Um modelo pré-clínico de co-cultura autóloga de câncer gástrico orgânico/células imunes de origem humana para prever a eficácia de terapias direcionadas

Resumo

Os objetivos do protocolo são usar essa abordagem para 1) entender o papel do microambiente tumoral gástrico imunossupressor e 2) prever a eficácia da resposta do paciente, aumentando assim a taxa de sobrevida dos pacientes.

Resumo

Os tumores que expressam o ligante de morte celular programada 1 (PD-L1) interagem com a proteína de morte celular programada 1 (PD-1) em linfócitos T citotóxicos CD8+ (CTLs) para evitar a vigilância imunológica, levando à inibição da proliferação, sobrevivência e função efetora de CTL e, subsequentemente, à persistência do câncer. Aproximadamente 40% dos cânceres gástricos expressam PD-L1, mas a taxa de resposta à imunoterapia é de apenas 30%. Apresentamos o uso de co-cultura de organoide/células imunes de câncer gástrico autólogo derivado de humanos como um modelo pré-clínico que pode prever a eficácia de terapias direcionadas para melhorar o resultado de pacientes com câncer. Embora co-culturas de organoides de câncer com células imunes tenham sido relatadas, essa abordagem de co-cultura usa antígeno tumoral para pulsar as células dendríticas apresentadoras de antígenos. As células dendríticas (DCs) são então cultivadas com as células T CD8+ do paciente para expandir a atividade citolítica e a proliferação desses linfócitos T antes da co-cultura. Além disso, a diferenciação e a função imunossupressora de células supressoras derivadas de mielóides (MDSCs) em cultura são investigadas dentro deste sistema de co-cultura. Essa abordagem organoide pode ser de amplo interesse e apropriada para prever a eficácia da terapia e o resultado do paciente em outros tipos de câncer, incluindo câncer de pâncreas.

Introdução

O câncer gástrico é o quinto câncer mais comum em todo o mundo ¹. O diagnóstico e o tratamento efetivos do Helicobacter pylori (H. pylori) resultaram em baixa incidência de câncer gástrico nos Estados Unidos ². No entanto, a taxa de sobrevida em 5 anos para pacientes diagnosticados com essa malignidade é de apenas 29%, tornando o câncer gástrico um importante desafio médico³. O objetivo dos métodos apresentados aqui é desenvolver uma abordagem para prever com precisão as respostas à imunoterapia em pacientes individuais. Os tumores sólidos consistem em células cancerígenas e vários tipos de células estromais, endoteliais e hematopoiéticas, incluindo macrófagos, células supressoras derivadas de mielóides (MDSCs) e linfócitos (revisado em ^4,5). As interações entre as células-tronco cancerígenas e o microambiente tumoral (TME) afetam substancialmente as características do tumor e a resposta do paciente ao tratamento. Essa abordagem se esforça para permitir que os investigadores adquiram conhecimento para o desenvolvimento de medicamentos pré-clínicos e descoberta de biomarcadores para o tratamento personalizado do câncer gástrico.

O método apresentado aqui usa co-culturas autólogas de células organoides/imunes derivadas de humanos geradas a partir de pacientes com câncer gástrico para entender o papel imunossupressor das MDSCs. É apresentado um modelo pré-clínico que pode prever a eficácia de terapias direcionadas para melhorar a sobrevida dos pacientes. Co-culturas de organoides cancerígenos com células imunes têm sido amplamente relatadas no campo do câncer de pâncreas 6,7,8,9,10. No entanto, essas co-culturas não foram relatadas para estudar o câncer gástrico. No geral, este método demonstra a co-cultura de células imunes autólogas derivadas de humanos dentro do mesmo ambiente de matriz que os organoides cancerígenos, permitindo assim que as células imunes entrem em contato com os organoides alvo.

O estudo de Tiriac et ^al.10 relatou que os organoides de câncer de pâncreas derivados de pacientes, que exibiam respostas heterogêneas a quimioterápicos padrão de tratamento, poderiam ser agrupados em assinaturas de expressão gênica baseadas em organoides de quimiossensibilidade que poderiam prever melhores respostas do paciente à quimioterapia. Os pesquisadores propuseram que o perfil molecular e terapêutico combinado de organoides de câncer de pâncreas pode prever a resposta clínica¹⁰. Os dados dos ensaios coclínicos de Yao et ^al.11 também mostraram que os organoides derivados do câncer retal representam fisiopatologia e alterações genéticas semelhantes aos tecidos tumorais do paciente em resposta à quimiorradiação. Assim, é fundamental que as culturas organoides sejam utilizadas no contexto das células imunes do paciente e do fenótipo imune tumoral ao utilizar essas culturas como modelos preditivos para a terapia.

Tumores que expressam PD-L1 que interagem com PD-1 inibem a proliferação, sobrevivência e função efetora de linfócitos T citotóxicos CD8+ 12,13,14. Enquanto aproximadamente 40% dos cânceres gástricos expressam PD-L1, apenas 30% desses pacientes respondem à imunoterapia 15,16,17. Os anticorpos anti-PD1 são utilizados em ensaios clínicos para o tratamento do câncer gástrico 18,19,20. No entanto, atualmente não existem modelos pré-clínicos que permitam testar a eficácia terapêutica para cada paciente. Otimizar a cultura organoide de forma que as células imunes do paciente sejam incluídas no sistema permitiria potencialmente a identificação individualizada da eficácia da imunoterapia.

Protocolo

A aprovação foi obtida para a coleta de tecidos com biópsia humana de tumores de pacientes (1912208231R001, Programa de Proteção a Seres Humanos da Universidade do Arizona; Número do protocolo IRB: 1099985869R001, Programa de Proteção a Seres Humanos da Universidade do Arizona TARGHETS).

1. Estabelecimento de organoides gástricos derivados de pacientes a partir de biópsias

1. Coletar 1-2 mm de tecidos biopsiados humanos da região tumoral de pacientes com câncer gástico submetidos à gastroduodenoscopia esofágica em solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS) (Tabela 1).
   NOTA: Todos os procedimentos devem ser realizados em um ambiente asséptico usando materiais e reagentes estéreis.
2. Pique os tecidos biopsiados usando lâminas de bisturi em uma placa de Petri. Transfira os tecidos picados para um tubo cônico de 15 ml e adicione 5-10 mL de 1x PBS.
3. Centrifugue a 300 × g por 5 min em temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante. Adicione 1-2 mL de tampão de digestão pré-aquecido (Tabela 1) aos tecidos peletizados.
4. Incubar a 37 °C durante 15-30 min, dependendo do tamanho dos tecidos picados. Monitore o status da digestão olhando ao microscópio em busca de pequenos aglomerados de células a cada 5-10 minutos.
5. Pare a digestão diluindo 5 vezes com o meio Eagle modificado de Dulbecco / meio F-12 de Ham (DMEM / F-12 avançado). Se forem visíveis aglomerados de matérias não digeridas, filtrar os tecidos através de filtros de 30 μm. Colete o fluxo.
6. Centrifugue o fluxo a 300 × g por 5 min em temperatura ambiente para granular as células. Descarte o sobrenadante.
7. Ressuspenda as células peletizadas (10.000-100.000) em um volume apropriado (2-4 mL) de matriz de membrana basal descongelada (consulte a Tabela de Materiais) no gelo. Semeie como gotas de matriz de membrana basal de 30-50 μL em placas de cultura de 24 poços.
8. Incubar as placas a 37 °C durante 15 min para permitir que as gotas da matriz da membrana celular-basal se solidifiquem. Cubra as gotas da matriz da membrana celular-basal com meio de cultura organoide gástrico pré-aquecido (Tabela 1).
9. Manter as culturas organoides a 37 °C em CO₂ a 5%. Substitua o meio de cultura por meio fresco a cada 3-4 dias, dependendo do crescimento do organoide. Passe os organoides uma vez a cada 7-10 dias na proporção de 1:3.

2. Estabelecimento de organoides gástricos derivados de pacientes a partir de espécimes cirúrgicos

1. Coletar tecidos de câncer gástrico humano de amostras ressecadas de pacientes com câncer gástrico durante procedimentos cirúrgicos em solução salina tamponada com fosfato de 1x Dulbecco (DPBS) suplementada com antibióticos (Tabela 1).
   NOTA: Todos os procedimentos a partir de agora devem ser processados em uma cabine de biossegurança, mantendo um ambiente asséptico e usando materiais e reagentes estéreis.
2. Pique os tecidos ressecados usando lâminas de bisturi cirúrgico em uma placa de Petri. Lave os tecidos picados com 5-10 mL de 1x DPBS contendo antibióticos.
3. Transfira o tecido para um tubo cônico de 50 mL. Adicione 10 mL de tampão de remoção de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) pré-aquecido aos tecidos picados. Monitore o status da digestão a cada 5-10 min. Incubar o tubo num agitador a 37 °C durante 10 min.
4. Deixe os tecidos assentarem no fundo do tubo, remova o tampão EDTA sem perturbar os tecidos e adicione 10 mL de tampão EDTA fresco. Incubar o tubo num agitador a 37 °C durante 5 min.
5. Deixe os tecidos assentarem no fundo do tubo. Remover o tampão EDTA e lavar os tecidos duas vezes (seguir o passo 2.4) com 10 ml de DMEM/F-12 avançado suplementado com antibióticos (sem centrífuga) (Tabela 1).
6. Adicione 5-10 mL de tampão de digestão pré-aquecido (Tabela 1) aos tecidos, dependendo do tamanho do tecido. Incubar o tubo a 37 °C durante 15-30 min com agitação ligeira, dependendo do tamanho e da textura dos tecidos. Verifique o aparecimento de aglomerados de células ao microscópio a cada 10 minutos.
7. Pare a digestão diluindo duas vezes com DMEM / F-12 avançado frio mais antibióticos. Filtrar os tecidos não digeridos através de filtros de 40 μm e recolher o fluxo.
8. Centrifugar o fluxo a 400 × g durante 5 min a 4 °C para peletar as células. Descarte o sobrenadante e lave as células com 1x DPBS frio mais antibióticos a 400 × g por 5 min a 4 ° C. Descarte cuidadosamente o sobrenadante e armazene as células no gelo.
9. Ressuspenda as células peletizadas em um volume apropriado da matriz da membrana basal no gelo. Semeie gotas de matriz de membrana basal de 30-50 μL em placas tratadas com cultura de células de 24 ou 12 poços.
10. Incubar as placas a 37 °C durante 15 min para permitir que as gotas da matriz da membrana celular-basal se solidifiquem como uma cúpula. Cubra a cúpula da matriz da membrana da membrana basal da célula com meio de cultura organoide gástrico pré-aquecido (Tabela 1).
11. Manter as culturas organoides a 37 °C em 5% de CO₂. Substitua o meio de cultura por meio fresco a cada 3-4 dias, dependendo do crescimento do organoide. Passe os organoides uma vez a cada 7-10 dias na proporção de 1:2 ou 1:3, com base na densidade do organoide.

3. Manutenção e expansão de culturas organoides

NOTA: Todos os procedimentos devem ser realizados em um ambiente asséptico usando materiais e reagentes estéreis.

1. Manutenção e expansão
   1. Mantenha as culturas organoides por 7 a 10 dias até que estejam 70-80% confluentes. Colha os organoides em DMEM gelado. Transfira os organoides para tubos de poliestireno de fundo redondo de 5 mL.
   2. Centrifugue os organoides a 400 × g por 5 min a 4 °C para granular as células. Remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 1 mL de solução reagente de dissociação celular pré-aquecida. Incubar os organoides a 37 °C durante 6 min.
   3. Passe suavemente os organoides por uma agulha de 26 G 4 vezes. Adicione 2 mL de DMEM para interromper a ação do reagente de dissociação celular.
   4. Centrifugue os organoides a 400 × g durante 5 min a 4 °C para peletar as células. Descarte cuidadosamente o sobrenadante e armazene as células no gelo.
   5. Ressuspenda as células peletizadas em um volume apropriado de matriz da membrana basal no gelo. Semeie 30-50 μL das gotas da matriz da membrana basal da célula em placas tratadas com cultura de células de 24 ou 12 poços.
   6. Incubar as placas a 37 °C durante 15 min para permitir que as gotas da matriz da membrana celular-basal se solidifiquem como uma cúpula. Cubra a cúpula da matriz da membrana celular-célula-basal com meio de cultura organoide gástrico pré-aquecido (ver Tabela 1).
   7. Manter as culturas organoides a 37 °C em 5% de CO₂. Substitua o meio de cultura por meio fresco a cada 3-4 dias, dependendo do crescimento do organoide. Repita a passagem dos organoides uma vez a cada 7-10 dias na proporção de 1:2 ou 1:3, com base na densidade do organoide.
2. Expansão de linhagens celulares derivadas de organoides
   1. Colha os organoides quando estiverem 70-80% confluentes. Alimente as células aderentes às placas plásticas com meio de cultura organoide gástrico e mantenha a cultura alimentando-as a cada 3-4 dias, dependendo do crescimento celular.
   2. Passe as células quando atingirem 80-90% de confluência.
      1. Remova o meio de cultura e lave suavemente a placa com DPBS pré-aquecido. Adicione 1 mL de reagente de dissociação celular pré-aquecido.
      2. Incubar as células durante 5 min a 37 °C. Colha as células em 2 mL de DMEM.
      3. Centrifugar as células a 400 × g durante 5 min a 4 °C. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em meio de cultura organoide gástrico ou em meio de cultura de células epiteliais gástricas humanas (Tabela 1).
   3. Plaquear as células de 3.2.2.3 em placas revestidas com matriz de membrana basal ou revestidas com gelatina. Manter as culturas organoides a 37 °C em 5% de CO₂. Substitua o meio por meio fresco a cada dia alternado, dependendo do crescimento celular. Repita a passagem das células uma vez a cada 7 a 10 dias na proporção de 1:2 ou 1:3, com base na densidade celular.
      1. Para revestir as placas com matriz de membrana basal, dilua a matriz em água gelada de grau de cultura de células na proporção de 1:10. Revestir uniformemente a placa com 1 ml de solução de matriz diluída gelada utilizando um espalhador de células e incubar a placa revestida a 37 °C durante 2 h. Remova a solução de revestimento restante e deixe a placa secar sem a tampa dentro da capa de biossegurança por 30 min, logo antes de plaquear as células.
      2. Para revestir as placas com gelatina, cubra uniformemente a placa com 1 mL de uma solução de revestimento à base de gelatina gelada. Incube a placa revestida em temperatura ambiente por 5 min. Remova a solução de gelatina restante e coloque as células ressuspensas.

4. Cultura de células imunes de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs)

NOTA: Todos os procedimentos devem ser realizados em ambiente asséptico usando materiais e reagentes estéreis.

1. Isolamento PBMC
   1. Dilua o sangue total com um volume igual de 1x PBS.
   2. Dependendo do volume total da amostra de sangue diluída, dispense um volume apropriado de meio de gradiente de densidade (consulte a Tabela de Materiais) em um tubo de 15 mL.
      NOTA: A proporção recomendada é de 3 mL do meio de gradiente de densidade para 4 mL da amostra de sangue diluído.
   3. Colocar cuidadosamente a amostra de sangue diluída no meio de gradiente de densidade. Centrifugue a 400 × g por 30 min-1 h sem freio.
   4. Após a centrifugação, transfira cuidadosamente as células mononucleares na interface para um novo tubo cônico de 15 mL. Dilua as células mononucleares com 3 volumes de 1x PBS.
   5. Centrifugue a 400 × g por 10 min. Descarte o sobrenadante. Repita uma vez.
   6. Ressuspender as células peletizadas num meio adequado para aplicações a jusante ou criopreservar como matérias-primas congeladas.
   7. Se necessário, determine o rendimento e a viabilidade celular das PBMCs usando o ensaio de exclusão do corante azul de tripano.
2. Cultura de células dendríticas humanas
   1. Ressuspenda os PBMCs isolados em meio PBMC (consulte a Tabela de Materiais e a Tabela 1) e coloque-os em uma placa de cultura de tecidos de 24 poços por 1-2 h a 37 ° C em 5% de CO₂.
   2. Bata firmemente na placa de cultura e descarte o meio de cultura gasto contendo células não aderentes.
   3. Adicione o meio de cultura DC (Tabela 1) às células aderentes. Manter as culturas durante 3 dias a 37 °C em CO_{2% a} 5%. Substituir o meio sobrenadante por meio de cultura fresco em dias alternados.
   4. No dia 3, substitua o meio exaurido por meio de maturação DC fresco (Tabela 1). Manter as culturas durante 24 h a 37 °C a 5% de CO₂.
3. Cultura de linfócitos T citotóxicos humanos (CTLs)
   1. Transfira 1 mL de PBMCs para um tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 mL.
   2. Adicione 50 μL de coquetel de enriquecimento (consulte a Tabela de Materiais) aos PBMCs. Incube por 10 min em temperatura ambiente.
   3. Adicione 150 μL de partículas magnéticas (tabela de materiais) à amostra. Incube por 5 min em temperatura ambiente.
   4. Aumente o volume da amostra para 2,5 mL com o tampão de separação de células (Tabela de Materiais). Coloque o tubo de fundo redondo de poliestireno em um ímã de separação de células (Tabela de Materiais) por 5 min para permitir a separação das células.
   5. Despeje a suspensão de células enriquecidas em um novo tubo cônico de 15 mL. Centrifugue a 300 × g por 5 min. Descarte o sobrenadante.
   6. Ressuspenda as células peletizadas e cultive em meio de cultura CTL (Tabela 1) por 24 h a 37 ° C em 5% de CO₂.
4. Cultura de células supressoras derivadas de mielóides humanos (MDSCs)
   1. PBMCs de cultura em meio de cultura MDSC (Tabela 1) por 7 dias a 37 ° C em CO_{5% 2} para enriquecer para MDSCs. Substitua o meio sobrenadante por meio de cultura fresco em dias alternados.
5. Co-cultura de DCs e CTLs
   1. Colete meio condicionado das culturas organoides.
   2. Remova suavemente 50% do meio da cultura DC amadurecida e substitua-o por meio condicionado derivado de organoide.
   3. Incubar as DCs com o meio condicionado derivado de organoide por 2 h a 37 ° C em 5% de CO₂.
   4. Colher os DCs pouco aderentes e centrifugá-los a 300 × g durante 5 min a 4 °C. Remova o sobrenadante, ressuspenda o pellet em meio de co-cultura RPMI e adicione esta suspensão celular de volta ao mesmo poço.
   5. Colha os CTLs da mesma linha de pacientes e transfira-os para os CDs maduros. Continue a co-cultura DC-CTL (Tabela 1) por 72 h a 37 ° C em 5% de CO2.

5. Estabelecimento de co-culturas de células organoides/imunes

1. Isolar os CTL das coculturas de DC e CTL utilizando um kit (ver Tabela de Materiais), conforme descrito anteriormente na secção 4.3.
2. Incubar os CTLs com 5 μM de éster succinimidílico de diacetato de carboxifluoresceína (CFSE) a 37 °C durante 20 min.
   NOTA: CFSE é um corante excitável a laser azul usado para monitoramento por citometria de fluxo de divisões celulares.
3. Colha os organoides e misture-os com CTLs marcados com CFSE. Mantendo a proporção CTL / organoide em 50.000 CTLs por 200 organoides, ressuspenda os organoides em um volume apropriado de matriz de membrana basal descongelada no gelo. Semeie como gotas de matriz de membrana basal de 25 μL em placas de cultura de tecidos de 24 poços.
   NOTA: Para condições experimentais que requerem MDSCs, misture os MDSCs com os organoides e CTLs marcados com CFSE antes da semeadura. A relação MDSC/CTL deve ser de 4:1.
4. Incubar as placas a 37 °C durante 15 min para permitir que as gotas da matriz da membrana celular-basal se solidifiquem.
5. Cubra as gotas da matriz da membrana basal da célula com meio de cultura organoide pré-aquecido.
6. Manter as coculturas de células organoides/imunes a 37 °C em CO₂ a 5% até à análise.

Resultados

Quando concluídos, os organoides gástricos aparecem como esferas dentro do poço, normalmente dentro de 2 a 4 dias após a incorporação (Figura 1). A Figura 1A demonstra uma próspera cultura organoide gástrica que exibe uma membrana regular. Os organoides tumorais geralmente exibem uma morfologia divergente que é exclusiva da amostra do paciente. As culturas malsucedidas parecerão densas ou não exibirão nenhum crescime...

Discussão

Apresentamos o uso de co-cultura de células organoides/imunes de câncer gástrico autólogo derivado de humanos que pode ser usado como um modelo pré-clínico para prever a eficácia de terapias direcionadas para, em última análise, melhorar o resultado do tratamento e o prognóstico do paciente. Embora co-culturas organoides de câncer com células imunes tenham sido relatadas, este é o primeiro relato de tal sistema de co-cultura para o estudo do câncer gástrico. Vários outros...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 well plate	Midwest Scientific	92012
15 mL Falcon tube	Fisher scientific	12-565-269
24 well plate	Midwest Scientific	92024
30 μm filters	Miltenyi Biotec	130-041-407
40 μm filters (Fisher Scientific)	Fisher scientific	352340
5 mL round bottom polystyrene tubes	Fisher scientific	14956-3C
50 mL Falcon tube	Fisher scientific	12-565-271
Advanced DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	12634010
AIMV	Thermo Fisher Scientific	12055091	Basal medium for PBMCs and DCs
Amphotericin B/ Gentamicin	Thermo Fisher Scientific	R-01510
B-27 supplement	Thermo Fisher Scientific	12587010
β-mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	800-120
Bone morphogenetic protein inhibitor (Noggin)	Peprotech	250-38
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7906
Cabozantinib	Selleckchem	S1119
Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)	Biolegend	423801
Collagenase A	Sigma Aldrich	C9891
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Fisher scientific	14190-144	cell separation buffer
EasySep Buffer	Stem Cell Technologies	20144	Contains Enrichment Cocktail and Magnetic Particles used in CTL culture
EasySep Human CD8+ T Cell Enrichment Kit	Stem Cell Technologies	19053	cell separation magnet
EasySep Magnet	Stem Cell Technologies	SN12580
EDTA	Sigma Aldrich	E6758
Epidermal Growth Factor (EGF)	Peprotech	315-09
Farma Series 3 Water Jacketed Incubator	Thermo Fisher Scientific	4120
Fetal Calf Serum (FCS)	Atlanta Biologicals	SI2450H
Fibroblast growth factor 10 (FGF-10)	Peprotech	100-26	density gradient medium
Ficoll-Paque	GE Healthcare	171440-02
Gastrin 1	Tocris	30061
Gelatin	Cell Biologics	6950
GM-CSF	Thermo Fisher Scientific	PHC6025
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Thermo Fisher Scientific	14175095
HEPES (2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid)	Fisher scientific	BP299-100
Human Epithelial Cell Basal Medium	Cell Biologics	H6621
human serum AB	Gemini Bioscience	21985023
Hyaluronidase Type IV-S	Sigma Aldrich	H3884
Insulin-Transferrin-Selenium	Thermo Fisher Scientific	41400045
Interleukin 1β (IL-1β)	Thermo Fisher Scientific	RIL1BI
Interleukin 6 (IL-6)	Thermo Fisher Scientific	RIL6I
Interleukin 7 (IL-7)	Thermo Fisher Scientific	RP-8645
Kanamycin	Thermo Fisher Scientific	11815024
L-glutamine	Fisher scientific	350-50-061	basement membrane matrix
Matrigel (Corning Life Sciences, Corning, NY)	Fisher scientific	CB40230C
N-2 supplement	Thermo Fisher Scientific	17502048
N-acetyl-L-cysteine	Sigma Aldrich	A7250
Nicotinamide (Nicotinamide)	Sigma Aldrich	N0636
PD-L1 inhibitor	Selleckchem	A2002
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	SV3000
Petridish	Fisher scientific	07-202-030
Potassium chloride (KCl)	Fisher scientific	18-605-517
Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4)	Fisher scientific	NC0229895
prostaglandin E2 (PGE2)	Sigma Aldrich	P0409
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	11875119
Sodium chloride (NaCl)	Fisher scientific	18-606-419
Sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4)	Fisher scientific	NC0229893	cell dissociation reagent
StemPro Accutase solution	Thermo Fisher Scientific	A1110501
Transforming growth factor beta 1 (TGF-β1)	Thermo Fisher Scientific	7754-BH-005/CF
Tumor necrosis factor α (TNF-α)	Thermo Fisher Scientific	PHC3015
Vascular endothelial growth factor (VEGF)	Thermo Fisher Scientific	RVGEFI
Y-27632 ROCK inhibitor	Sigma Aldrich	Y0350