Un modèle préclinique de co-culture autologue de cancer gastrique dérivé de l’homme et de cellules immunitaires pour prédire l’efficacité des thérapies ciblées

Résumé

Les objectifs du protocole sont d’utiliser cette approche pour 1) comprendre le rôle du microenvironnement de la tumeur gastrique immunosuppressive et 2) prédire l’efficacité de la réponse des patients, augmentant ainsi le taux de survie des patients.

Résumé

Les tumeurs exprimant le ligand de mort cellulaire programmée 1 (-L1) interagissent avec la protéine de mort cellulaire programmée 1 (-1) sur les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) CD8+ pour échapper à la surveillance immunitaire, ce qui conduit à l’inhibition de la prolifération, de la survie et de la fonction effectrice des CTL, et par conséquent à la persistance du cancer. Environ 40 % des cancers gastriques expriment-L1, mais le taux de réponse à l’immunothérapie n’est que de 30 %. Nous présentons l’utilisation de la co-culture d’organoïdes et de cellules immunitaires autologues du cancer gastrique d’origine humaine comme modèle préclinique qui pourrait prédire l’efficacité des thérapies ciblées pour améliorer l’issue des patients atteints de cancer. Bien que des co-cultures d’organoïdes cancéreux avec des cellules immunitaires aient été signalées, cette approche de co-culture utilise l’antigène tumoral pour pulser les cellules dendritiques présentatrices d’antigène. Les cellules dendritiques (DC) sont ensuite cultivées avec les lymphocytes T CD8+ du patient afin d’augmenter l’activité cytolytique et la prolifération de ces lymphocytes T avant la co-culture. De plus, la différenciation et la fonction immunosuppressive des cellules suppressives dérivées de myéloïdes (MDSC) en culture sont étudiées dans le cadre de ce système de co-culture. Cette approche organoïde peut être d’un grand intérêt et appropriée pour prédire l’efficacité du traitement et l’issue du patient dans d’autres cancers, y compris le cancer du pancréas.

Introduction

Le cancer de l’estomac est le cinquième cancer le plus fréquent dans le monde ¹. Le diagnostic et le traitement efficaces d’Helicobacter pylori (H. pylori) ont entraîné une faible incidence de cancer gastrique aux États-Unis ². Cependant, le taux de survie à 5 ans des patients diagnostiqués avec cette tumeur maligne n’est que de 29 %, ce qui fait du cancer gastrique un défi médical important³. L’objectif des méthodes présentées ici est de développer une approche permettant de prédire avec précision les réponses d’immunothérapie chez les patients individuels. Les tumeurs solides sont constituées de cellules cancéreuses et de divers types de cellules stromales, endothéliales et hématopoïétiques, y compris les macrophages, les cellules suppressives dérivées de myéloïdes (MDSC) et les lymphocytes (examiné dans ^4,5). Les interactions entre les cellules souches cancéreuses et le microenvironnement tumoral (TME) ont un impact substantiel sur les caractéristiques de la tumeur et la réponse du patient au traitement. Cette approche vise à permettre aux chercheurs d’acquérir des connaissances pour le développement préclinique de médicaments et la découverte de biomarqueurs pour le traitement personnalisé du cancer gastrique.

La méthode présentée ici utilise des co-cultures autologues d’organoïdes et de cellules immunitaires dérivées de l’homme générées à partir de patients atteints d’un cancer gastrique pour comprendre le rôle immunosuppresseur des MDSC. Des co-cultures d’organoïdes cancéreux avec des cellules immunitaires ont été largement rapportées dans le domaine du cancer du pancréas 6,7,8,9,10. Cependant, de telles co-cultures n’ont pas été signalées pour étudier le cancer gastrique. Dans l’ensemble, cette méthode démontre la co-culture de cellules immunitaires autologues dérivées de l’homme dans le même environnement matriciel que les organoïdes cancéreux, permettant ainsi aux cellules immunitaires d’être en contact avec les organoïdes cibles.

L’étude de Tiriac et ^al.10 a rapporté que les organoïdes du cancer du pancréas dérivés de patients, qui présentaient des réponses hétérogènes aux chimiothérapies standard, pouvaient être regroupés en signatures d’expression génique de chimiosensibilité basées sur les organoïdes qui pouvaient prédire l’amélioration des réponses des patients à la chimiothérapie. Les chercheurs ont proposé que le profilage moléculaire et thérapeutique combiné des organoïdes du cancer du pancréas puisse prédire la réponse clinique¹⁰. Les données d’essais cocliniques de Yao et ^al.11 ont également montré que les organoïdes dérivés du cancer du rectum représentent une physiopathologie similaire et des changements génétiques similaires aux tissus tumoraux du patient en réponse à la chimioradiothérapie. Ainsi, il est fondamental que les cultures d’organoïdes soient utilisées dans le contexte des cellules immunitaires du patient et du phénotype immunitaire tumoral lors de l’utilisation de ces cultures comme modèles prédictifs pour la thérapie.

Les tumeurs exprimant-L1 qui interagissent avec-1 inhibent la prolifération, la survie et la fonction effectrice des lymphocytes T cytotoxiques CD8+ 12,13,14. Alors qu’environ 40 % des cancers gastriques expriment-L1, seuls 30 % de ces patients répondent à l’immunothérapie 15,16,17. Les anticorps anti-PD1 sont utilisés dans les essais cliniques pour le traitement du cancer gastrique 18,19,20. Cependant, il n’existe actuellement aucun modèle préclinique permettant de tester l’efficacité thérapeutique pour chaque patient. L’optimisation de la culture d’organoïdes de manière à ce que les cellules immunitaires du patient soient incluses dans le système permettrait potentiellement d’identifier individualisément l’efficacité de l’immunothérapie.

Protocole

L’approbation a été obtenue pour la collecte de tissus biopsiés par l’homme à partir de tumeurs de patients (1912208231R001, Programme de protection des sujets humains de l’Université de l’Arizona ; Numéro de protocole IRB : 1099985869R001 , Programme de protection des sujets humains de l’Université de l’Arizona TARGHETS).

1. Établir des organoïdes gastriques dérivés de patients à partir de biopsies

1. Prélever 1 à 2 mm de tissus humains biopsiés dans la région tumorale de patients atteints d’un cancer gastique subissant une gastro-duodénoscopie œsophagienne dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1x (Tableau 1).
   REMARQUE : Toutes les procédures doivent désormais être effectuées dans un environnement aseptique en utilisant des matériaux et des réactifs stériles.
2. Émincez les tissus biopsiés à l’aide de lames de scalpel sur une boîte de Pétri. Transférez les mouchoirs hachés dans un tube conique de 15 ml et ajoutez 5 à 10 ml de 1x PBS.
3. Centrifuger à 300 × g pendant 5 min à température ambiante. Jetez le surnageant. Ajouter 1 à 2 ml de tampon de digestion préchauffé (tableau 1) aux tissus granulés.
4. Incuber à 37 °C pendant 15 à 30 min, selon la taille des tissus hachés. Surveillez l’état de la digestion en regardant au microscope pour détecter de petits amas de cellules toutes les 5 à 10 minutes.
5. Arrêtez la digestion en diluant 5 fois avec du médium froid Advanced Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Ham’s F-12 medium (Advanced DMEM/F-12). Si des amas de matière non digérée sont visibles, filtrez les tissus à travers des filtres de 30 μm. Récupérez le flux continu.
6. Centrifuger le flux à 300 × g pendant 5 min à température ambiante pour granuler les cellules. Jetez le surnageant.
7. Remettre en suspension les cellules granulées (10 000 à 100 000) dans un volume approprié (2 à 4 ml) de matrice de membrane basale décongelée (voir le tableau des matériaux) sur de la glace. Les graines se déposent sous forme de matrice de membrane cellule-basale de 30 à 50 μL dans des plaques de culture à 24 puits.
8. Incuber les plaques à 37 °C pendant 15 minutes pour permettre à la matrice de la membrane cellule-socle de se solidifier. Superposer les gouttes de la matrice de la membrane basale cellulaire avec un milieu de culture organoïde gastrique préchauffé (tableau 1).
9. Maintenir les cultures d’organoïdes à 37 °C dans 5 % de CO₂. Remplacez le milieu de culture par un milieu frais tous les 3-4 jours, en fonction de la croissance des organoïdes. Passez les organoïdes une fois tous les 7 à 10 jours dans un rapport de 1 : 3.

2. Établir des organoïdes gastriques dérivés de patients à partir d’échantillons chirurgicaux

1. Prélever des tissus de cancer gastrique humain à partir d’échantillons réséqués de patients atteints de cancer gastrique lors d’interventions chirurgicales dans 1 solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) complétée par des antibiotiques (tableau 1).
   REMARQUE : Toutes les procédures ci-après doivent être traitées dans une enceinte de biosécurité, en maintenant un environnement aseptique et en utilisant des matériaux et des réactifs stériles.
2. Émincez les tissus réséqués à l’aide de lames de scalpel chirurgicaux sur une boîte de Pétri. Lavez les mouchoirs hachés avec 5 à 10 ml de 1 DPBS contenant des antibiotiques.
3. Transférez le tissu dans un tube conique de 50 ml. Ajouter 10 ml de tampon de décapage préchauffé à l’acide éthylènediamine tétraacétique (EDTA) sur les tissus hachés. Surveillez l’état de la digestion toutes les 5 à 10 minutes. Incuber le tube dans un agitateur à 37 °C pendant 10 min.
4. Laissez les tissus se déposer au fond du tube, retirez le tampon EDTA sans déranger les tissus et ajoutez 10 ml de tampon EDTA frais. Incuber le tube dans un agitateur à 37 °C pendant 5 min.
5. Laissez les tissus se déposer au fond du tube. Retirer le tampon EDTA et laver les mouchoirs deux fois (suivre l’étape 2.4) avec 10 mL de DMEM/F-12 avancé complété par des antibiotiques (pas de centrifugeuse) (tableau 1).
6. Ajouter 5 à 10 ml de tampon de digestion préchauffé (tableau 1) dans les tissus, selon la taille des tissus. Incuber le tube à 37 °C pendant 15 à 30 minutes en agitant légèrement, en fonction de la taille et de la texture des tissus. Vérifiez l’apparence des amas de cellules au microscope toutes les 10 minutes.
7. Arrêtez la digestion en diluant deux fois avec du DMEM avancé / F-12 froid plus des antibiotiques. Filtrez les tissus non digérés à travers des filtres de 40 μm et collectez le flux.
8. Centrifuger le flux à 400 × g pendant 5 min à 4 °C pour granuler les cellules. Jetez le surnageant et lavez les cellules avec du DPBS froid 1x plus des antibiotiques à 400 × g pendant 5 min à 4 °C. Jetez soigneusement le surnageant et conservez les cellules sur de la glace.
9. Remettre en suspension les cellules granulées dans un volume approprié de la matrice de la membrane basale sur de la glace. La matrice de membrane cellule-basale de 30 à 50 μL de semences est déposée dans des plaques traitées pour culture cellulaire à 24 ou 12 puits.
10. Incuber les plaques à 37 °C pendant 15 minutes pour permettre aux gouttes de matrice de la membrane cellule-socle de se solidifier en forme de dôme. Recouvrir le dôme de la matrice de la membrane cellule-socle avec un milieu de culture organoïde gastrique préchauffé (tableau 1).
11. Maintenir les cultures d’organoïdes à 37 °C dans 5 % de CO₂. Remplacez le milieu de culture par un milieu frais tous les 3-4 jours, en fonction de la croissance des organoïdes. Passez les organoïdes une fois tous les 7 à 10 jours dans un rapport de 1:2 ou 1:3, en fonction de la densité des organoïdes.

3. Maintien et expansion des cultures d’organoïdes

REMARQUE : Toutes les procédures doivent être effectuées dans un environnement aseptique à l’aide de matériaux et de réactifs stériles.

1. Maintenance et agrandissement
   1. Maintenez les cultures d’organoïdes pendant 7 à 10 jours jusqu’à ce qu’elles soient confluentes à 70-80 %. Récoltez les organoïdes dans du DMEM glacé. Transférez les organoïdes dans des tubes de polystyrène à fond rond de 5 ml.
   2. Centrifuger les organoïdes à 400 × g pendant 5 min à 4 °C pour les granuler les cellules. Retirer délicatement le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 1 mL de solution de réactif de dissociation cellulaire préchauffée. Incuber les organoïdes à 37 °C pendant 6 min.
   3. Passez doucement les organoïdes à travers une aiguille de 26 G 4 fois. Ajouter 2 mL de DMEM pour arrêter l’action du réactif de dissociation cellulaire.
   4. Centrifuger les organoïdes à 400 × g pendant 5 min à 4 °C pour granuler les cellules. Jetez soigneusement le surnageant et conservez les cellules sur de la glace.
   5. Remettre en suspension les cellules granulées dans un volume approprié de matrice de membrane basale sur de la glace. Des graines de 30 à 50 μL de la matrice de la membrane basale cellulaire tombent dans des plaques traitées à 24 ou 12 puits traitées par culture cellulaire.
   6. Incuber les plaques à 37 °C pendant 15 minutes pour permettre aux gouttes de matrice de la membrane cellule-socle de se solidifier en forme de dôme. Recouvrir le dôme de la matrice de la membrane cellule-basale avec un milieu de culture organoïde gastrique préchauffé (voir le tableau 1).
   7. Maintenir les cultures d’organoïdes à 37 °C dans 5 % de CO₂. Remplacez le milieu de culture par un milieu frais tous les 3-4 jours, en fonction de la croissance des organoïdes. Répétez le passage des organoïdes une fois tous les 7 à 10 jours dans un rapport de 1:2 ou 1:3, en fonction de la densité des organoïdes.
2. Expansion de lignées cellulaires dérivées d’organoïdes
   1. Récoltez les organoïdes lorsqu’ils sont confluents à 70-80 %. Nourrissez les cellules adhérentes aux plaques en plastique avec un milieu de culture organoïde gastrique et maintenez la culture en les nourrissant tous les 3-4 jours en fonction de la croissance cellulaire.
   2. Passez les cellules lorsqu’elles atteignent 80-90 % de confluence.
      1. Retirez le milieu de culture et lavez délicatement la plaque avec du DPBS préchauffé. Ajouter 1 mL de réactif de dissociation cellulaire préchauffé.
      2. Incuber les cellules pendant 5 min à 37 °C. Récoltez les cellules dans 2 mL de DMEM.
      3. Centrifuger les cellules à 400 × g pendant 5 min à 4 °C. Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans un milieu de culture d’organoïdes gastriques ou de cellules épithéliales gastriques humaines (tableau 1).
   3. Plaquez les cellules de 3.2.2.3 soit dans des plaques recouvertes d’une matrice à membrane basale, soit dans des plaques recouvertes de gélatine. Maintenir les cultures d’organoïdes à 37 °C dans 5 % de CO₂. Remplacez le milieu par un milieu frais tous les deux jours en fonction de la croissance cellulaire. Répétez le passage des cellules une fois tous les 7 à 10 jours dans un rapport de 1:2 ou 1:3, en fonction de la densité cellulaire.
      1. Pour recouvrir les plaques d’une matrice de membrane basale, diluez la matrice dans de l’eau glacée de qualité culture cellulaire dans un rapport de 1:10. Enduire uniformément la plaque avec 1 mL de solution matricielle diluée glacée à l’aide d’un épandeur de cellules et incuber la plaque revêtue à 37 °C pendant 2 h. Retirez la solution d’enrobage restante et laissez sécher la plaque sans le couvercle à l’intérieur du capot de biosécurité pendant 30 min, juste avant de plaquer les cellules.
      2. Pour enrober les plaques de gélatine, enduire uniformément 1 mL d’une solution d’enrobage à base de gélatine glacée. Incuber la plaque revêtue à température ambiante pendant 5 min. Retirez la solution de gélatine restante et plaquez les cellules remises en suspension.

4. Culture de cellules immunitaires à partir de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC)

REMARQUE : Toutes les procédures doivent être effectuées dans un environnement aseptique à l’aide de matériaux et de réactifs stériles.

1. Isolation PBMC
   1. Diluez le sang total avec un volume égal de 1x PBS.
   2. En fonction du volume total de l’échantillon de sang dilué, verser un volume approprié de milieu à gradient de densité (voir le tableau des matériaux) dans un tube de 15 ml.
      REMARQUE : Le rapport recommandé est de 3 mL du milieu à gradient de densité pour 4 mL de l’échantillon de sang dilué.
   3. Superposez soigneusement l’échantillon de sang dilué sur le milieu à gradient de densité. Centrifugeuse à 400 × g pendant 30 min-1 h sans frein.
   4. Après la centrifugation, transférez soigneusement les cellules mononucléées à l’interface dans un nouveau tube conique de 15 ml. Diluer les cellules mononucléées avec 3 volumes de 1x PBS.
   5. Centrifugeuse à 400 × g pendant 10 min. Jetez le surnageant. Répétez l’opération une fois.
   6. Remettre en suspension les cellules granulées dans un milieu approprié pour les applications en aval ou cryoconserver sous forme de stocks congelés.
   7. Au besoin, déterminer le rendement et la viabilité cellulaire des PBMC à l’aide de l’essai d’exclusion du colorant bleu de trypan.
2. Culture de cellules dendritiques humaines
   1. Remettre en suspension les PBMC isolés dans un milieu PBMC (voir le tableau des matériaux et le tableau 1) et les mettre en plaque dans une plaque de culture tissulaire à 24 puits pendant 1 à 2 h à 37 °C dans 5 % de CO₂.
   2. Tapotez fermement la plaque de culture et jetez le milieu de culture épuisé contenant des cellules non adhérentes.
   3. Ajouter le milieu de culture DC (Tableau 1) aux cellules adhérentes. Maintenir les cultures pendant 3 jours à 37 °C dans 5 % de CO₂. Remplacer le milieu surnageant par un milieu de culture frais un jour sur deux.
   4. Le jour 3, remplacez le milieu épuisé par un milieu de maturation DC frais (Tableau 1). Maintenir les cultures pendant 24 h à 37 °C avec 5 % de CO₂.
3. Culture de lymphocytes T cytotoxiques humains (CTL)
   1. Transvasez 1 mL de PBMC dans un tube à fond rond en polystyrène de 5 mL.
   2. Ajouter 50 μL de Cocktail d’enrichissement (voir le Tableau des matières) dans les PBMC. Incuber pendant 10 min à température ambiante.
   3. Ajouter 150 μL de particules magnétiques (tableau des matériaux) à l’échantillon. Incuber 5 min à température ambiante.
   4. Augmentez le volume de l’échantillon à 2,5 mL avec le tampon de séparation des cellules (Table des matériaux). Placez le tube à fond rond en polystyrène dans un aimant de séparation de cellules (Table des matériaux) pendant 5 minutes pour permettre la séparation des cellules.
   5. Versez la suspension cellulaire enrichie dans un nouveau tube conique de 15 ml. Centrifuger à 300 × g pendant 5 min. Jetez le surnageant.
   6. Remettre en suspension les cellules granulées et la culture dans un milieu de culture CTL (tableau 1) pendant 24 h à 37 °C avec 5 % de CO₂.
4. Culture de cellules suppressives dérivées de myéloïdes humaines (MDSC)
   1. Cultiver des PBMC dans un milieu de culture MDSC (tableau 1) pendant 7 jours à 37 °C dans 5 % de CO₂ à enrichir pour les MDSC. Remplacer le milieu surnageant par un milieu de culture frais tous les deux jours.
5. Co-culture de DC et de CTL
   1. Prélever du milieu conditionné dans les cultures d’organoïdes.
   2. Retirez délicatement 50 % du milieu de la culture DC mature et remplacez-le par un milieu conditionné dérivé d’organoïdes.
   3. Incuber les DC avec le milieu conditionné dérivé d’organoïdes pendant 2 h à 37 °C dans 5 % de CO₂.
   4. Récoltez les DC faiblement adhérents et centrifugez-les à 300 × g pendant 5 min à 4 °C. Retirez le surnageant, remettez la pastille en suspension dans le milieu de co-culture RPMI et rajoutez cette suspension cellulaire dans le même puits.
   5. Récolter les CTL de la même lignée de patients et les transférer dans les DC matures. Poursuivre la co-culture DC-CTL (tableau 1) pendant 72 h à 37 °C avec 5 % de CO2.

5. Établir des co-cultures de cellules organoïdes/immunitaires

1. Isoler les CTL à partir de co-cultures de DC et de CTL à l’aide d’une trousse (voir le tableau des matériaux) comme décrit précédemment à la section 4.3.
2. Incuber les CTL avec 5 μM de diacétate de carboxyfluorescéine ester succinimidylique (CFSE) à 37 °C pendant 20 min.
   REMARQUE : Le CFSE est un colorant excitable au laser bleu utilisé pour la surveillance cytométrique en flux des divisions cellulaires.
3. Récoltez les organoïdes et mélangez-les avec des CTL marqués CFSE. En maintenant le rapport CTL/organoïde à 50 000 CTL pour 200 organoïdes, remettez les organoïdes en suspension dans un volume approprié de matrice de membrane basale décongelée sur de la glace. Les graines se présentent sous forme de matrice de membrane cellule-basale de 25 μL dans des plaques de culture tissulaire à 24 puits.
   REMARQUE : Pour les conditions expérimentales nécessitant des MDSC, mélanger les MDSC avec les organoïdes et les CTL marqués CFSE avant l’ensemencement. Le rapport MDSC/CTL doit être de 4:1.
4. Incuber les plaques à 37 °C pendant 15 minutes pour permettre à la matrice de la membrane cellule-socle de se solidifier.
5. Superposez les gouttes de matrice de la membrane cellule-socle avec un milieu de culture organoïde préchauffé.
6. Maintenir les co-cultures de cellules organoïdes/immunitaires à 37 °C dans 5 % de CO₂ jusqu’à l’analyse.

Résultats

Une fois terminés, les organoïdes gastriques apparaissent sous forme de sphères dans le puits, généralement dans les 2 à 4 jours suivant l’intégration (Figure 1). La figure 1A montre une culture d’organoïdes gastriques florissante qui présente une membrane régulière. Les organoïdes tumoraux présentent souvent une morphologie divergente qui est unique à l’échantillon du patient. Les cultures infructueuses app...

Discussion

Nous présentons l’utilisation de la co-culture d’organoïdes et de cellules immunitaires autologues du cancer gastrique d’origine humaine qui peut être utilisée comme modèle préclinique pour prédire l’efficacité des thérapies ciblées afin d’améliorer les résultats du traitement et le pronostic du patient. Bien que des co-cultures d’organoïdes cancéreux avec des cellules immunitaires aient été rapportées, il s’agit du premier rapport d’un tel système de co...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 well plate	Midwest Scientific	92012
15 mL Falcon tube	Fisher scientific	12-565-269
24 well plate	Midwest Scientific	92024
30 μm filters	Miltenyi Biotec	130-041-407
40 μm filters (Fisher Scientific)	Fisher scientific	352340
5 mL round bottom polystyrene tubes	Fisher scientific	14956-3C
50 mL Falcon tube	Fisher scientific	12-565-271
Advanced DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	12634010
AIMV	Thermo Fisher Scientific	12055091	Basal medium for PBMCs and DCs
Amphotericin B/ Gentamicin	Thermo Fisher Scientific	R-01510
B-27 supplement	Thermo Fisher Scientific	12587010
β-mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	800-120
Bone morphogenetic protein inhibitor (Noggin)	Peprotech	250-38
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7906
Cabozantinib	Selleckchem	S1119
Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)	Biolegend	423801
Collagenase A	Sigma Aldrich	C9891
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Fisher scientific	14190-144	cell separation buffer
EasySep Buffer	Stem Cell Technologies	20144	Contains Enrichment Cocktail and Magnetic Particles used in CTL culture
EasySep Human CD8+ T Cell Enrichment Kit	Stem Cell Technologies	19053	cell separation magnet
EasySep Magnet	Stem Cell Technologies	SN12580
EDTA	Sigma Aldrich	E6758
Epidermal Growth Factor (EGF)	Peprotech	315-09
Farma Series 3 Water Jacketed Incubator	Thermo Fisher Scientific	4120
Fetal Calf Serum (FCS)	Atlanta Biologicals	SI2450H
Fibroblast growth factor 10 (FGF-10)	Peprotech	100-26	density gradient medium
Ficoll-Paque	GE Healthcare	171440-02
Gastrin 1	Tocris	30061
Gelatin	Cell Biologics	6950
GM-CSF	Thermo Fisher Scientific	PHC6025
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Thermo Fisher Scientific	14175095
HEPES (2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid)	Fisher scientific	BP299-100
Human Epithelial Cell Basal Medium	Cell Biologics	H6621
human serum AB	Gemini Bioscience	21985023
Hyaluronidase Type IV-S	Sigma Aldrich	H3884
Insulin-Transferrin-Selenium	Thermo Fisher Scientific	41400045
Interleukin 1β (IL-1β)	Thermo Fisher Scientific	RIL1BI
Interleukin 6 (IL-6)	Thermo Fisher Scientific	RIL6I
Interleukin 7 (IL-7)	Thermo Fisher Scientific	RP-8645
Kanamycin	Thermo Fisher Scientific	11815024
L-glutamine	Fisher scientific	350-50-061	basement membrane matrix
Matrigel (Corning Life Sciences, Corning, NY)	Fisher scientific	CB40230C
N-2 supplement	Thermo Fisher Scientific	17502048
N-acetyl-L-cysteine	Sigma Aldrich	A7250
Nicotinamide (Nicotinamide)	Sigma Aldrich	N0636
PD-L1 inhibitor	Selleckchem	A2002
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	SV3000
Petridish	Fisher scientific	07-202-030
Potassium chloride (KCl)	Fisher scientific	18-605-517
Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4)	Fisher scientific	NC0229895
prostaglandin E2 (PGE2)	Sigma Aldrich	P0409
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	11875119
Sodium chloride (NaCl)	Fisher scientific	18-606-419
Sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4)	Fisher scientific	NC0229893	cell dissociation reagent
StemPro Accutase solution	Thermo Fisher Scientific	A1110501
Transforming growth factor beta 1 (TGF-β1)	Thermo Fisher Scientific	7754-BH-005/CF
Tumor necrosis factor α (TNF-α)	Thermo Fisher Scientific	PHC3015
Vascular endothelial growth factor (VEGF)	Thermo Fisher Scientific	RVGEFI
Y-27632 ROCK inhibitor	Sigma Aldrich	Y0350