diluida en capas sobre el medio de gradiente de densidad. Centrífuga a 400 × g durante 30 min-1 h sin freno.
   4. Después de la centrifugación, transfiera con cuidado las celdas mononucleares en la interfaz a un nuevo tubo cónico de 15 mL. Diluir las células mononucleares con 3 volúmenes de 1x PBS.
   5. Centrifugar a 400 × g durante 10 min. Deseche el sobrenadante. Repita una vez.
   6. Vuelva a suspender las células peletizadas en un medio apropiado para aplicaciones posteriores o criopreservar como existencias congeladas.
   7. Si es necesario, determine el rendimiento y la viabilidad celular de las PBMC mediante el ensayo de exclusión de colorante azul de tripano.
2. Cultivo de células dendríticas humanas
   1. Vuelva a suspender las PBMC aisladas en medio PBMC (consulte la Tabla de Materiales y la Tabla 1) y póngalas en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos durante 1-2 h a 37 °C con CO₂ al 5%.
   2. Golpee firmemente la placa de cultivo y deseche el medio de cultivo gastado que contenga células no adherentes.
   3. Añadir el medio de cultivo DC (Tabla 1) a las células adherentes. Mantener los cultivos durante 3 días a 37 °C en 5% de CO₂. Reemplace el medio sobrenadante con medio de cultivo fresco en días alternos.
   4. En el día 3, reemplace el medio agotado con un medio de maduración de CC fresco (Tabla 1). Mantener los cultivos durante 24 h a 37 °C en 5% de CO₂.
3. Cultivo de linfocitos T citotóxicos humanos (CTL)
   1. Transfiera 1 mL de PBMC a un tubo de poliestireno de fondo redondo de 5 mL.
   2. Agregue 50 μL de Cóctel de Enriquecimiento (consulte la Tabla de Materiales) a los PBMC. Incube durante 10 minutos a temperatura ambiente.
   3. Añadir 150 μL de partículas magnéticas (tabla de materiales) a la muestra. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
   4. Aumente el volumen de la muestra a 2,5 mL con el tampón de separación celular (Tabla de Materiales). Coloque el tubo de poliestireno de fondo redondo en un imán de separación de células (Tabla de materiales) durante 5 minutos para permitir la separación de células.
   5. Vierta la suspensión celular enriquecida en un nuevo tubo cónico de 15 mL. Centrifugar a 300 × g durante 5 min. Deseche el sobrenadante.
   6. Resuspender las células peletizadas y el cultivo en medio de cultivo CTL (Tabla 1) durante 24 h a 37 °C en CO₂ al 5%.
4. Cultivo de células supresoras derivadas de mieloides humanos (MDSC)
   1. Cultivo de PBMCs en medio de cultivo MDSC (Tabla 1) durante 7 días a 37 °C en 5% de CO₂ para enriquecer para MDSCs. Reemplace el medio sobrenadante con medio de cultivo fresco en días alternos.
5. Co-cultura de DC y CTL
   1. Recoja el medio acondicionado de los cultivos de organoides.
   2. Retire suavemente el 50% del medio del cultivo DC maduro y reemplácelo con medio acondicionado derivado de organoides.
   3. Incubar las CD con el medio acondicionado derivado de organoides durante 2 h a 37 °C en 5% de CO₂.
   4. Coseche las CC poco adherentes y centrifuérrelas a 300 × g durante 5 min a 4 °C. Retire el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en el medio de cocultivo RPMI y vuelva a agregar esta suspensión celular en el mismo pocillo.
   5. Recolectar las CTLs de la misma línea de pacientes y transferirlas a las CD maduras. Continuar el cocultivo DC-CTL (Tabla 1) durante 72 h a 37 °C en 5% de CO2.

5. Establecimiento de cocultivos de organoides/células inmunitarias

1. Aísle las CTL de los cocultivos de DC y CTL utilizando un kit (consulte la Tabla de materiales) como se describe anteriormente en la sección 4.3.
2. Incubar los CTLs con 5 μM de éster de succinimidil diacetato de carboxifluoresceína (CFSE) a 37 °C durante 20 min.
   NOTA: CFSE es un tinte excitable por láser azul que se utiliza para el monitoreo citométrico de flujo de divisiones celulares.
3. Coseche los organoides y mézclelos con CTL marcados con CFSE. Manteniendo la relación CTL/organoide en 50,000 CTL por cada 200 organoides, vuelva a suspender los organoides en un volumen apropiado de matriz de membrana basal descongelada en hielo. Siembra como gotas de matriz de membrana basal celular de 25 μL en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos.
   NOTA: Para condiciones experimentales que requieran MDSC, mezcle las MDSC con los organoides y los CTL marcados con CFSE antes de sembrar. La relación MDSC/CTL debe ser de 4:1.
4. Incubar las placas a 37 °C durante 15 min para permitir que las gotas de la matriz de la membrana basal celular se solidifiquen.
5. Superponga las gotas de la matriz de la membrana basal celular con un medio de cultivo de organoides precalentado.
6. Mantener los cocultivos de organoides/células inmunitarias a 37 °C con 5% de CO₂ hasta el análisis.

Resultados

Cuando se completan, los organoides gástricos aparecen como esferas dentro del pocillo, generalmente dentro de los 2 a 4 días posteriores a la inclusión (Figura 1). La Figura 1A muestra un próspero cultivo de organoides gástricos que exhibe una membrana regular. Los organoides tumorales a menudo exhiben una morfología divergente que es única para la muestra del paciente. Los cultivos no exitosos parecerán densos o no exh...

Discusión

Presentamos el uso del cocultivo de organoides y células inmunitarias de cáncer gástrico autólogo derivado en humanos que puede utilizarse como modelo preclínico para predecir la eficacia de las terapias dirigidas y, en última instancia, mejorar el resultado del tratamiento y el pronóstico del paciente. Aunque se han reportado co-cultivos de organoides cancerosos con células inmunes, este es el primer reporte de un sistema de co-cultivo de este tipo para el estudio del cáncer g?...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 well plate	Midwest Scientific	92012
15 mL Falcon tube	Fisher scientific	12-565-269
24 well plate	Midwest Scientific	92024
30 μm filters	Miltenyi Biotec	130-041-407
40 μm filters (Fisher Scientific)	Fisher scientific	352340
5 mL round bottom polystyrene tubes	Fisher scientific	14956-3C
50 mL Falcon tube	Fisher scientific	12-565-271
Advanced DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	12634010
AIMV	Thermo Fisher Scientific	12055091	Basal medium for PBMCs and DCs
Amphotericin B/ Gentamicin	Thermo Fisher Scientific	R-01510
B-27 supplement	Thermo Fisher Scientific	12587010
β-mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	800-120
Bone morphogenetic protein inhibitor (Noggin)	Peprotech	250-38
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7906
Cabozantinib	Selleckchem	S1119
Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)	Biolegend	423801
Collagenase A	Sigma Aldrich	C9891
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Fisher scientific	14190-144	cell separation buffer
EasySep Buffer	Stem Cell Technologies	20144	Contains Enrichment Cocktail and Magnetic Particles used in CTL culture
EasySep Human CD8+ T Cell Enrichment Kit	Stem Cell Technologies	19053	cell separation magnet
EasySep Magnet	Stem Cell Technologies	SN12580
EDTA	Sigma Aldrich	E6758
Epidermal Growth Factor (EGF)	Peprotech	315-09
Farma Series 3 Water Jacketed Incubator	Thermo Fisher Scientific	4120
Fetal Calf Serum (FCS)	Atlanta Biologicals	SI2450H
Fibroblast growth factor 10 (FGF-10)	Peprotech	100-26	density gradient medium
Ficoll-Paque	GE Healthcare	171440-02
Gastrin 1	Tocris	30061
Gelatin	Cell Biologics	6950
GM-CSF	Thermo Fisher Scientific	PHC6025
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Thermo Fisher Scientific	14175095
HEPES (2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid)	Fisher scientific	BP299-100
Human Epithelial Cell Basal Medium	Cell Biologics	H6621
human serum AB	Gemini Bioscience	21985023
Hyaluronidase Type IV-S	Sigma Aldrich	H3884
Insulin-Transferrin-Selenium	Thermo Fisher Scientific	41400045
Interleukin 1β (IL-1β)	Thermo Fisher Scientific	RIL1BI
Interleukin 6 (IL-6)	Thermo Fisher Scientific	RIL6I
Interleukin 7 (IL-7)	Thermo Fisher Scientific	RP-8645
Kanamycin	Thermo Fisher Scientific	11815024
L-glutamine	Fisher scientific	350-50-061	basement membrane matrix
Matrigel (Corning Life Sciences, Corning, NY)	Fisher scientific	CB40230C
N-2 supplement	Thermo Fisher Scientific	17502048
N-acetyl-L-cysteine	Sigma Aldrich	A7250
Nicotinamide (Nicotinamide)	Sigma Aldrich	N0636
PD-L1 inhibitor	Selleckchem	A2002
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	SV3000
Petridish	Fisher scientific	07-202-030
Potassium chloride (KCl)	Fisher scientific	18-605-517
Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4)	Fisher scientific	NC0229895
prostaglandin E2 (PGE2)	Sigma Aldrich	P0409
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	11875119
Sodium chloride (NaCl)	Fisher scientific	18-606-419
Sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4)	Fisher scientific	NC0229893	cell dissociation reagent
StemPro Accutase solution	Thermo Fisher Scientific	A1110501
Transforming growth factor beta 1 (TGF-β1)	Thermo Fisher Scientific	7754-BH-005/CF
Tumor necrosis factor α (TNF-α)	Thermo Fisher Scientific	PHC3015
Vascular endothelial growth factor (VEGF)	Thermo Fisher Scientific	RVGEFI
Y-27632 ROCK inhibitor	Sigma Aldrich	Y0350