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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Die Ziele des Protokolls sind es, diesen Ansatz zu nutzen, um 1) die Rolle der immunsuppressiven Mikroumgebung des Magentumors zu verstehen und 2) die Wirksamkeit des Patientenansprechens vorherzusagen und so die Überlebensrate der Patienten zu erhöhen.

Zusammenfassung

Tumoren, die den programmierten Zelltod-Liganden 1 (PD-L1) exprimieren, interagieren mit dem programmierten Zelltodprotein 1 (PD-1) auf CD8+ zytotoxischen T-Lymphozyten (CTLs), um sich der Immunüberwachung zu entziehen, was zur Hemmung der CTL-Proliferation, des Überlebens und der Effektorfunktion und in der Folge zur Krebspersistenz führt. Etwa 40 % der Magenkrebserkrankungen exprimieren PD-L1, die Ansprechrate auf eine Immuntherapie beträgt jedoch nur 30 %. Wir stellen die Verwendung von humanen autologen Magenkrebs-Organoid-/Immunzell-Cokulturen als präklinisches Modell vor, das die Wirksamkeit zielgerichteter Therapien zur Verbesserung des Ergebnisses von Krebspatienten vorhersagen kann. Obwohl über Co-Kulturen von Krebsorganoiden mit Immunzellen berichtet wurde, wird bei diesem Co-Kultur-Ansatz Tumorantigen verwendet, um die Antigen-präsentierenden dendritischen Zellen zu pulsieren. Dendritische Zellen (DCs) werden dann mit den CD8+ T-Zellen des Patienten kultiviert, um die zytolytische Aktivität und Proliferation dieser T-Lymphozyten vor der Co-Kultur zu erweitern. Darüber hinaus werden die Differenzierung und immunsuppressive Funktion von myeloischen Suppressorzellen (MDSCs) in Kultur innerhalb dieses Co-Kultursystems untersucht. Dieser organoide Ansatz kann von breitem Interesse und geeignet sein, um die Wirksamkeit der Therapie und das Patientenergebnis bei anderen Krebsarten, einschließlich Bauchspeicheldrüsenkrebs, vorherzusagen.

Einleitung

Magenkrebs ist die fünfthäufigste Krebserkrankung weltweit 1. Die effektive Diagnose und Behandlung von Helicobacter pylori (H. pylori) hat zu einer niedrigen Inzidenz von Magenkrebs in den Vereinigten Staaten geführt 2. Die 5-Jahres-Überlebensrate für Patienten, bei denen diese Malignität diagnostiziert wurde, beträgt jedoch nur 29 %, was Magenkrebs zu einer wichtigen medizinischen Herausforderung macht3. Der Zweck der hier vorgestellten Methoden ist es, einen Ansatz zu entwickeln, um das Ansprechen auf Immuntherapien bei einzelnen Patienten genau vorherzusagen. Solide Tumoren bestehen aus Krebszellen und verschiedenen Arten von Stroma-, Endothel- und hämatopoetischen Zellen, einschließlich Makrophagen, myeloischen Suppressorzellen (MDSCs) und Lymphozyten (siehe 4,5). Wechselwirkungen zwischen Krebsstammzellen und der Tumormikroumgebung (TME) haben einen erheblichen Einfluss auf die Tumoreigenschaften und das Ansprechen des Patienten auf die Behandlung. Dieser Ansatz zielt darauf ab, Forschern den Erwerb von Wissen für die präklinische Arzneimittelentwicklung und die Entdeckung von Biomarkern für die personalisierte Behandlung von Magenkrebs zu ermöglichen.

Die hier vorgestellte Methode verwendet humane autologe Organoid-Immunzell-Cokulturen, die von Magenkrebspatienten erzeugt wurden, um die immunsuppressive Rolle der MDSCs zu verstehen. Vorgestellt wird ein präklinisches Modell, das die Wirksamkeit zielgerichteter Therapien zur Verbesserung des Überlebens von Patienten vorhersagen kann. Über Co-Kulturen von Krebsorganoiden mit Immunzellen wurde im Bereich des Bauchspeicheldrüsenkrebses ausführlich berichtet 6,7,8,9,10. Es wurde jedoch nicht berichtet, dass solche Co-Kulturen Magenkrebs untersuchen. Insgesamt zeigt diese Methode die Co-Kultivierung von autologen Immunzellen menschlichen Ursprungs in der gleichen Matrixumgebung wie die Krebs-Organoide, so dass die Immunzellen mit den Ziel-Organoiden in Kontakt kommen können.

Die Studie von Tiriac et al.10 berichtete, dass von Patienten stammende Bauchspeicheldrüsenkrebs-Organoide, die heterogene Reaktionen auf Standard-Chemotherapeutika zeigten, in Organoid-basierte Genexpressionssignaturen der Chemosensitivität eingeteilt werden konnten, die ein verbessertes Ansprechen der Patienten auf eine Chemotherapie vorhersagen konnten. Die Forscher schlugen vor, dass ein kombiniertes molekulares und therapeutisches Profiling von Bauchspeicheldrüsenkrebs-Organoiden das klinische Ansprechen vorhersagen kann10. Co-klinische Studiendaten von Yao et al.11 zeigten auch, dass aus Rektumkrebs gewonnene Organoide eine ähnliche Pathophysiologie und genetische Veränderungen aufweisen, die dem Tumorgewebe des Patienten als Reaktion auf Chemostrahlung ähneln. Daher ist es von grundlegender Bedeutung, dass Organoidkulturen im Zusammenhang mit den Immunzellen und dem Tumorimmunphänotyp des Patienten verwendet werden, wenn diese Kulturen als Vorhersagemodelle für die Therapie verwendet werden.

Tumoren, die PD-L1 exprimieren und mit PD-1 interagieren, hemmen die Proliferation, das Überleben und die Effektorfunktion von CD8+-zytotoxischen T-Lymphozyten 12,13,14. Während etwa 40% der Magenkrebserkrankungen PD-L1 exprimieren, sprechen nur 30% dieser Patienten auf eine Immuntherapie an 15,16,17. Anti-PD1-Antikörper werden in klinischen Studien zur Behandlung von Magenkrebs eingesetzt 18,19,20. Derzeit gibt es jedoch keine präklinischen Modelle, die es erlauben, die therapeutische Wirksamkeit für jeden Patienten zu testen. Eine Optimierung der Organoidkultur so, dass die Immunzellen des Patienten in das System einbezogen werden, würde möglicherweise eine individualisierte Identifizierung der Wirksamkeit der Immuntherapie ermöglichen.

Protokoll

Es wurde die Genehmigung für die Entnahme von humanbiopsiertem Gewebe aus Patiententumoren erteilt (1912208231R001, University of Arizona Human Subjects Protection Program; IRB-Protokollnummer: 1099985869R001, University of Arizona Human Subject Protection Program TARGHETS).

1. Etablierung von patienteneigenen Magenorganoiden aus Biopsien

  1. Sammeln Sie 1-2 mm humanes biopsiertes Gewebe aus der Tumorregion von Patienten mit Mastixkrebs, die sich einer gastro-duodenoskopie der Speiseröhre in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) unterziehen (Tabelle 1).
    HINWEIS: Alle Eingriffe sollten von nun an in einer aseptischen Umgebung mit sterilen Materialien und Reagenzien durchgeführt werden.
  2. Zerkleinern Sie das biopsierte Gewebe mit Skalpellklingen auf einer Petrischale. Übertragen Sie das zerkleinerte Gewebe in ein konisches 15-ml-Röhrchen und fügen Sie 5-10 mL 1x PBS hinzu.
  3. Bei 300 × g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand. Geben Sie 1-2 ml vorgewärmten Verdauungspuffer (Tabelle 1) zu den pelletierten Geweben.
  4. Inkubieren Sie bei 37 °C für 15-30 Minuten, abhängig von der Größe des zerkleinerten Gewebes. Überwachen Sie den Status der Verdauung, indem Sie alle 5-10 Minuten unter dem Mikroskop nach kleinen Zellclustern suchen.
  5. Stoppen Sie die Verdauung, indem Sie 5-fach mit kaltem Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Medium (Advanced DMEM/F-12) verdünnen. Wenn Klumpen von unverdautem Material sichtbar sind, filtrieren Sie das Gewebe durch 30-μm-Filter. Sammeln Sie den Durchfluss.
  6. Zentrifugieren Sie den Durchfluss bei 300 × g für 5 min bei Raumtemperatur, um die Zellen zu pelletieren. Entsorgen Sie den Überstand.
  7. Resuspendieren Sie die pelletierten Zellen (10.000-100.000) in einem geeigneten Volumen (2-4 mL) der aufgetauten Basalmembranmatrix (siehe Materialtabelle) auf Eis. Keimen Sie als 30-50 μl Zell-Basalmembran-Matrix-Tropfen in 24-Well-Kulturplatten.
  8. Inkubieren Sie die Platten 15 Minuten lang bei 37 °C, damit sich die Tropfen der Zell-Basalmembran-Matrix verfestigen können. Überlagern Sie die Tropfen der Zell-Basalmembran-Matrix mit vorgewärmtem Magenorganoid-Kulturmedium (Tabelle 1).
  9. Organoidkulturen werden bei 37 °C und 5 % CO2 gehalten. Ersetzen Sie das Nährmedium je nach Organoidwachstum alle 3-4 Tage durch frisches Medium. Passieren Sie die Organoide einmal alle 7-10 Tage im Verhältnis 1:3.

2. Etablierung von patienteneigenen Magenorganoiden aus chirurgischen Proben

  1. Entnahme von menschlichem Magenkrebsgewebe aus resezierten Proben von Magenkrebspatienten während chirurgischer Eingriffe in 1x Dulbecco-Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (DPBS), ergänzt mit Antibiotika (Tabelle 1).
    HINWEIS: Alle nachfolgenden Verfahren sollten in einer Biosicherheitswerkbank unter Beibehaltung einer aseptischen Umgebung und unter Verwendung steriler Materialien und Reagenzien durchgeführt werden.
  2. Zerkleinern Sie das resezierte Gewebe mit chirurgischen Skalpellklingen auf einer Petrischale. Waschen Sie das gehackte Taschentuch mit 5-10 mL 1x DPBS, das Antibiotika enthält.
  3. Übertragen Sie das Gewebe in ein konisches 50-ml-Röhrchen. Geben Sie 10 ml vorgewärmten Ethylendiamin-Tetraessigsäure (EDTA)-Stripping-Puffer zu den gehackten Geweben. Überwachen Sie den Zustand der Verdauung alle 5-10 Minuten. Inkubieren Sie das Röhrchen in einem 37 °C Shaker für 10 Minuten.
  4. Lassen Sie das Gewebe am Boden des Röhrchens absetzen, entfernen Sie den EDTA-Puffer, ohne das Gewebe zu stören, und fügen Sie 10 ml frischen EDTA-Puffer hinzu. Inkubieren Sie das Röhrchen in einem 37 °C Shaker für 5 Minuten.
  5. Lassen Sie das Taschentuch am Boden des Röhrchens absetzen. Entfernen Sie den EDTA-Puffer und waschen Sie das Gewebe zweimal (befolgen Sie Schritt 2.4) mit 10 ml fortgeschrittenem DMEM/F-12, das mit Antibiotika (keine Zentrifuge) ergänzt wurde (Tabelle 1).
  6. Geben Sie je nach Gewebegröße 5-10 ml vorgewärmten Verdauungspuffer (Tabelle 1) in das Gewebe. Inkubieren Sie das Röhrchen bei 37 °C für 15-30 Minuten unter leichtem Rühren, abhängig von der Größe und Textur des Gewebes. Überprüfen Sie alle 10 Minuten das Aussehen von Zellclustern unter einem Mikroskop.
  7. Stoppen Sie die Verdauung, indem Sie es zweifach mit kaltem Advanced DMEM/F-12 plus Antibiotika verdünnen. Filtern Sie das unverdaute Gewebe durch 40 μm Filter und sammeln Sie den Durchfluss.
  8. Zentrifugieren Sie den Durchfluss bei 400 × g für 5 min bei 4 °C, um die Zellen zu pelletieren. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen mit kaltem 1x DPBS plus Antibiotika bei 400 × g für 5 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig und lagern Sie die Zellen auf Eis.
  9. Resuspendieren Sie die pelletierten Zellen in einem geeigneten Volumen der Basalmembranmatrix auf Eis. 30-50 μl Zell-Basalmembran-Matrixtropfen in 24- oder 12-Well-Zellkulturplatten aussäen.
  10. Inkubieren Sie die Platten 15 Minuten lang bei 37 °C, damit sich die Tropfen der Zell-Basalmembran-Matrix zu einer Kuppel verfestigen können. Überlagern Sie die Kuppel der Zell-Basalmembran-Matrix mit vorgewärmtem Magenorganoid-Kulturmedium (Tabelle 1).
  11. Halten Sie die Organoidkulturen bei 37 °C und 5 % CO2. Ersetzen Sie das Nährmedium je nach Organoidwachstum alle 3-4 Tage durch frisches Medium. Passieren Sie die Organoide einmal alle 7-10 Tage im Verhältnis 1:2 oder 1:3, basierend auf der Organoiddichte.

3. Erhaltung und Erweiterung von Organoidkulturen

HINWEIS : Alle Eingriffe sollten in einer aseptischen Umgebung unter Verwendung steriler Materialien und Reagenzien durchgeführt werden.

  1. Instandhaltung und Erweiterung
    1. Bewahren Sie die Organoidkulturen 7-10 Tage lang auf, bis sie zu 70-80% konfluent sind. Ernte die Organoide in eiskaltem DMEM. Übertragen Sie die Organoide in 5-ml-Polystyrolröhrchen mit rundem Boden.
    2. Die Organoide werden bei 400 × g für 5 min bei 4 °C zu Pelletzellen zentrifugiert. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml vorgewärmter Zelldissoziationsreagenzlösung. Inkubieren Sie die Organoide bei 37 °C für 6 min.
    3. Führen Sie die Organoide 4 Mal vorsichtig durch eine 26 G Nadel. Fügen Sie 2 ml DMEM hinzu, um die Wirkung des Zelldissoziationsreagenzes zu stoppen.
    4. Zentrifugieren Sie die Organoide bei 400 × g für 5 min bei 4 °C, um die Zellen zu pelletieren. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig und lagern Sie die Zellen auf Eis.
    5. Resuspendieren Sie die pelletierten Zellen in einem geeigneten Volumen der Basalmembranmatrix auf Eis. 30-50 μl der Zell-Basalmembran-Matrix werden in mit 24 oder 12 Vertiefungen behandelte Zellkulturplatten abgegeben.
    6. Inkubieren Sie die Platten 15 Minuten lang bei 37 °C, damit sich die Tropfen der Zell-Basalmembran-Matrix zu einer Kuppel verfestigen können. Die Kuppel der Zell-Basal-Membranmatrix wird mit vorgewärmtem Magenorganoid-Kulturmedium überlagert (siehe Tabelle 1).
    7. Halten Sie die Organoidkulturen bei 37 °C und 5 % CO2. Ersetzen Sie das Nährmedium je nach Organoidwachstum alle 3-4 Tage durch frisches Medium. Wiederholen Sie die Übergabe der Organoide einmal alle 7-10 Tage im Verhältnis 1:2 oder 1:3, basierend auf der Organoiddichte.
  2. Expansion von Organoid-abgeleiteten Zelllinien
    1. Ernten Sie die Organoide, wenn sie zu 70-80% konfluent sind. Füttern Sie die an den Kunststoffplatten haftenden Zellen mit Magenorganoid-Kulturmedium und pflegen Sie die Kultur, indem Sie sie je nach Zellwachstum alle 3-4 Tage füttern.
    2. Passieren Sie die Zellen, wenn sie eine Konfluenz von 80-90 % erreichen.
      1. Entfernen Sie das Nährmedium und waschen Sie die Platte vorsichtig mit vorgewärmtem DPBS. Fügen Sie 1 ml vorgewärmtes Zelldissoziationsreagenz hinzu.
      2. Inkubieren Sie die Zellen 5 Minuten lang bei 37 °C. Ernten Sie die Zellen in 2 mL DMEM.
      3. Die Zellen werden bei 400 × g 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in Magenorganoid-Kulturmedium oder humanem Magenepithelzell-Kulturmedium (Tabelle 1).
    3. Die Zellen aus 3.2.2.3 werden entweder in Basalmembranmatrix-beschichteten oder gelatinebeschichteten Platten plattiert. Halten Sie die Organoidkulturen bei 37 °C und 5 % CO2. Ersetzen Sie das Medium je nach Zellwachstum jeden zweiten Tag durch frisches Medium. Wiederholen Sie die Passage der Zellen einmal alle 7-10 Tage im Verhältnis 1:2 oder 1:3, basierend auf der Zelldichte.
      1. Um die Platten mit einer Basalmembranmatrix zu beschichten, verdünnen Sie die Matrix in eiskaltem Wasser in Zellkulturqualität im Verhältnis 1:10. Die Platte wird mit einem Zellverteiler gleichmäßig mit 1 ml eiskalter, verdünnter Matrixlösung bestreut und die beschichtete Platte 2 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Entfernen Sie die restliche Beschichtungslösung und lassen Sie die Platte ohne Deckel in der Biosicherheitshaube 30 Minuten trocknen, bevor Sie die Zellen plattieren.
      2. Um die Platten mit Gelatine zu beschichten, beschichten Sie die Platte gleichmäßig mit 1 ml einer eiskalten Beschichtungslösung auf Gelatinebasis. Inkubieren Sie die beschichtete Platte 5 Minuten lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die restliche Gelatinelösung und plattieren Sie die resuspendierten Zellen.

4. Kultivierung von Immunzellen aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs)

HINWEIS: Alle Eingriffe sollten in einer aseptischen Umgebung unter Verwendung steriler Materialien und Reagenzien durchgeführt werden.

  1. PBMC-Isolierung
    1. Vollblut mit dem gleichen Volumen von 1x PBS verdünnen.
    2. Abhängig vom Gesamtvolumen der verdünnten Blutprobe wird ein geeignetes Volumen des Dichtegradientenmediums (siehe Materialtabelle) in ein 15-ml-Röhrchen abgegeben.
      HINWEIS: Das empfohlene Verhältnis beträgt 3 ml des Dichtegradienten-Mediums zu 4 ml der verdünnten Blutprobe.
    3. Schichten Sie die verdünnte Blutprobe vorsichtig auf das Dichtegradientenmedium. Zentrifugieren Sie bei 400 × g für 30 min-1 h ohne Bremse.
    4. Nach der Zentrifugation werden die mononukleären Zellen an der Grenzfläche vorsichtig in ein neues konisches 15-ml-Röhrchen überführt. Verdünnen Sie die mononukleären Zellen mit 3 Volumina 1x PBS.
    5. Bei 400 × g 10 min zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand. Wiederholen Sie den Vorgang einmal.
    6. Resuspendieren Sie die pelletierten Zellen in einem geeigneten Medium für nachgelagerte Anwendungen oder kryokonservieren Sie sie als gefrorene Bestände.
    7. Bestimmen Sie bei Bedarf die Ausbeute und Zellviabilität von PBMCs mit dem Trypanblau-Farbstoffausschluss-Assay.
  2. Kultur humaner dendritischer Zellen
    1. Resuspendieren Sie die isolierten PBMC in PBMC-Medium (siehe Materialtabelle und Tabelle 1) und plättieren Sie sie in einer 24-Well-Gewebekulturplatte für 1-2 h bei 37 °C in 5 % CO2.
    2. Klopfen Sie fest auf die Kulturplatte und entsorgen Sie das verbrauchte Kulturmedium mit nicht adhärenten Zellen.
    3. Geben Sie das DC-Kulturmedium (Tabelle 1) zu den adhärenten Zellen. Halten Sie die Kulturen 3 Tage lang bei 37 °C in 5 % CO2. Ersetzen Sie den Überstand an wechselnden Tagen durch frischen Nährboden.
    4. Ersetzen Sie an Tag 3 das erschöpfte Medium durch frisches DC-Reifemedium (Tabelle 1). Halten Sie die Kulturen 24 h lang bei 37 °C in 5 % CO2.
  3. Kultur von humanen zytotoxischen T-Lymphozyten (CTLs)
    1. Übertragen Sie 1 ml PBMC in ein 5 ml-Polystyrolröhrchen mit rundem Boden.
    2. 50 μl Anreicherungscocktail (siehe Materialtabelle) zu den PBMCs geben und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
    3. Geben Sie 150 μl magnetische Partikel (Materialtabelle) in die Probe. 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
    4. Erhöhen Sie das Probenvolumen mit dem Zelltrennpuffer auf 2,5 mL (Materialtabelle). Legen Sie das Polystyrol-Röhrchen mit rundem Boden für 5 Minuten in einen Zelltrennmagneten (Materialtabelle), um die Zelltrennung zu ermöglichen.
    5. Gießen Sie die angereicherte Zellsuspension in ein neues konisches 15-ml-Röhrchen. Bei 300 × g 5 min zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand.
    6. Die pelletierten Zellen und die Kultur werden 24 Stunden lang bei 37 °C in 5 % CO2 in CTL-Kulturmedium (Tabelle 1) resuspendiert.
  4. Kultur von humanen myeloischen Suppressorzellen (MDSCs)
    1. PBMC 7 Tage lang in MDSC-Kulturmedium (Tabelle 1) bei 37 °C in 5 % CO2 kultivieren, um es für MDSCs anzureichern. Das überstehende Medium wird an abwechselnden Tagen durch frisches Kulturmedium ersetzt.
  5. Co-Kultur von DCs und CTLs
    1. Sammeln Sie konditioniertes Medium aus den Organoidkulturen.
    2. Entfernen Sie vorsichtig 50 % des Mediums aus der gereiften DC-Kultur und ersetzen Sie es durch aus Organoiden gewonnenes konditioniertes Medium.
    3. Die DCs werden 2 h lang bei 37 °C in 5 % CO 2 mit dem aus Organoidengewonnenen konditionierten Medium inkubiert.
    4. Ernten Sie die locker anhaftenden DCs und zentrifugieren Sie sie bei 300 × g für 5 min bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Pellet in RPMI-Co-Kulturmedium und geben Sie diese Zellsuspension wieder in dieselbe Vertiefung.
    5. Ernten Sie die CTLs aus derselben Patientenlinie und übertragen Sie sie in die gereiften DCs. Setzen Sie die DC-CTL-Co-Kultur (Tabelle 1) für 72 h bei 37 °C in 5% CO2 fort.

5. Etablierung von Organoid-/Immunzell-Cokulturen

  1. CTLs aus Co-Kulturen von DCs und CTLs mit einem Kit (siehe Materialtabelle) isolieren, wie zuvor in Abschnitt 4.3 beschrieben.
  2. Inkubieren Sie die CTLs mit 5 μM Carboxyfluoresceindiacetat-Succinimidylester (CFSE) bei 37 °C für 20 min.
    HINWEIS: CFSE ist ein blauer, lasererregbarer Farbstoff, der für die durchflusszytometrische Überwachung von Zellteilungen verwendet wird.
  3. Ernten Sie die Organoide und mischen Sie sie mit CFSE-markierten CTLs. Halten Sie das CTL/Organoid-Verhältnis bei 50.000 CTLs pro 200 Organoide und resuspendieren Sie die Organoide in einem geeigneten Volumen aufgetauter Basalmembranmatrix auf Eis. Seed als 25 μL Zell-Basal-Membran-Matrix-Tropfen in 24-Well-Gewebekulturplatten.
    HINWEIS: Bei Versuchsbedingungen, die MDSCs erfordern, mischen Sie die MDSCs mit den Organoiden und CFSE-markierten CTLs vor der Aussaat. Das MDSC/CTL-Verhältnis sollte 4:1 betragen.
  4. Inkubieren Sie die Platten 15 Minuten lang bei 37 °C, damit sich die Tropfen der Zell-Basalmembran-Matrix verfestigen können.
  5. Überlagern Sie die Tropfen der Zell-Basalmembran-Matrix mit vorgewärmtem Organoid-Kulturmedium.
  6. Die Kokulturen der Organoid-/Immunzellen werden bis zur Analyse bei 37 °C in 5 % CO2 gehalten .

Ergebnisse

Nach Abschluss erscheinen die Magenorganoide als Kugeln innerhalb der Vertiefung, typischerweise innerhalb von 2-4 Tagen nach der Einbettung (Abbildung 1). Abbildung 1A zeigt eine gedeihende Magenorganoidkultur, die eine regelmäßige Membran aufweist. Tumororganoide weisen oft eine divergente Morphologie auf, die für die Patientenprobe einzigartig ist. Erfolglose Kulturen erscheinen dicht oder zeigen kein Wachstum seit der anf...

Diskussion

Wir stellen die Verwendung von humanen autologen Magenkrebs-Organoid-Immunzell-Cokulturen vor, die als präklinisches Modell verwendet werden können, um die Wirksamkeit zielgerichteter Therapien vorherzusagen, um letztendlich das Behandlungsergebnis und die Patientenprognose zu verbessern. Obwohl über Co-Kulturen von Krebsorganoiden mit Immunzellen berichtet wurde, ist dies der erste Bericht über ein solches Co-Kultursystem für die Erforschung von Magenkrebs. Zahlreiche andere Organo...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch NIH (NIAID) 5U19AI11649105 (PIs: Weiss and Wells, Project Leader 1: Zavros) und NIH (NIDDK) 2 R01 DK083402-06A1 (PI: Zavros) Grant unterstützt. Dieses Projekt wurde teilweise unterstützt durch PHS Grant P30 DK078392 (Integrative Morphology Core) des Digestive Diseases Research Core Center in Cincinnati und 5P30CA023074 UNIVERSITY OF ARIZONA CANCER CENTER – CANCER CENTER SUPPORT GRANT (PI: Sweasy). Wir möchten uns bei Chet Closson (Live Microscopy Core, University of Cincinnati) und den ehemaligen Mitgliedern des Zavros-Labors, Dr. Nina Steele und Loryn Holokai, für ihren Beitrag zur Entwicklung des Organoid-Kultursystems bedanken. Wir danken den Patienten, die sich bereit erklärt haben, Gewebe und Blut für die Entwicklung der Co-Kulturen aus Magenorganoid und Immunzellen zu spenden. Ohne ihre Bereitschaft, an der Studie teilzunehmen, wäre diese Arbeit nicht möglich.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
12 well plateMidwest Scientific92012
15 mL Falcon tubeFisher scientific12-565-269
24 well plateMidwest Scientific92024
30 μm filtersMiltenyi Biotec130-041-407
40 μm filters (Fisher Scientific)Fisher scientific352340
5 mL round bottom polystyrene tubesFisher scientific14956-3C
50 mL Falcon tubeFisher scientific12-565-271
Advanced DMEM/F12Thermo Fisher Scientific12634010
AIMVThermo Fisher Scientific12055091Basal medium for PBMCs and DCs
Amphotericin B/ GentamicinThermo Fisher ScientificR-01510
B-27 supplementThermo Fisher Scientific12587010
β-mercaptoethanolThermo Fisher Scientific800-120
Bone morphogenetic protein inhibitor (Noggin)Peprotech250-38
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma AldrichA7906
CabozantinibSelleckchemS1119
Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)Biolegend423801
Collagenase ASigma AldrichC9891
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)Fisher scientific14190-144cell separation buffer
EasySep BufferStem Cell Technologies20144Contains Enrichment Cocktail and Magnetic Particles used in CTL culture
EasySep Human CD8+ T Cell Enrichment KitStem Cell Technologies19053cell separation magnet
EasySep MagnetStem Cell TechnologiesSN12580
EDTASigma AldrichE6758
Epidermal Growth Factor (EGF)Peprotech315-09
Farma Series 3 Water Jacketed IncubatorThermo Fisher Scientific4120
Fetal Calf Serum (FCS)Atlanta BiologicalsSI2450H
Fibroblast growth factor 10 (FGF-10)Peprotech100-26density gradient medium
Ficoll-PaqueGE Healthcare171440-02
Gastrin 1Tocris30061
GelatinCell Biologics6950
GM-CSFThermo Fisher ScientificPHC6025
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Thermo Fisher Scientific14175095
HEPES (2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid)Fisher scientificBP299-100
Human Epithelial Cell Basal MediumCell BiologicsH6621
human serum ABGemini Bioscience21985023
Hyaluronidase Type IV-SSigma AldrichH3884
Insulin-Transferrin-SeleniumThermo Fisher Scientific41400045
Interleukin 1β (IL-1β)Thermo Fisher ScientificRIL1BI
Interleukin 6 (IL-6)Thermo Fisher ScientificRIL6I
Interleukin 7 (IL-7)Thermo Fisher ScientificRP-8645
KanamycinThermo Fisher Scientific11815024
L-glutamineFisher scientific350-50-061basement membrane matrix
Matrigel (Corning Life Sciences, Corning, NY)Fisher scientificCB40230C
N-2 supplementThermo Fisher Scientific17502048
N-acetyl-L-cysteineSigma AldrichA7250
Nicotinamide (Nicotinamide)Sigma AldrichN0636
PD-L1 inhibitorSelleckchemA2002
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher ScientificSV3000
PetridishFisher scientific07-202-030
Potassium chloride (KCl)Fisher scientific18-605-517
Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4)Fisher scientificNC0229895
prostaglandin E2 (PGE2)Sigma AldrichP0409
RPMI 1640Thermo Fisher Scientific11875119
Sodium chloride (NaCl)Fisher scientific18-606-419
Sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4)Fisher scientificNC0229893cell dissociation reagent
StemPro Accutase solutionThermo Fisher ScientificA1110501
Transforming growth factor beta 1 (TGF-β1)Thermo Fisher Scientific7754-BH-005/CF
Tumor necrosis factor α (TNF-α)Thermo Fisher ScientificPHC3015
Vascular endothelial growth factor (VEGF)Thermo Fisher ScientificRVGEFI
Y-27632 ROCK inhibitorSigma AldrichY0350

Referenzen

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