Un modello preclinico di co-coltura di organoidi/cellule immunitarie di carcinoma gastrico autologo di derivazione umana per prevedere l'efficacia delle terapie mirate

Riepilogo

Gli obiettivi del protocollo sono di utilizzare questo approccio per 1) comprendere il ruolo del microambiente del tumore gastrico immunosoppressivo e 2) prevedere l'efficacia della risposta del paziente, aumentando così il tasso di sopravvivenza dei pazienti.

Abstract

I tumori che esprimono il ligando 1 della morte cellulare programmata (PD-L1) interagiscono con la proteina 1 della morte cellulare programmata (PD-1) sui linfociti T citotossici (CTL) CD8+ per eludere la sorveglianza immunitaria portando all'inibizione della proliferazione, della sopravvivenza e della funzione effettrice dei CTL e, di conseguenza, alla persistenza del cancro. Circa il 40% dei tumori gastrici esprime PD-L1, ma il tasso di risposta all'immunoterapia è solo del 30%. Presentiamo l'uso della co-coltura di organoidi/cellule immunitarie di carcinoma gastrico autologo di derivazione umana come modello preclinico che può prevedere l'efficacia di terapie mirate per migliorare l'esito dei pazienti oncologici. Sebbene siano state riportate co-colture di organoidi tumorali con cellule immunitarie, questo approccio di co-coltura utilizza l'antigene tumorale per pulsare le cellule dendritiche presentanti l'antigene. Le cellule dendritiche (DC) vengono quindi coltivate con le cellule T CD8+ del paziente per espandere l'attività citolitica e la proliferazione di questi linfociti T prima della co-coltura. Inoltre, all'interno di questo sistema di co-coltura vengono studiate la differenziazione e la funzione immunosoppressiva delle cellule soppressore di derivazione mieloide (MDSC) in coltura. Questo approccio organoidrico può essere di ampio interesse e appropriato per prevedere l'efficacia della terapia e l'esito del paziente in altri tumori, incluso il cancro del pancreas.

Introduzione

Il cancro gastrico è il quinto tumore più comune in tutto il mondo ¹. La diagnosi e il trattamento efficaci dell'Helicobacter pylori (H. pylori) hanno portato a una bassa incidenza di cancro gastrico negli Stati Uniti ². Tuttavia, il tasso di sopravvivenza a 5 anni per i pazienti con diagnosi di questo tumore maligno è solo del 29%, rendendo il cancro gastrico un'importante sfida medica³. Lo scopo dei metodi qui presentati è quello di sviluppare un approccio per prevedere con precisione le risposte all'immunoterapia nei singoli pazienti. I tumori solidi sono costituiti da cellule tumorali e vari tipi di cellule stromali, endoteliali ed ematopoietiche, inclusi macrofagi, cellule soppressori di derivazione mieloide (MDSC) e linfociti (rivisti in ^4,5). Le interazioni tra le cellule staminali tumorali e il microambiente tumorale (TME) hanno un impatto sostanziale sulle caratteristiche del tumore e sulla risposta del paziente al trattamento. Questo approccio mira a consentire ai ricercatori di acquisire conoscenze per lo sviluppo preclinico di farmaci e la scoperta di biomarcatori per il trattamento personalizzato del cancro gastrico.

Il metodo qui presentato utilizza co-colture di organoidi autologhi/cellule immunitarie di derivazione umana generate da pazienti con carcinoma gastrico per comprendere il ruolo immunosoppressivo delle MDSC. Viene presentato un modello preclinico che può prevedere l'efficacia delle terapie mirate per migliorare la sopravvivenza dei pazienti. Le co-colture di organoidi tumorali con cellule immunitarie sono state ampiamente riportate nel campo del cancro del pancreas 6,7,8,9,10. Tuttavia, tali co-colture non sono state riportate per studiare il cancro gastrico. Nel complesso, questo metodo dimostra la co-coltura di cellule immunitarie autologhe di derivazione umana all'interno dello stesso ambiente di matrice degli organoidi tumorali, consentendo così alle cellule immunitarie di essere in contatto con gli organoidi bersaglio.

Lo studio di Tiriac et ^al.10 ha riportato che gli organoidi del cancro del pancreas derivati da pazienti, che hanno mostrato risposte eterogenee ai chemioterapici standard di cura, potrebbero essere raggruppati in firme di espressione genica della chemiosensibilità basate su organoidi che potrebbero prevedere una migliore risposta dei pazienti alla chemioterapia. I ricercatori hanno proposto che la profilazione molecolare e terapeutica combinata degli organoidi del cancro del pancreas possa predire la risposta clinica¹⁰. I dati degli studi co-clinici di Yao et ^al.11 hanno anche mostrato che gli organoidi derivati dal cancro del retto presentano una fisiopatologia simile e cambiamenti genetici simili ai tessuti tumorali del paziente in risposta alla chemioradioterapia. Pertanto, è fondamentale che le colture di organoidi vengano utilizzate nel contesto delle cellule immunitarie del paziente e del fenotipo immunitario tumorale quando si utilizzano queste colture come modelli predittivi per la terapia.

I tumori che esprimono PD-L1 che interagiscono con PD-1 inibiscono la proliferazione, la sopravvivenza e la funzione effettrice dei linfociti T citotossici CD8+ 12,13,14. Mentre circa il 40% dei tumori gastrici esprime PD-L1, solo il 30% di questi pazienti risponde all'immunoterapia 15,16,17. Gli anticorpi anti-PD1 sono utilizzati negli studi clinici per il trattamento del cancro gastrico 18,19,20. Tuttavia, attualmente non esistono modelli preclinici che consentano di testare l'efficacia terapeutica per ciascun paziente. Ottimizzare la coltura di organoidi in modo tale che le cellule immunitarie del paziente siano incluse nel sistema consentirebbe potenzialmente l'identificazione individualizzata dell'efficacia dell'immunoterapia.

Protocollo

È stata ottenuta l'approvazione per la raccolta di tessuti sottoposti a biopsia umana da tumori di pazienti (1912208231R001, Programma di protezione dei soggetti umani dell'Università dell'Arizona; Numero di protocollo IRB: 1099985869R001, Programma di protezione dei soggetti umani dell'Università dell'Arizona TARGHETS).

1. Determinazione di organoidi gastrici derivati da pazienti da biopsie

1. Raccogliere 1-2 mm di tessuti umani sottoposti a biopsia dalla regione tumorale di pazienti con carcinoma gastico sottoposti a gastro-duodenoscopia esofagea in soluzione salina tamponata con fosfato 1x (PBS) (Tabella 1).
   NOTA: Tutte le procedure d'ora in poi devono essere condotte in un ambiente asettico utilizzando materiali e reagenti sterili.
2. Tritare i tessuti sottoposti a biopsia utilizzando lame di bisturi su una piastra di Petri. Trasferire i fazzoletti tritati in una provetta conica da 15 ml e aggiungere 5-10 ml di 1x PBS.
3. Centrifugare a 300 × g per 5 min a temperatura ambiente. Scartare il surnatante. Aggiungere 1-2 mL di tampone di digestione preriscaldato (Tabella 1) ai tessuti pellettati.
4. Incubare a 37 °C per 15-30 minuti, a seconda delle dimensioni dei tessuti tritati. Monitora lo stato della digestione guardando al microscopio alla ricerca di piccoli gruppi di cellule ogni 5-10 minuti.
5. Fermare la digestione diluendo 5 volte con il freddo Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 medium (Advanced DMEM/F-12). Se sono visibili grumi di materiale non digerito, filtrare i tessuti attraverso filtri da 30 μm. Raccogli il flusso.
6. Centrifugare il flusso a 300 × g per 5 minuti a temperatura ambiente per pellettare le celle. Scartare il surnatante.
7. Risospendere le cellule pellettate (10.000-100.000) in un volume appropriato (2-4 mL) di matrice di membrana basale scongelata (vedere la Tabella dei materiali) su ghiaccio. Seme sotto forma di gocce di matrice di membrana cellulo-basale da 30-50 μL in piastre di coltura a 24 pozzetti.
8. Incubare le piastre a 37 °C per 15 minuti per consentire alle gocce della matrice della membrana cellulare-basale di solidificarsi. Sovrapporre le gocce della matrice della membrana cellulo-basale con un terreno di coltura di organoidi gastrici preriscaldato (Tabella 1).
9. Mantenere le colture di organoidi a 37 °C in CO₂ al 5%. Sostituire il terreno di coltura con terreno fresco ogni 3-4 giorni, a seconda della crescita dell'organoide. Passaggio degli organoidi una volta ogni 7-10 giorni in rapporto 1:3.

2. Determinazione di organoidi gastrici derivati da pazienti da campioni chirurgici

1. Raccogliere tessuti di cancro gastrico umano da campioni resecati di pazienti con cancro gastrico durante le procedure chirurgiche in 1x soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) integrata con antibiotici (Tabella 1).
   NOTA: Tutte le procedure riportate di seguito devono essere elaborate in una cappa di biosicurezza, mantenendo un ambiente asettico e utilizzando materiali e reagenti sterili.
2. Tritare i tessuti resecati utilizzando lame di bisturi chirurgici su una piastra di Petri. Lavare i fazzoletti tritati con 5-10 ml di 1x DPBS contenente antibiotici.
3. Trasferire il tessuto in una provetta conica da 50 mL. Aggiungere 10 mL di tampone di stripping dell'acido etilendiammina tetraacetico (EDTA) preriscaldato ai tessuti tritati. Monitorare lo stato della digestione ogni 5-10 minuti. Incubare la provetta in un agitatore a 37 °C per 10 minuti.
4. Lasciare che i tessuti si depositino sul fondo della provetta, rimuovere il tampone EDTA senza disturbare i tessuti e aggiungere 10 ml di tampone EDTA fresco. Incubare la provetta in un agitatore a 37 °C per 5 minuti.
5. Lascia che i fazzoletti si depositino sul fondo del tubo. Rimuovere il tampone EDTA e lavare i tessuti due volte (seguire il passaggio 2.4) con 10 mL di DMEM/F-12 avanzato integrato con antibiotici (senza centrifuga) (Tabella 1).
6. Aggiungere 5-10 ml di tampone di digestione preriscaldato (Tabella 1) ai tessuti, a seconda delle dimensioni del tessuto. Incubare la provetta a 37 °C per 15-30 minuti con una leggera agitazione, a seconda delle dimensioni e della consistenza dei tessuti. Controllare la comparsa di ammassi cellulari al microscopio ogni 10 minuti.
7. Fermare la digestione diluendo due volte con il DMEM/F-12 avanzato a freddo più antibiotici. Filtrare i tessuti non digeriti attraverso filtri da 40 μm e raccogliere il flusso.
8. Centrifugare il flusso continuo a 400 × g per 5 minuti a 4 °C per pellettare le cellule. Eliminare il surnatante e lavare le cellule con 1x DPBS freddo più antibiotici a 400 × g per 5 minuti a 4 °C. Scartare con cura il surnatante e conservare le cellule nel ghiaccio.
9. Risospendere le cellule pellettate in un volume appropriato della matrice della membrana basale su ghiaccio. Seminare 30-50 μL di matrice di membrana cellule-basale in piastre trattate con colture cellulari a 24 o 12 pozzetti.
10. Incubare le piastre a 37 °C per 15 minuti per consentire alle gocce della matrice della membrana cellulare-basale di solidificarsi come una cupola. Sovrapporre la cupola della matrice della membrana cellule-basale con un terreno di coltura di organoidi gastrici preriscaldato (Tabella 1).
11. Mantenere le colture di organoidi a 37 °C in CO₂ al 5%. Sostituire il terreno di coltura con terreno fresco ogni 3-4 giorni, a seconda della crescita dell'organoide. Passaggio degli organoidi una volta ogni 7-10 giorni in rapporto 1:2 o 1:3, in base alla densità dell'organoide.

3. Mantenimento ed espansione delle colture di organoidi

NOTA : Tutte le procedure devono essere eseguite in un ambiente asettico utilizzando materiali e reagenti sterili.

1. Manutenzione ed espansione
   1. Mantenere le colture di organoidi per 7-10 giorni fino a quando non sono confluenti al 70-80%. Raccogli gli organoidi in DMEM ghiacciato. Trasferire gli organoidi in provette di polistirene a fondo tondo da 5 mL.
   2. Centrifugare gli organoidi a 400 × g per 5 minuti a 4 °C in celle a pellet. Rimuovere con cautela il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di soluzione di reagente di dissociazione cellulare preriscaldata. Incubare gli organoidi a 37 °C per 6 min.
   3. Passare delicatamente gli organoidi attraverso un ago da 26 G per 4 volte. Aggiungere 2 mL di DMEM per arrestare l'azione del reagente di dissociazione cellulare.
   4. Centrifugare gli organoidi a 400 × g per 5 minuti a 4 °C per pellettare le cellule. Scartare con cura il surnatante e conservare le cellule in ghiaccio.
   5. Risospendere le cellule pellettate in un volume appropriato di matrice di membrana basale su ghiaccio. Seminare 30-50 μL di matrice della membrana cellulare-basale in piastre trattate con colture cellulari a 24 o 12 pozzetti.
   6. Incubare le piastre a 37 °C per 15 minuti per consentire alle gocce della matrice della membrana cellulare-basale di solidificarsi come una cupola. Sovrapporre la cupola della matrice della membrana cellula-cellula-basale con terreno di coltura di organoidi gastrici preriscaldato (vedi Tabella 1).
   7. Mantenere le colture di organoidi a 37 °C in CO₂ al 5%. Sostituire il terreno di coltura con terreno fresco ogni 3-4 giorni, a seconda della crescita dell'organoide. Ripetere il passaggio degli organoidi una volta ogni 7-10 giorni in un rapporto 1:2 o 1:3, in base alla densità dell'organoide.
2. Espansione di linee cellulari derivate da organoidi
   1. Raccogli gli organoidi quando sono confluenti al 70-80%. Nutrire le cellule aderenti alle piastre di plastica con terreno di coltura organoide gastrico e mantenere la coltura somministrandole ogni 3-4 giorni a seconda della crescita cellulare.
   2. Passaggio delle celle quando raggiungono l'80-90% di confluenza.
      1. Rimuovere il terreno di coltura e lavare delicatamente la piastra con DPBS preriscaldato. Aggiungere 1 mL di reagente di dissociazione cellulare preriscaldato.
      2. Incubare le cellule per 5 minuti a 37 °C. Raccogliere le cellule in 2 mL di DMEM.
      3. Centrifugare le celle a 400 × g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in un terreno di coltura di organoidi gastrici o in un terreno di coltura di cellule epiteliali gastriche umane (Tabella 1).
   3. Placcare le celle del punto 3.2.2.3 in piastre rivestite di matrice a membrana basale o rivestite di gelatina. Mantenere le colture di organoidi a 37 °C in CO₂ al 5%. Sostituire il terreno con terreno fresco a giorni alterni a seconda della crescita cellulare. Ripetere il passaggio delle cellule una volta ogni 7-10 giorni in un rapporto 1:2 o 1:3, in base alla densità cellulare.
      1. Per rivestire le piastre con la matrice della membrana basale, diluire la matrice in acqua di coltura cellulare ghiacciata in rapporto 1:10. Rivestire uniformemente la piastra con 1 mL di soluzione di matrice diluita a freddo ghiacciato utilizzando uno spandiconcime e incubare la piastra rivestita a 37 °C per 2 ore. Rimuovere la soluzione di rivestimento rimanente e lasciare asciugare la piastra senza il coperchio all'interno della cappa di biosicurezza per 30 minuti, subito prima di placcare le cellule.
      2. Per rivestire le piastre con gelatina, rivestire uniformemente la piastra con 1 mL di una soluzione di rivestimento a base di gelatina ghiacciata. Incubare la piastra rivestita a temperatura ambiente per 5 minuti. Rimuovere la soluzione di gelatina rimanente e piastrare le cellule risospese.

4. Coltura di cellule immunitarie da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC)

NOTA: Tutte le procedure devono essere eseguite in un ambiente asettico utilizzando materiali e reagenti sterili.

1. Isolamento PBMC
   1. Diluire il sangue intero con un volume uguale di 1x PBS.
   2. A seconda del volume totale del campione di sangue diluito, erogare un volume appropriato di terreno a gradiente di densità (vedere la Tabella dei materiali) in una provetta da 15 mL.
      NOTA: Il rapporto raccomandato è di 3 mL del mezzo di gradiente di densità per 4 mL del campione di sangue diluito.
   3. Sovrapporre con cura il campione di sangue diluito sul mezzo del gradiente di densità. Centrifugare a 400 × g per 30 min-1 h senza freno.
   4. Dopo la centrifugazione, trasferire con cura le cellule mononucleate all'interfaccia in una nuova provetta conica da 15 mL. Diluire le cellule mononucleate con 3 volumi di 1x PBS.
   5. Centrifugare a 400 × g per 10 min. Scartare il surnatante. Ripeti una volta.
   6. Risospendere le celle pellettate in un mezzo appropriato per applicazioni a valle o crioconservare come scorte congelate.
   7. Se necessario, determinare la resa e la vitalità cellulare delle PBMC utilizzando il saggio di esclusione del colorante blu di tripano.
2. Coltura di cellule dendritiche umane
   1. Risospendere le PBMC isolate in terreno PBMC (vedere la Tabella dei materiali e la Tabella 1) e piastrle in una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti per 1-2 ore a 37 °C in CO₂ al 5%.
   2. Picchiettare con decisione la piastra di coltura ed eliminare il terreno di coltura esaurito contenente cellule non aderenti.
   3. Aggiungere il terreno di coltura DC (Tabella 1) alle cellule aderenti. Mantenere le colture per 3 giorni a 37 °C in CO₂ al 5%. Sostituire il terreno surnatante con terreno di coltura fresco a giorni alterni.
   4. Il giorno 3, sostituire il terreno esausto con un mezzo di maturazione DC fresco (Tabella 1). Mantenere le colture per 24 ore a 37 °C al 5% di CO₂.
3. Coltura di linfociti T citotossici umani (CTL)
   1. Trasferire 1 mL di PBMC in una provetta a fondo tondo in polistirene da 5 mL.
   2. Aggiungere 50 μl di cocktail di arricchimento (vedere la tabella dei materiali) ai PBMC. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
   3. Aggiungere 150 μl di particelle magnetiche (tabella dei materiali) al campione. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
   4. Aumentare il volume del campione a 2,5 mL con il tampone di separazione cellulare (Tabella dei materiali). Posizionare il tubo di polistirene a fondo tondo in un magnete di separazione cellulare (Tabella dei materiali) per 5 minuti per consentire la separazione cellulare.
   5. Versare la sospensione cellulare arricchita in una nuova provetta conica da 15 mL. Centrifugare a 300 × g per 5 min. Scartare il surnatante.
   6. Risospendere le cellule pellettate e la coltura in terreno di coltura CTL (Tabella 1) per 24 ore a 37 °C in CO₂ al 5%.
4. Coltura di cellule soppressori umane di derivazione mieloide (MDSC)
   1. Coltura di PBMC in terreno di coltura MDSC (Tabella 1) per 7 giorni a 37 °C in CO₂ al 5% per arricchirle per MDSC. Sostituire il terreno surnatante con terreno di coltura fresco a giorni alterni.
5. Co-coltura di DC e CTL
   1. Raccogliere il terreno condizionato dalle colture di organoidi.
   2. Rimuovere delicatamente il 50% del terreno dalla coltura DC matura e sostituirlo con un terreno condizionato derivato da organoidi.
   3. Incubare le DC con il terreno condizionato derivato da organoidi per 2 ore a 37 °C in CO₂ al 5%.
   4. Raccogliere i DC poco aderenti e centrifugarli a 300 × g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante, risospendere il pellet nel terreno di co-coltura RPMI e aggiungere nuovamente questa sospensione cellulare nello stesso pozzetto.
   5. Prelevare i CTL dalla stessa linea di pazienti e trasferirli alle DC mature. Continuare la co-coltura DC-CTL (Tabella 1) per 72 ore a 37 °C in CO2 al 5%.

5. Stabilire co-colture organoidi/cellule immunitarie

1. Isolare i CTL da co-colture di DC e CTL utilizzando un kit (vedere la Tabella dei materiali) come descritto in precedenza nel paragrafo 4.3.
2. Incubare i CTL con 5 μM di carbossifluoresceina diacetato succinimidil estere (CFSE) a 37 °C per 20 minuti.
   NOTA: CFSE è un colorante eccitabile laser blu utilizzato per il monitoraggio citofluorimetrico delle divisioni cellulari.
3. Raccogliere gli organoidi e mescolarli con CTL marcati con CFSE. Mantenendo il rapporto CTL/organoide a 50.000 CTL per 200 organoidi, risospendere gli organoidi in un volume appropriato di matrice di membrana basale scongelata su ghiaccio. Seme sotto forma di gocce da 25 μL di matrice di membrana cellulo-basale in piastre di coltura tissutale a 24 pozzetti.
   NOTA: Per le condizioni sperimentali che richiedono MDSC, mescolare gli MDSC con gli organoidi e i CTL marcati con CFSE prima della semina. Il rapporto MDSC/CTL dovrebbe essere 4:1.
4. Incubare le piastre a 37 °C per 15 minuti per consentire alle gocce della matrice della membrana cellulare-basale di solidificarsi.
5. Sovrapporre le gocce di matrice della membrana cellule-basale con terreno di coltura organoidico preriscaldato.
6. Mantenere le co-colture organoide/cellule immunitarie a 37 °C in CO₂ al 5% fino all'analisi.

Risultati

Una volta completati, gli organoidi gastrici appaiono come sfere all'interno del pozzetto, in genere entro 2-4 giorni dall'inclusione (Figura 1). La Figura 1A mostra una fiorente coltura di organoidi gastrici che presenta una membrana regolare. Gli organoidi tumorali mostrano spesso una morfologia divergente che è unica per il campione del paziente. Le colture non riuscite appariranno dense o non mostreranno alcuna crescita dal...

Discussione

Presentiamo l'uso di una co-coltura di organoidi/cellule immunitarie di carcinoma gastrico autologo di derivazione umana che può essere utilizzata come modello preclinico per prevedere l'efficacia di terapie mirate per migliorare in ultima analisi l'esito del trattamento e la prognosi del paziente. Sebbene siano state riportate co-colture di organoidi tumorali con cellule immunitarie, questo è il primo rapporto di un tale sistema di co-coltura per lo studio del cancro gastrico. Numeros...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 well plate	Midwest Scientific	92012
15 mL Falcon tube	Fisher scientific	12-565-269
24 well plate	Midwest Scientific	92024
30 μm filters	Miltenyi Biotec	130-041-407
40 μm filters (Fisher Scientific)	Fisher scientific	352340
5 mL round bottom polystyrene tubes	Fisher scientific	14956-3C
50 mL Falcon tube	Fisher scientific	12-565-271
Advanced DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	12634010
AIMV	Thermo Fisher Scientific	12055091	Basal medium for PBMCs and DCs
Amphotericin B/ Gentamicin	Thermo Fisher Scientific	R-01510
B-27 supplement	Thermo Fisher Scientific	12587010
β-mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	800-120
Bone morphogenetic protein inhibitor (Noggin)	Peprotech	250-38
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7906
Cabozantinib	Selleckchem	S1119
Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)	Biolegend	423801
Collagenase A	Sigma Aldrich	C9891
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Fisher scientific	14190-144	cell separation buffer
EasySep Buffer	Stem Cell Technologies	20144	Contains Enrichment Cocktail and Magnetic Particles used in CTL culture
EasySep Human CD8+ T Cell Enrichment Kit	Stem Cell Technologies	19053	cell separation magnet
EasySep Magnet	Stem Cell Technologies	SN12580
EDTA	Sigma Aldrich	E6758
Epidermal Growth Factor (EGF)	Peprotech	315-09
Farma Series 3 Water Jacketed Incubator	Thermo Fisher Scientific	4120
Fetal Calf Serum (FCS)	Atlanta Biologicals	SI2450H
Fibroblast growth factor 10 (FGF-10)	Peprotech	100-26	density gradient medium
Ficoll-Paque	GE Healthcare	171440-02
Gastrin 1	Tocris	30061
Gelatin	Cell Biologics	6950
GM-CSF	Thermo Fisher Scientific	PHC6025
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Thermo Fisher Scientific	14175095
HEPES (2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid)	Fisher scientific	BP299-100
Human Epithelial Cell Basal Medium	Cell Biologics	H6621
human serum AB	Gemini Bioscience	21985023
Hyaluronidase Type IV-S	Sigma Aldrich	H3884
Insulin-Transferrin-Selenium	Thermo Fisher Scientific	41400045
Interleukin 1β (IL-1β)	Thermo Fisher Scientific	RIL1BI
Interleukin 6 (IL-6)	Thermo Fisher Scientific	RIL6I
Interleukin 7 (IL-7)	Thermo Fisher Scientific	RP-8645
Kanamycin	Thermo Fisher Scientific	11815024
L-glutamine	Fisher scientific	350-50-061	basement membrane matrix
Matrigel (Corning Life Sciences, Corning, NY)	Fisher scientific	CB40230C
N-2 supplement	Thermo Fisher Scientific	17502048
N-acetyl-L-cysteine	Sigma Aldrich	A7250
Nicotinamide (Nicotinamide)	Sigma Aldrich	N0636
PD-L1 inhibitor	Selleckchem	A2002
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	SV3000
Petridish	Fisher scientific	07-202-030
Potassium chloride (KCl)	Fisher scientific	18-605-517
Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4)	Fisher scientific	NC0229895
prostaglandin E2 (PGE2)	Sigma Aldrich	P0409
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	11875119
Sodium chloride (NaCl)	Fisher scientific	18-606-419
Sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4)	Fisher scientific	NC0229893	cell dissociation reagent
StemPro Accutase solution	Thermo Fisher Scientific	A1110501
Transforming growth factor beta 1 (TGF-β1)	Thermo Fisher Scientific	7754-BH-005/CF
Tumor necrosis factor α (TNF-α)	Thermo Fisher Scientific	PHC3015
Vascular endothelial growth factor (VEGF)	Thermo Fisher Scientific	RVGEFI
Y-27632 ROCK inhibitor	Sigma Aldrich	Y0350