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要約

プロトコルの目標は、このアプローチを使用して、1) 免疫抑制性胃腫瘍微小環境の役割を理解し、2) 患者の反応の有効性を予測し、患者の生存率を高めることです。

要約

プログラム細胞死リガンド1(PD-L1)を発現する腫瘍は、CD8+細胞傷害性Tリンパ球(CTL)上のプログラム細胞死タンパク質1(PD-1)と相互作用して免疫監視を回避し、CTLの増殖、生存、エフェクター機能の阻害、ひいてはがんの持続性につながります。胃がんの約40%がPD-L1を発現していますが、免疫療法に対する奏効率はわずか30%です。ヒト由来の自家胃がんオルガノイド/免疫細胞共培養の使用を、がん患者の転帰を改善するための標的療法の有効性を予測する可能性のある前臨床モデルとして提示します。免疫細胞とがんオルガノイドの共培養が報告されていますが、この共培養アプローチでは、腫瘍抗原を使用して抗原提示樹状細胞をパルスします。次に、樹状細胞(DC)を患者のCD8+ T細胞と培養して、共培養前にこれらのTリンパ球の細胞溶解活性と増殖を拡大します。さらに、この共培養システム内で、培養中の骨髄由来サプレッサー細胞(MDSC)の分化と免疫抑制機能について研究しています。このオルガノイドアプローチは、膵臓がんを含む他のがんにおける治療の有効性と患者の転帰を予測するために、幅広い関心を集め、適切である可能性があります。

概要

胃がんは、世界で5番目に多いがんです1。ヘリコバクター・ピロリ菌(H. pylori)の効果的な診断と治療により、米国では胃がんの発生率が低くなっています2。しかし、この悪性腫瘍と診断された患者の5年生存率はわずか29%であり、胃がんは重要な医学的課題となっています3。ここで紹介する方法の目的は、個々の患者の免疫療法反応を正確に予測するアプローチを開発することです。固形腫瘍は、がん細胞と、マクロファージ、骨髄由来サプレッサー細胞(MDSC)、リンパ球など、さまざまな種類の間質細胞、内皮細胞、造血細胞から構成される(4,5の文献で総説)。がん幹細胞と腫瘍微小環境(TME)との間の相互作用は、腫瘍の特性と治療に対する患者の反応に大きく影響します。このアプローチは、研究者が胃がんの個別化治療のための前臨床医薬品開発とバイオマーカー発見のための知識を習得できるようにすることを目指しています。

ここで紹介する手法は、胃がん患者から作製したヒト由来の自家オルガノイド/免疫細胞共培養を用いて、MDSCの免疫抑制的役割を理解するためのものです。これは、患者の生存率を向上させるための標的療法の有効性を予測する可能性のある前臨床モデルです。免疫細胞とのがんオルガノイド共培養は、膵臓がんの分野で広く報告されています6,7,8,9,10。しかし、そのような共培養は胃癌を研究するために報告されていません。全体として、この方法は、がんオルガノイドと同じマトリックス環境内で自家ヒト由来免疫細胞を共培養することを示しており、したがって免疫細胞が標的オルガノイドと接触することを可能にします。

Tiriac et al.10 による研究では、標準治療の化学療法に対して不均一な反応を示した患者由来の膵臓がんオルガノイドを、化学療法に対する患者の反応の改善を予測できるオルガノイドベースの化学感受性の遺伝子発現シグネチャに分類できると報告しました。研究者らは、膵臓がんオルガノイドの分子プロファイリングと治療プロファイリングを組み合わせることで、臨床反応を予測できると提案しました10。Yaoらによる共同臨床試験データ11 では、直腸がん由来オルガノイドが、化学放射線療法に反応した患者の腫瘍組織と同様の病態生理学および遺伝的変化を示すことも示されました。したがって、オルガノイド培養物を治療の予測モデルとして使用する際には、患者の免疫細胞や腫瘍の免疫表現型の文脈で使用することが基本となります。

PD-L1を発現する腫瘍は、PD-1と相互作用し、CD8+細胞傷害性Tリンパ球の増殖、生存、およびエフェクター機能を阻害する12,13,14。胃がんの約40%がPD-L1を発現しているが、これらの患者のうち免疫療法に反応するのは30%に過ぎない15,16,17。抗PD1抗体は、胃がん治療の臨床試験で使用されています18,19,20。しかし、現在のところ、患者ごとに治療効果を試験できる前臨床モデルはありません。患者の免疫細胞がシステムに含まれるようにオルガノイド培養を最適化することで、免疫療法の有効性を個別化して特定できる可能性があります。

プロトコル

患者の腫瘍からヒト生検組織を採取するための承認が得られました(1912208231R001、アリゾナ大学ヒト被験者保護プログラム;IRBプロトコル番号:1099985869R001、アリゾナ大学人間被験者保護プログラムTARGHETS)。

1. 生検による患者由来の胃オルガノイドの樹立

  1. 食道胃十二指腸内視鏡検査を受けている胃がん患者の腫瘍領域から、1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1〜2mmのヒト生検組織を採取します(表1)。
    注:以降のすべての手順は、無菌材料と試薬を使用して無菌環境で実施する必要があります。
  2. ペトリ皿の上でメスの刃を使用して生検した組織を細かく刻みます。ミンチ組織を15 mLのコニカルチューブに移し、5〜10 mLの1x PBSを加えます。
  3. 300 × g で室温で5分間遠心分離します。上清を捨てます。1〜2 mLの予熱消化バッファー(表1)をペレット組織に加えます。
  4. ミンチ組織のサイズに応じて、37°Cで15〜30分間インキュベートします。5〜10分ごとに顕微鏡で小さな細胞クラスターを見て、消化の状態を監視します。
  5. 冷たいAdvanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 medium(Advanced DMEM/F-12)で5倍に希釈して消化を止めます。未消化物質の塊が見える場合は、30 μmフィルターで組織をろ過します。フロースルーを収集します。
  6. フロースルーを室温で300 × g で5分間遠心分離し、細胞をペレット化します。上清を捨てます。
  7. ペレット化した細胞(10,000〜100,000)を、融解した基底膜マトリックス( 材料表を参照)の適切な容量(2〜4 mL)に氷上に再懸濁します。30-50 μLの細胞基底膜マトリックスを24ウェル培養プレートに滴下して播種します。
  8. プレートを37°Cで15分間インキュベートし、細胞基底膜マトリックス液滴を固化させます。細胞基底膜マトリックス液滴を予熱した胃オルガノイド培養培地で覆います(表1)。
  9. オルガノイド培養物を5%CO2中で37°Cに維持します。オルガノイドの成長に応じて、3〜4日ごとに培地を新鮮な培地と交換します。オルガノイドを7〜10日ごとに1:3の比率で通過させます。

2. 手術検体からの患者由来胃オルガノイドの樹立

  1. 抗生物質を添加した1x Dulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で、外科的処置中に胃がん患者の切除標本からヒト胃がん組織を採取します(表1)。
    注:以降のすべての手順は、バイオセーフティキャビネットで処理し、無菌環境を維持し、滅菌材料と試薬を使用する必要があります。
  2. ペトリ皿の上で外科用メスの刃を使用して切除した組織をミンチにします。ミンチ組織を抗生物質を含む5〜10mLの1x DPBSで洗浄します。
  3. 組織を50mLの円錐管に移します。予熱したエチレンジアミン四酢酸(EDTA)ストリッピングバッファー10mLをミンチ組織に加えます。5〜10分ごとに消化の状態を監視します。チューブを37°Cのシェーカーで10分間インキュベートします。
  4. 組織をチューブの底に沈殿させ、組織を乱さずにEDTAバッファーを取り出し、10mLの新鮮なEDTAバッファーを追加します。チューブを37°Cのシェーカーで5分間インキュベートします。
  5. 組織をチューブの底に沈殿させます。EDTAバッファーを取り外し、抗生物質(遠心分離機なし)を添加した10 mLの高度なDMEM/F-12で組織を2回洗浄します(ステップ2.4に従います)(表1)。
  6. 組織のサイズに応じて、5〜10 mLの予熱した消化バッファー(表1)を組織に加えます。チューブを37°Cで15〜30分間インキュベートし、組織のサイズとテクスチャーに応じて軽度の攪拌を行います。10分ごとに顕微鏡で細胞クラスターの外観を確認します。
  7. 冷たいAdvanced DMEM/F-12と抗生物質で2倍に希釈して消化を止めます。未消化の組織を40μmのフィルターでろ過し、フロースルーを回収します。
  8. フロースルーを400 × g で4°Cで5分間遠心分離し、細胞をペレット化します。上清を捨て、冷やした1x DPBSと抗生物質を併用して細胞を400 × g 、4°Cで5分間洗浄します。 上清を慎重に捨て、細胞を氷上に保存します。
  9. ペレット化した細胞を、氷上の基底膜マトリックスの適切な容量に再懸濁します。30-50 μLの細胞基底膜マトリックスを24ウェルまたは12ウェルの細胞培養処理プレートに滴下します。
  10. プレートを37°Cで15分間インキュベートし、細胞基底膜マトリックス液滴がドーム状に固化します。細胞基底膜マトリックスドームを予熱した胃オルガノイド培養培地で覆います(表1)。
  11. オルガノイド培養物を5%CO2中で37°Cに維持します。オルガノイドの成長に応じて、3〜4日ごとに培地を新鮮な培地と交換します。オルガノイドを7〜10日ごとに1:2または1:3の比率で、オルガノイドの密度に基づいて通過させます。

3. オルガノイド培養の維持・拡大

注:すべての手順は、無菌材料と試薬を使用して無菌環境で実施する必要があります。

  1. メンテナンスと拡張
    1. オルガノイド培養物が70〜80%コンフルエントになるまで、7〜10日間維持します。氷冷したDMEMでオルガノイドを採取します。オルガノイドを5 mLの丸底ポリスチレンチューブに移します。
    2. オルガノイドを400 × g で4°Cで5分間遠心分離し、細胞をペレット化します。上清を慎重に取り除き、ペレットを予熱した細胞解離試薬溶液1 mLに再懸濁します。オルガノイドを37°Cで6分間インキュベートします。
    3. オルガノイドを26Gの針に4回静かに通します。2 mLのDMEMを添加して、細胞解離試薬の作用を停止します。
    4. オルガノイドを400 × g で4°Cで5分間遠心分離し、細胞をペレット化します。上清を慎重に捨て、細胞を氷上に保存します。
    5. ペレット化した細胞を、氷上の基底膜マトリックスの適切な容量に再懸濁します。細胞基底膜マトリックスの30-50 μLをシードし、24ウェルまたは12ウェルの細胞培養処理プレートに滴下します。
    6. プレートを37°Cで15分間インキュベートし、細胞基底膜マトリックス液滴がドーム状に固化します。細胞-細胞-基底膜マトリックスドームを予熱した胃オルガノイド培養培地で覆います( 表1を参照)。
    7. オルガノイド培養物を5%CO2中で37°Cに維持します。オルガノイドの成長に応じて、3〜4日ごとに培地を新鮮な培地と交換します。オルガノイドの可継を7〜10日ごとに1:2または1:3の比率で、オルガノイドの濃度に基づいて繰り返します。
  2. オルガノイド由来細胞株の増殖
    1. オルガノイドが70〜80%コンフルエントになったら収穫します。プラスチックプレートに付着した細胞に胃オルガノイド培養液を投入し、細胞の増殖に応じて3〜4日おきに培養液を供給することで培養を維持します。
    2. 細胞が80〜90%のコンフルエントに達したときに細胞を継代します。
      1. 培地を取り出し、予熱したDPBSでプレートをやさしく洗います。予熱した細胞解離試薬1 mLを添加します。
      2. 細胞を37°Cで5分間インキュベートします。 2 mLのDMEMで細胞を回収します。
      3. 細胞を400 × g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を取り除き、ペレットを胃オルガノイド培養培地またはヒト胃上皮細胞培養培地に再懸濁します(表1)。
    3. 3.2.2.3の細胞を基底膜マトリックスコーティングプレートまたはゼラチンコーティングプレートのいずれかにプレートします。オルガノイド培養物を5%CO2中で37°Cに維持します。細胞の増殖に応じて、隔日で培地を新しい培地と交換します。細胞の継代を7〜10日ごとに1回、細胞密度に基づいて1:2または1:3の比率で繰り返します。
      1. プレートを基底膜マトリックスでコーティングするには、マトリックスを氷冷細胞培養グレードの水で1:10の比率で希釈します。セルスプレッダーを用いて氷冷希釈マトリックス溶液1mLでプレートを均一にコーティングし、コーティングしたプレートを37°Cで2時間インキュベートします。残ったコーティング溶液を取り出し、細胞をプレーティングする直前に、バイオセーフティフードの内側に蓋をせずにプレートを30分間乾燥させます。
      2. プレートをゼラチンでコーティングするには、氷冷ゼラチンベースのコーティング溶液1mLでプレートを均一にコーティングします。コーティングしたプレートを室温で5分間インキュベートします。残りのゼラチン溶液を取り除き、再懸濁した細胞をプレートします。

4. 末梢血単核細胞(PBMC)からの免疫細胞の培養

注:すべての手順は、無菌材料と試薬を使用して無菌環境で実施する必要があります。

  1. PBMCアイソレーション
    1. 全血を等量の1x PBSで希釈します。
    2. 希釈した血液サンプルの総量に応じて、適切な量の密度勾配培地( 材料表を参照)を15 mLチューブに分注します。
      注:推奨される比率は、密度勾配培地の3 mLと希釈した血液サンプルの4 mLです。
    3. 希釈した血液サンプルを密度勾配培地に慎重に重ねます。ブレーキなしで400 × g で30分間-1時間遠心分離します。
    4. 遠心分離後、界面の単核細胞を新しい15 mLコニカルチューブに慎重に移します。単核細胞を3容量の1x PBSで希釈します。
    5. 400 × g で10分間遠心分離します。上清を捨てます。一度繰り返します。
    6. ペレット化した細胞をダウンストリームアプリケーションに適した培地に再懸濁するか、凍結ストックとして凍結保存します。
    7. 必要に応じて、トリパンブルー色素排除アッセイを使用してPBMCの収量と細胞生存率を決定します。
  2. ヒト樹状細胞の培養
    1. 単離したPBMCをPBMC培地に再懸濁し( 材料表 および 表1を参照)、24ウェル組織培養プレートで5%CO2の37°Cで1〜2時間プレートします。
    2. 培養プレートをしっかりと叩き、非接着性細胞を含む使用済み培地を廃棄します。
    3. DC培地(表1)を接着細胞に加えます。培養物を5%CO2中で37°Cで3日間維持します。上清培地を隔日で新鮮な培地と交換します。
    4. 3日目に、消耗した培地を新しいDC成熟培地と交換します(表1)。培養物を5%CO2中で37°Cで24時間維持します。
  3. ヒト細胞傷害性Tリンパ球(CTL)の培養
    1. 1 mLのPBMCを5 mLのポリスチレン丸底チューブに移します。
    2. 50 μLのエンリッチメントカクテル( 材料表を参照)をPBMCsに加え、室温で10分間インキュベートします。
    3. 150 μLの磁性粒子(材料表)をサンプルに加えます。室温で5分間インキュベートします。
    4. 細胞分離バッファーを使用してサンプル量を2.5 mLに増やします(材料表)。ポリスチレン丸底チューブを細胞分離磁石(材料表)に5分間入れて、細胞分離を可能にします。
    5. 濃縮した細胞懸濁液を新しい15 mLコニカルチューブに注ぎます。300 × g で5分間遠心分離します。上清を捨てます。
    6. ペレット化した細胞を再懸濁し、CTL培地(表1)で5%CO2の37°Cで24時間培養します。
  4. ヒト骨髄由来サプレッサー細胞(MDSC)の培養
    1. MDSCをMDSC培地(表1)で37°C、5%CO2 中で7日間培養し、MDSCを濃縮します。上清培地を隔日で新鮮な培地と交換します。
  5. DC と CTL の共培養
    1. オルガノイド培養物から馴化培地を採取します。
    2. 成熟したDC培養液から培地の50%を静かに取り出し、オルガノイド由来のコンディショニング培地と交換します。
    3. DCをオルガノイド由来の馴化培地と共生させ、5%CO2中で37°Cで2時間インキュベートします。
    4. 緩く付着したDCを回収し、300 g×gで4°Cで5分間遠心分離します。 上清を取り除き、ペレットをRPMI共培養培地に再懸濁し、この細胞懸濁液を同じウェルに戻します。
    5. 同じ患者ラインからCTLを採取し、成熟したDCに移し、DC-CTL共培養(表1)を5% CO2中で37°Cで72時間継続します。

5. オルガノイド/免疫細胞共培養の確立

  1. セクション 4.3 で前述したように、キット ( 材料の表を参照) を使用して、DC と CTL の共培養から CTL を分離します。
  2. CTLを5 μMカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル(CFSE)と37°Cで20分間インキュベートします。
    注:CFSEは、細胞分裂のフローサイトメトリーモニタリングに使用される青色レーザー励起性色素です。
  3. オルガノイドを採取し、CFSE標識CTLと混合します。CTL/オルガノイド比を200オルガノイドあたり50,000 CTLに保ち、氷上の融解した基底膜マトリックスの適切な量にオルガノイドを再懸濁します。25 μLの細胞基底膜マトリックスを24ウェル組織培養プレートに滴下します。
    注:MDSCを必要とする実験条件では、播種する前にMDSCをオルガノイドおよびCFSE標識CTLと混合してください。MDSC/CTL 比は 4:1 にする必要があります。
  4. プレートを37°Cで15分間インキュベートし、細胞基底膜マトリックス液滴を固化させます。
  5. 細胞基底膜マトリックス液を予熱したオルガノイド培地で覆います。
  6. オルガノイド/免疫細胞共培養液を5% CO2 中で37°Cに維持します。

結果

完了すると、胃オルガノイドはウェル内に球体として現れ、通常は埋め込み後2〜4日以内に現れます(図1)。 図1A は、規則的な膜を示す活発な胃オルガノイド培養を示しています。腫瘍オルガノイドは、多くの場合、患者サンプルに固有の異なる形態を示します。失敗した培養物は、組織の最初の消化から緻密に見えるか、...

ディスカッション

私たちは、標的療法の有効性を予測するための前臨床モデルとして使用できる可能性のあるヒト由来の自家胃がんオルガノイド/免疫細胞共培養の使用を提示し、最終的に治療結果と患者の予後を改善します。免疫細胞とのがんオルガノイド共培養は報告されていますが、胃がんの研究におけるこのような共培養システムの報告は今回が初めてです。他にも、オルガ?...

開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

本研究は、NIH (NIAID) 5U19AI11649105 (PIs: Weiss and Wells, Project Leader 1: Zavros) および NIH (NIDDK) 2 R01 DK083402-06A1 (PI: Zavros) の助成金の支援を受けました。このプロジェクトは、シンシナティの消化器疾患研究コアセンターのPHS助成金P30 DK078392(統合形態学コア)および5P30CA023074アリゾナ大学がんセンター–がんセンターサポート助成金(PI:Sweasy)によって部分的に支援されました。チェット・クロッソン氏(Live Microscopy Core, University of Cincinnati)およびザブロス研究室の元メンバーであるNina Steele博士とLoryn Holokai博士の協力に対し、オルガノイド培養システムの開発に貢献していただいたことに感謝いたします。胃オルガノイド/免疫細胞共培養の開発のために組織と血液を提供することに同意してくださった患者様に心から感謝します。彼らの研究への参加意欲がなければ、この仕事は不可能でした。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
12 well plateMidwest Scientific92012
15 mL Falcon tubeFisher scientific12-565-269
24 well plateMidwest Scientific92024
30 μm filtersMiltenyi Biotec130-041-407
40 μm filters (Fisher Scientific)Fisher scientific352340
5 mL round bottom polystyrene tubesFisher scientific14956-3C
50 mL Falcon tubeFisher scientific12-565-271
Advanced DMEM/F12Thermo Fisher Scientific12634010
AIMVThermo Fisher Scientific12055091Basal medium for PBMCs and DCs
Amphotericin B/ GentamicinThermo Fisher ScientificR-01510
B-27 supplementThermo Fisher Scientific12587010
β-mercaptoethanolThermo Fisher Scientific800-120
Bone morphogenetic protein inhibitor (Noggin)Peprotech250-38
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma AldrichA7906
CabozantinibSelleckchemS1119
Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)Biolegend423801
Collagenase ASigma AldrichC9891
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)Fisher scientific14190-144cell separation buffer
EasySep BufferStem Cell Technologies20144Contains Enrichment Cocktail and Magnetic Particles used in CTL culture
EasySep Human CD8+ T Cell Enrichment KitStem Cell Technologies19053cell separation magnet
EasySep MagnetStem Cell TechnologiesSN12580
EDTASigma AldrichE6758
Epidermal Growth Factor (EGF)Peprotech315-09
Farma Series 3 Water Jacketed IncubatorThermo Fisher Scientific4120
Fetal Calf Serum (FCS)Atlanta BiologicalsSI2450H
Fibroblast growth factor 10 (FGF-10)Peprotech100-26density gradient medium
Ficoll-PaqueGE Healthcare171440-02
Gastrin 1Tocris30061
GelatinCell Biologics6950
GM-CSFThermo Fisher ScientificPHC6025
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Thermo Fisher Scientific14175095
HEPES (2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid)Fisher scientificBP299-100
Human Epithelial Cell Basal MediumCell BiologicsH6621
human serum ABGemini Bioscience21985023
Hyaluronidase Type IV-SSigma AldrichH3884
Insulin-Transferrin-SeleniumThermo Fisher Scientific41400045
Interleukin 1β (IL-1β)Thermo Fisher ScientificRIL1BI
Interleukin 6 (IL-6)Thermo Fisher ScientificRIL6I
Interleukin 7 (IL-7)Thermo Fisher ScientificRP-8645
KanamycinThermo Fisher Scientific11815024
L-glutamineFisher scientific350-50-061basement membrane matrix
Matrigel (Corning Life Sciences, Corning, NY)Fisher scientificCB40230C
N-2 supplementThermo Fisher Scientific17502048
N-acetyl-L-cysteineSigma AldrichA7250
Nicotinamide (Nicotinamide)Sigma AldrichN0636
PD-L1 inhibitorSelleckchemA2002
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher ScientificSV3000
PetridishFisher scientific07-202-030
Potassium chloride (KCl)Fisher scientific18-605-517
Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4)Fisher scientificNC0229895
prostaglandin E2 (PGE2)Sigma AldrichP0409
RPMI 1640Thermo Fisher Scientific11875119
Sodium chloride (NaCl)Fisher scientific18-606-419
Sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4)Fisher scientificNC0229893cell dissociation reagent
StemPro Accutase solutionThermo Fisher ScientificA1110501
Transforming growth factor beta 1 (TGF-β1)Thermo Fisher Scientific7754-BH-005/CF
Tumor necrosis factor α (TNF-α)Thermo Fisher ScientificPHC3015
Vascular endothelial growth factor (VEGF)Thermo Fisher ScientificRVGEFI
Y-27632 ROCK inhibitorSigma AldrichY0350

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