JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Protokolün amacı, bu yaklaşımı 1) immünosüpresif mide tümörü mikroçevresinin rolünü anlamak ve 2) hasta yanıtının etkinliğini tahmin etmek, böylece hastaların hayatta kalma oranını artırmak için kullanmaktır.

Özet

Programlanmış hücre ölüm ligandı 1'i (PD-L1) eksprese eden tümörler, CD8 + sitotoksik T lenfositleri (CTL'ler) üzerinde programlanmış hücre ölümü proteini 1 (PD-1) ile etkileşime girerek CTL proliferasyonunun, sağkalımının ve efektör fonksiyonunun inhibisyonuna ve ardından kanser kalıcılığına yol açan immün sürveyanstan kaçar. Mide kanserlerinin yaklaşık %40'ı PD-L1 eksprese eder, ancak immünoterapiye yanıt oranı sadece %30'dur. İnsan kaynaklı otolog mide kanseri organoid/immün hücre ko-kültürünün, kanser hastalarının sonuçlarını iyileştirmek için hedefe yönelik tedavilerin etkinliğini öngörebilecek preklinik bir model olarak kullanımını sunuyoruz. İmmün hücrelerle kanser organoid ko-kültürleri bildirilmiş olmasına rağmen, bu ko-kültür yaklaşımı, antijen sunan dendritik hücreleri nabızlamak için tümör antijenini kullanır. Dendritik hücreler (DC'ler) daha sonra ko-kültürden önce bu T lenfositlerinin sitolitik aktivitesini ve proliferasyonunu genişletmek için hastanın CD8 + T hücreleri ile kültürlenir. Ek olarak, kültürdeki miyeloid türevli baskılayıcı hücrelerin (MDSC'ler) farklılaşması ve immünosupresif fonksiyonu bu ko-kültür sistemi içinde araştırılmaktadır. Bu organoid yaklaşım, pankreas kanseri de dahil olmak üzere diğer kanserlerde tedavinin etkinliğini ve hasta sonucunu tahmin etmek için geniş ilgi çekici ve uygun olabilir.

Giriş

Mide kanseri dünya çapında en sık görülen beşinci kanserdir 1. Helicobacter pylori'nin (H. pylori) etkili tanı ve tedavisi, Amerika Birleşik Devletleri'nde mide kanseri insidansının düşük olmasına neden olmuştur 2. Bununla birlikte, bu malignite teşhisi konan hastalar için 5 yıllık sağkalım oranı sadece %29'dur ve bu da mide kanserini önemli bir tıbbi zorluk haline getirmektedir3. Burada sunulan yöntemlerin amacı, bireysel hastalarda immünoterapi yanıtlarını doğru bir şekilde tahmin etmek için bir yaklaşım geliştirmektir. Katı tümörler, kanser hücrelerinden ve makrofajlar, miyeloid türevli baskılayıcı hücreler (MDSC'ler) ve lenfositler dahil olmak üzere çeşitli stromal, endotelyal ve hematopoietik hücrelerden oluşur (4,5'te gözden geçirilmiştir). Kanser kök hücreleri ve tümör mikroçevresi (TME) arasındaki etkileşimler, tümör özelliklerini ve hastanın tedaviye yanıtını önemli ölçüde etkiler. Bu yaklaşım, araştırmacıların mide kanserinin kişiselleştirilmiş tedavisi için klinik öncesi ilaç geliştirme ve biyobelirteç keşfi için bilgi edinmelerini sağlamaya çalışmaktadır.

Burada sunulan yöntem, MDSC'lerin immünosupresif rolünü anlamak için mide kanseri hastalarından üretilen insan kaynaklı otolog organoid/immün hücre ko-kültürlerini kullanır. Sunulan, hastaların sağkalımını iyileştirmek için hedefe yönelik tedavilerin etkinliğini tahmin edebilen klinik öncesi bir modeldir. Bağışıklık hücreleri ile kanser organoid ko-kültürleri, pankreas kanseri alanında 6,7,8,9,10 yaygın olarak bildirilmiştir. Bununla birlikte, bu tür ko-kültürlerin mide kanserini incelemek için rapor edilmemiştir. Genel olarak, bu yöntem, otolog insan kaynaklı bağışıklık hücrelerinin kanser organoidleri ile aynı matris ortamında birlikte kültürlendiğini ve böylece bağışıklık hücrelerinin hedef organoidlerle temas halinde olmasına izin verdiğini gösterir.

Tiriac ve ark.10 tarafından yapılan çalışma, standart bakım kemoterapötiklerine heterojen yanıtlar sergileyen hasta kaynaklı pankreas kanseri organoidlerinin, hastaların kemoterapiye daha iyi yanıtlarını tahmin edebilen kemosensitivitenin organoid tabanlı gen ekspresyon imzaları olarak gruplandırılabileceğini bildirmiştir. Araştırmacılar, pankreas kanseri organoidlerinin kombine moleküler ve terapötik profillemesinin klinik yanıtı öngörebileceğini öne sürdüler10. Yao ve ark.11'den elde edilen ortak klinik çalışma verileri, rektum kanseri kaynaklı organoidlerin, kemoradyasyona yanıt olarak hasta tümör dokularına benzer patofizyoloji ve genetik değişiklikleri temsil ettiğini de göstermiştir. Bu nedenle, organoid kültürlerin, bu kültürler tedavi için öngörücü modeller olarak kullanılırken, hastanın bağışıklık hücreleri ve tümör bağışıklık fenotipi bağlamında kullanılması esastır.

PD-1 ile etkileşime giren PD-L1 eksprese eden tümörler, CD8 + sitotoksik T lenfosit proliferasyonunu, sağkalımını ve efektör fonksiyonunu inhibe eder 12,13,14. Mide kanserlerinin yaklaşık %40'ı PD-L1 eksprese ederken, bu hastaların sadece %30'u immünoterapiye yanıt vermektedir 15,16,17. Anti-PD1 antikorları mide kanseri tedavisi için klinik çalışmalarda kullanılmaktadır 18,19,20. Bununla birlikte, şu anda her hasta için terapötik etkinliğin test edilmesine izin veren klinik öncesi modeller bulunmamaktadır. Organoid kültürünün, hastanın bağışıklık hücrelerinin sisteme dahil edileceği şekilde optimize edilmesi, potansiyel olarak immünoterapinin etkinliğinin bireyselleştirilmiş olarak tanımlanmasına izin verecektir.

Protokol

Hasta tümörlerinden insan biyopsisi yapılan dokuların toplanması için onay alındı (1912208231R001, Arizona Üniversitesi İnsan Denekleri Koruma Programı; IRB protokol numarası: 1099985869R001, Arizona Üniversitesi İnsan Konularını Koruma Programı TARGHETS).

1. Biyopsilerden hasta kaynaklı mide organoidlerinin oluşturulması

  1. Özofagus gastro-duodenoskopisi yapılan gaz kanseri hastalarının tümör bölgesinden 1-2 mm insan biyopsisi yapılan dokuları 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde toplayın (Tablo 1).
    NOT: Bundan böyle tüm prosedürler steril malzemeler ve reaktifler kullanılarak aseptik bir ortamda gerçekleştirilmelidir.
  2. Biyopsi yapılan dokuları bir Petri kabı üzerinde neşter bıçakları kullanarak kıyın. Kıyılmış dokuları 15 ml'lik konik bir tüpe aktarın ve 5-10 mL 1x PBS ekleyin.
  3. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Peletlenmiş dokulara 1-2 mL önceden ısıtılmış sindirim tamponu (Tablo 1) ekleyin.
  4. Kıyma dokularının boyutuna bağlı olarak 37 ° C'de 15-30 dakika inkübe edin. Her 5-10 dakikada bir küçük hücre kümeleri için mikroskop altında bakarak sindirim durumunu izleyin.
  5. Soğuk Advanced Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium/Ham'ın F-12 medium'u (Advanced DMEM/F-12) ile 5 kat seyrelterek sindirimi durdurun. Sindirilmemiş materyal kümeleri görünüyorsa, dokuları 30 μm filtrelerden süzün. Akışı toplayın.
  6. Hücreleri peletlemek için akışı 300 × g'da oda sıcaklığında 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
  7. Peletlenmiş hücreleri (10.000-100.000) uygun bir hacimde (2-4 mL) çözülmüş bazal membran matrisinde ( Malzeme Tablosuna bakınız) buz üzerinde yeniden süspanse edin. 30-50 μL hücre-bazal membran matrisi olarak tohum, 24 oyuklu kültür plakalarında düşer.
  8. Hücre bazındaki membran matris damlalarının katılaşmasını sağlamak için plakaları 37 °C'de 15 dakika inkübe edin. Hücre-bazal membran matris damlalarını önceden ısıtılmış gastrik organoid kültür ortamı ile kaplayın (Tablo 1).
  9. Organoid kültürleri %5 CO2'de 37 ° C'de tutun. Organoid büyümesine bağlı olarak kültür ortamını her 3-4 günde bir taze ortamla değiştirin. Organoidleri her 7-10 günde bir 1: 3 oranında geçirin.

2. Cerrahi örneklerden hasta kaynaklı mide organoidlerinin oluşturulması

  1. Cerrahi prosedürler sırasında mide kanseri hastalarının rezeke edilen örneklerinden insan mide kanseri dokularını, antibiyotiklerle desteklenmiş 1x Dulbecco'nun fosfat tamponlu salininde (DPBS) toplayın (Tablo 1).
    NOT: Bundan sonraki tüm prosedürler, aseptik bir ortam sağlanarak ve steril malzemeler ve reaktifler kullanılarak bir biyogüvenlik kabininde işlenmelidir.
  2. Bir Petri kabı üzerinde cerrahi neşter bıçakları kullanarak rezeke edilen dokuları kıyın. Kıyılmış dokuları antibiyotik içeren 5-10 mL 1x DPBS ile yıkayın.
  3. Dokuyu 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Kıyılmış dokulara 10 mL önceden ısıtılmış etilendiamin tetraasetik asit (EDTA) sıyırma tamponu ekleyin. Her 5-10 dakikada bir sindirim durumunu izleyin. Tüpü 37 ° C'lik bir çalkalayıcıda 10 dakika inkübe edin.
  4. Dokuların tüpün dibine yerleşmesine izin verin, dokuları rahatsız etmeden EDTA tamponunu çıkarın ve 10 mL taze EDTA tamponu ekleyin. Tüpü 37 ° C'lik bir çalkalayıcıda 5 dakika inkübe edin.
  5. Dokuların tüpün dibine yerleşmesine izin verin. EDTA tamponunu çıkarın ve dokuları iki kez yıkayın (adım 2.4'ü izleyin), antibiyotiklerle desteklenmiş 10 mL ileri DMEM / F-12 ile (santrifüj yok) (Tablo 1).
  6. Doku boyutuna bağlı olarak dokulara 5-10 mL önceden ısıtılmış sindirim tamponu (Tablo 1) ekleyin. Dokuların boyutuna ve dokusuna bağlı olarak tüpü 37 ° C'de 15-30 dakika hafif çalkalama ile inkübe edin. Her 10 dakikada bir mikroskop altında hücre kümelerinin görünümünü kontrol edin.
  7. Soğuk Advanced DMEM/F-12 plus antibiyotiklerle iki kat seyrelterek sindirimi durdurun. Sindirilmemiş dokuları 40 μm filtrelerden süzün ve akışı toplayın.
  8. Hücreleri peletlemek için akışı 400 × g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 × g'da soğuk 1x DPBS artı antibiyotiklerle yıkayın. Süpernatanı dikkatlice atın ve hücreleri buz üzerinde saklayın.
  9. Peletlenmiş hücreleri buz üzerinde uygun bir bazal membran matrisi hacminde yeniden süspanse edin. Tohum 30-50 μL hücre-bazal membran matrisi, 24 veya 12 oyuklu hücre kültürü ile muamele edilmiş plakalara düşer.
  10. Hücreleri 37 °C'de 15 dakika inkübe edin, böylece hücre-bodrum zarı matris damlalarının bir kubbe şeklinde katılaşmasını sağlayın. Hücre bazal membran matris kubbesini önceden ısıtılmış gastrik organoid kültür ortamı ile kaplayın (Tablo 1).
  11. Organoid kültürleri %5 CO2'de 37 ° C'de tutun. Organoid büyümesine bağlı olarak kültür ortamını her 3-4 günde bir taze ortamla değiştirin. Organoidleri, organoid yoğunluğuna bağlı olarak her 7-10 günde bir 1: 2 veya 1: 3 oranında geçirin.

3. Organoid kültürlerin bakımı ve genişletilmesi

NOT - Tüm prosedürler, steril malzemeler ve reaktifler kullanılarak aseptik bir ortamda gerçekleştirilmelidir.

  1. Bakım ve genişletme
    1. Organoid kültürleri% 70-80 birleşene kadar 7-10 gün koruyun. Organoidleri buz gibi soğuk DMEM'de hasat edin. Organoidleri 5 mL yuvarlak tabanlı polistiren tüplere aktarın.
    2. Organoidleri pelet hücrelerine 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve peleti 1 mL önceden ısıtılmış hücre ayrışma reaktif çözeltisi içinde yeniden süspanse edin. Organoidleri 37 ° C'de 6 dakika inkübe edin.
    3. Organoidleri 26 G'lık bir iğneden 4 kez nazikçe geçirin. Hücre ayrışma reaktifinin etkisini durdurmak için 2 mL DMEM ekleyin.
    4. Hücreleri peletlemek için organoidleri 400 × g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice atın ve hücreleri buz üzerinde saklayın.
    5. Peletlenmiş hücreleri buz üzerinde uygun bir hacimde bazal membran matrisi içinde yeniden süspanse edin. Hücre bazal membran matrisinin 30-50 μL'lik tohumu, 24 veya 12 oyuklu hücre kültürü ile muamele edilmiş plakalara düşer.
    6. Hücreleri 37 °C'de 15 dakika inkübe edin, böylece hücre-bodrum zarı matris damlalarının bir kubbe şeklinde katılaşmasını sağlayın. Hücre-hücre-bazal membran matris kubbesini önceden ısıtılmış gastrik organoid kültür ortamı ile kaplayın (bkz. Tablo 1).
    7. Organoid kültürleri %5 CO2'de 37 ° C'de tutun. Organoid büyümesine bağlı olarak kültür ortamını her 3-4 günde bir taze ortamla değiştirin. Organoid yoğunluğuna bağlı olarak organoidlerin geçişini her 7-10 günde bir 1: 2 veya 1: 3 oranında tekrarlayın.
  2. Organoid türevli hücre hatlarının genişlemesi
    1. Organoidleri% 70-80 birleşik olduklarında hasat edin. Plastik plakalara yapışık olan hücreleri gastrik organoid kültür ortamı ile besleyin ve hücre büyümesine bağlı olarak 3-4 günde bir besleyerek kültürü sürdürün.
    2. Hücreleri% 80-90 birleşmeye ulaştıklarında geçirin.
      1. Kültür ortamını çıkarın ve plakayı önceden ısıtılmış DPBS ile nazikçe yıkayın. 1 mL önceden ısıtılmış hücre ayrışma reaktifi ekleyin.
      2. Hücreleri 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin. Hücreleri 2 mL DMEM'de hasat edin.
      3. Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 4 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve peleti gastrik organoid kültür ortamında veya insan gastrik epitel hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edin (Tablo 1).
    3. Hücreleri 3.2.2.3'ten bazal membran matris kaplı veya jelatin kaplı plakalar halinde plakalayın. Organoid kültürleri %5 CO2'de 37 ° C'de tutun. Hücre büyümesine bağlı olarak ortamı her alternatif günde bir taze ortamla değiştirin. Hücre yoğunluğuna bağlı olarak hücrelerin geçişini her 7-10 günde bir 1: 2 veya 1: 3 oranında tekrarlayın.
      1. Plakaları bazal membran matrisi ile kaplamak için, matrisi buz gibi soğuk hücre kültürü dereceli suda 1:10 oranında seyreltin. Plakayı bir hücre yayıcı kullanarak 1 mL buz gibi seyreltilmiş matris çözeltisi ile eşit şekilde kaplayın ve kaplanmış plakayı 37 ° C'de 2 saat inkübe edin. Kalan kaplama solüsyonunu çıkarın ve hücreleri kaplamadan hemen önce plakanın biyogüvenlik başlığının içinde kapak olmadan 30 dakika kurumasını bekleyin.
      2. Plakaları jelatin ile kaplamak için, plakayı 1 mL buz gibi soğuk jelatin bazlı bir kaplama solüsyonu ile eşit şekilde kaplayın. Kaplanmış plakayı oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Kalan jelatin çözeltisini çıkarın ve yeniden süspanse edilmiş hücreleri kaplayın.

4. Periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) bağışıklık hücrelerinin kültürlenmesi

NOT: Tüm prosedürler steril malzemeler ve reaktifler kullanılarak aseptik bir ortamda gerçekleştirilmelidir.

  1. PBMC izolasyonu
    1. Tam kanı eşit hacimde 1x PBS ile seyreltin.
    2. Seyreltilmiş kan örneğinin toplam hacmine bağlı olarak, 15 mL'lik bir tüpe uygun hacimde yoğunluk gradyan ortamı ( Malzeme Tablosuna bakınız) dağıtın.
      NOT: Önerilen oran, 3 mL yoğunluk gradyan ortamı ile seyreltilmiş kan örneğinin 4 mL'sidir.
    3. Seyreltilmiş kan örneğini yoğunluk gradyan ortamı üzerine dikkatlice katmanlayın. Frensiz 30 dakika-1 saat boyunca 400 × g'da santrifüjleyin.
    4. Santrifüjlemeden sonra, arayüzdeki mononükleer hücreleri dikkatlice yeni bir 15 mL konik tüpe aktarın. Mononükleer hücreleri 3 hacim 1x PBS ile seyreltin.
    5. 400 × g'da 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Bir kez tekrarlayın.
    6. Peletlenmiş hücreleri, aşağı akış uygulamaları için uygun bir ortamda yeniden süspanse edin veya donmuş stoklar olarak kriyoprezervasyonu yapın.
    7. Gerekirse, tripan mavisi boya dışlama testini kullanarak PBMC'lerin verimini ve hücre canlılığını belirleyin.
  2. İnsan dendritik hücrelerinin kültürü
    1. İzole edilmiş PBMC'leri PBMC ortamında yeniden süspanse edin ( Malzemeler Tablosu ve Tablo 1'e bakınız) ve bunları %5 CO2'de 37 ° C'de 1-2 saat boyunca 24 oyuklu bir doku kültürü plakasında kaplayın.
    2. Kültür plakasına sıkıca vurun ve yapışmayan hücreler içeren harcanan kültür ortamını atın.
    3. DC kültür ortamını (Tablo 1) yapışkan hücrelere ekleyin. Kültürleri 37 ° C'de% 5 CO2 içinde 3 gün boyunca koruyun. Süpernatan ortamını alternatif günlerde taze kültür ortamı ile değiştirin.
    4. 3. günde, tükenmiş ortamı yeni DC olgunlaşma ortamı ile değiştirin (Tablo 1). Kültürleri% 5 CO2'de 37 ° C'de 24 saat koruyun.
  3. İnsan sitotoksik T lenfositlerinin (CTL'ler) kültürü
    1. 1 mL PBMC'yi 5 mL polistiren yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın.
    2. PBMC'lere 50 μL Zenginleştirme Kokteyli ekleyin (Malzeme Tablosuna bakın). Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
    3. Numuneye 150 μL Manyetik Parçacık (Malzeme Tablosu) ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
    4. Hücre ayırma tamponu ile numune hacmini 2,5 mL'ye yükseltin (Malzeme Tablosu). Hücre ayrılmasını sağlamak için polistiren yuvarlak tabanlı tüpü 5 dakika boyunca bir hücre ayırma mıknatısına (Malzeme Tablosu) yerleştirin.
    5. Zenginleştirilmiş hücre süspansiyonunu 15 mL'lik yeni bir konik tüpe dökün. 300 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
    6. Peletlenmiş hücreleri ve kültürü CTL kültür ortamında (Tablo 1) 37 ° C'de 24 saat boyunca% 5 CO2 içinde yeniden süspanse edin.
  4. İnsan miyeloid türevli baskılayıcı hücrelerin (MDSC'ler) kültürü
    1. MDSC'ler için zenginleştirmek için %5 CO2 içinde 37 ° C'de 7 gün boyunca MDSC kültür ortamında (Tablo 1) kültür PBMC'leri. Süpernatan ortamını alternatif günlerde taze kültür ortamı ile değiştirin.
  5. DC'lerin ve CTL'lerin ortak kültürü
    1. Organoid kültürlerden şartlandırılmış ortamı toplayın.
    2. Olgunlaşmış DC kültüründen ortamın %50'sini nazikçe çıkarın ve organoid türevli şartlandırılmış ortamla değiştirin.
    3. DC'leri organoid türevli şartlandırılmış ortam ile %5 CO 2 içinde 37 ° C'de 2 saat inkübeedin.
    4. Gevşek bir şekilde yapışan DC'leri hasat edin ve 300 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın, peleti RPMI ko-kültür ortamında yeniden süspanse edin ve bu hücre süspansiyonunu aynı kuyucuğa geri ekleyin.
    5. CTL'leri aynı hasta hattından hasat edin ve olgunlaşmış DC'lere aktarın. DC-CTL ko-kültürüne (Tablo 1) 72 saat boyunca 37 ° C'de% 5 CO2'de devam edin.

5. Organoid/immün hücre ko-kültürlerinin oluşturulması

  1. CTL'leri, daha önce bölüm 4.3'te açıklandığı gibi bir kit ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak DC'lerin ve CTL'lerin ko-kültürlerinden izole edin.
  2. CTL'leri 5 μM karboksifloresein diasetat süksinimidil ester (CFSE) ile 37 ° C'de 20 dakika inkübe edin.
    NOT: CFSE, hücre bölünmelerinin akış sitometrik izlenmesi için kullanılan mavi lazerle uyarılabilir bir boyadır.
  3. Organoidleri hasat edin ve bunları CFSE etiketli CTL'lerle karıştırın. CTL / organoid oranını 200 organoid başına 50.000 CTL'de tutarak, organoidleri buz üzerinde uygun bir hacimde çözülmüş bazal membran matrisinde yeniden süspanse edin. 24 oyuklu doku kültürü plakalarında 25 μL hücre-bazal membran matrisi damlaları olarak tohum.
    NOT: MDSC'leri gerektiren deneysel koşullar için, tohumlamadan önce MDSC'leri organoidler ve CFSE etiketli CTL'lerle karıştırın. MDSC/CTL oranı 4:1 olmalıdır.
  4. Hücre bazındaki membran matris damlalarının katılaşmasını sağlamak için plakaları 37 °C'de 15 dakika inkübe edin.
  5. Hücre-bazal membran matris damlalarını önceden ısıtılmış organoid kültür ortamı ile kaplayın.
  6. Analize kadar organoid / bağışıklık hücresi ko-kültürlerini% 5 CO2 içinde 37 ° C'de tutun.

Sonuçlar

Tamamlandığında, mide organoidleri, tipik olarak gömülmeden sonraki 2-4 gün içinde, kuyu içinde küreler halinde görünür (Şekil 1). Şekil 1A , düzenli bir zar sergileyen gelişen bir gastrik organoid kültürünü göstermektedir. Tümör organoidleri genellikle hasta örneğine özgü farklı bir morfoloji sergileyecektir. Başarısız kültürler yoğun görünecek veya dokunun ilk sindiriminden itibaren herhangi...

Tartışmalar

Bu çalışmada, tedavi sonucunu ve hasta prognozunu iyileştirmek için hedefe yönelik tedavilerin etkinliğini tahmin etmek için klinik öncesi bir model olarak kullanılabilecek insan kaynaklı otolog mide kanseri organoid/immün hücre ko-kültürünün kullanımı sunulmaktadır. İmmün hücrelerle kanser organoid ko-kültürleri bildirilmiş olmasına rağmen, bu, mide kanseri çalışması için böyle bir ko-kültür sisteminin ilk raporudur. Çok sayıda başka organoid taban...

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma NIH (NIAID) 5U19AI11649105 (PIs: Weiss and Wells, Proje Lideri 1: Zavros) ve NIH (NIDDK) 2 R01 DK083402-06A1 (PI: Zavros) hibesi ile desteklenmiştir. Bu proje kısmen Cincinnati'deki Sindirim Hastalıkları Araştırma Çekirdek Merkezi'nin PHS Hibe P30 DK078392 (Bütünleştirici Morfoloji Çekirdeği) ve 5P30CA023074 ARIZONA ÜNİVERSİTESİ KANSER MERKEZİ - KANSER MERKEZİ DESTEK HİBESİ (PI: Sweasy) tarafından desteklenmiştir. Organoid kültür sisteminin geliştirilmesine katkılarından dolayı Chet Closson'a (Canlı Mikroskopi Çekirdeği, Cincinnati Üniversitesi) ve Zavros laboratuvarının eski üyeleri Dr. Nina Steele ve Loryn Holokai'ye yardımları için teşekkür ederiz. Mide organoidi/immün hücre ko-kültürlerinin geliştirilmesi için doku ve kan bağışında bulunmayı kabul eden hastalara içtenlikle teşekkür ederiz. Çalışmaya katılmaya istekli olmasaydı, bu çalışma mümkün olmazdı.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
12 well plateMidwest Scientific92012
15 mL Falcon tubeFisher scientific12-565-269
24 well plateMidwest Scientific92024
30 μm filtersMiltenyi Biotec130-041-407
40 μm filters (Fisher Scientific)Fisher scientific352340
5 mL round bottom polystyrene tubesFisher scientific14956-3C
50 mL Falcon tubeFisher scientific12-565-271
Advanced DMEM/F12Thermo Fisher Scientific12634010
AIMVThermo Fisher Scientific12055091Basal medium for PBMCs and DCs
Amphotericin B/ GentamicinThermo Fisher ScientificR-01510
B-27 supplementThermo Fisher Scientific12587010
β-mercaptoethanolThermo Fisher Scientific800-120
Bone morphogenetic protein inhibitor (Noggin)Peprotech250-38
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma AldrichA7906
CabozantinibSelleckchemS1119
Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)Biolegend423801
Collagenase ASigma AldrichC9891
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)Fisher scientific14190-144cell separation buffer
EasySep BufferStem Cell Technologies20144Contains Enrichment Cocktail and Magnetic Particles used in CTL culture
EasySep Human CD8+ T Cell Enrichment KitStem Cell Technologies19053cell separation magnet
EasySep MagnetStem Cell TechnologiesSN12580
EDTASigma AldrichE6758
Epidermal Growth Factor (EGF)Peprotech315-09
Farma Series 3 Water Jacketed IncubatorThermo Fisher Scientific4120
Fetal Calf Serum (FCS)Atlanta BiologicalsSI2450H
Fibroblast growth factor 10 (FGF-10)Peprotech100-26density gradient medium
Ficoll-PaqueGE Healthcare171440-02
Gastrin 1Tocris30061
GelatinCell Biologics6950
GM-CSFThermo Fisher ScientificPHC6025
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Thermo Fisher Scientific14175095
HEPES (2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid)Fisher scientificBP299-100
Human Epithelial Cell Basal MediumCell BiologicsH6621
human serum ABGemini Bioscience21985023
Hyaluronidase Type IV-SSigma AldrichH3884
Insulin-Transferrin-SeleniumThermo Fisher Scientific41400045
Interleukin 1β (IL-1β)Thermo Fisher ScientificRIL1BI
Interleukin 6 (IL-6)Thermo Fisher ScientificRIL6I
Interleukin 7 (IL-7)Thermo Fisher ScientificRP-8645
KanamycinThermo Fisher Scientific11815024
L-glutamineFisher scientific350-50-061basement membrane matrix
Matrigel (Corning Life Sciences, Corning, NY)Fisher scientificCB40230C
N-2 supplementThermo Fisher Scientific17502048
N-acetyl-L-cysteineSigma AldrichA7250
Nicotinamide (Nicotinamide)Sigma AldrichN0636
PD-L1 inhibitorSelleckchemA2002
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher ScientificSV3000
PetridishFisher scientific07-202-030
Potassium chloride (KCl)Fisher scientific18-605-517
Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4)Fisher scientificNC0229895
prostaglandin E2 (PGE2)Sigma AldrichP0409
RPMI 1640Thermo Fisher Scientific11875119
Sodium chloride (NaCl)Fisher scientific18-606-419
Sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4)Fisher scientificNC0229893cell dissociation reagent
StemPro Accutase solutionThermo Fisher ScientificA1110501
Transforming growth factor beta 1 (TGF-β1)Thermo Fisher Scientific7754-BH-005/CF
Tumor necrosis factor α (TNF-α)Thermo Fisher ScientificPHC3015
Vascular endothelial growth factor (VEGF)Thermo Fisher ScientificRVGEFI
Y-27632 ROCK inhibitorSigma AldrichY0350

Referanslar

  1. Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. International Journal of Cancer. 136 (5), 359-386 (2015).
  2. Piazuelo, M. B., Epplein, M., Correa, P. Gastric cancer: an infectious disease. Infectious Disease Clinics of North America. 24 (4), 853-869 (2010).
  3. Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. Cancer statistics. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 63 (1), 11-30 (2013).
  4. Quante, M., Wang, T. C. Inflammation and stem cells in gastrointestinal carcinogenesis. Physiology. 23, 350-359 (2008).
  5. Quante, M., Varga, J., Wang, T. C., Greten, F. R. The gastrointestinal tumor microenvironment. Gastroenterology. 145 (1), 63-78 (2013).
  6. Tsai, S., et al. Development of primary human pancreatic cancer organoids, matched stromal and immune cells and 3D tumor microenvironment models. BMC Cancer. 18 (1), 335 (2018).
  7. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  8. Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
  9. Tiriac, H., et al. Successful creation of pancreatic cancer organoids by means of EUS-guided fine-needle biopsy sampling for personalized cancer treatment. Gastrointestinal Endoscopy. 87 (6), 1474-1480 (2018).
  10. Tiriac, H., et al. Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
  11. Yao, Y., et al. Patient-derived organoids predict chemoradiation responses of locally advanced rectal cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
  12. Ahmadzadeh, M., et al. Tumor antigen-specific CD8 T cells infiltrating the tumor express high levels of PD-1 and are functionally impaired. Blood. 114 (8), 1537-1544 (2009).
  13. Chen, Z., et al. Intratumoral CD8(+) cytotoxic lymphocyte is a favorable prognostic marker in node-negative breast cancer. PLoS One. 9 (4), 95475 (2014).
  14. Reissfelder, C., et al. Tumor-specific cytotoxic T lymphocyte activity determines colorectal cancer patient prognosis. Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 739-751 (2015).
  15. Muro, K., et al. Pan-Asian adapted ESMO Clinical Practice Guidelines for the management of patients with metastatic gastric cancer: a JSMO-ESMO initiative endorsed by CSCO, KSMO, MOS, SSO and TOS. Annals of Oncology. 30 (1), 19-33 (2019).
  16. Subhash, V. V., Yeo, M. S., Tan, W. L., Yong, W. P. Strategies and advancements in harnessing the immune system for gastric cancer immunotherapy. Journal of Immunology Research. 2015, 308574 (2015).
  17. Muro, K., et al. Pembrolizumab for patients with PD-L1-positive advanced gastric cancer (KEYNOTE-012): a multicentre, open-label, phase 1b trial. Lancet Oncology. 17 (6), 717-726 (2016).
  18. Abdel-Rahman, O. PD-L1 expression and outcome of advanced melanoma patients treated with anti-PD-1/PD-L1 agents: a meta-analysis. Immunotherapy. 8 (9), 1081-1089 (2016).
  19. Abdel-Rahman, O. Correlation between PD-L1 expression and outcome of NSCLC patients treated with anti-PD-1/PD-L1 agents: A meta-analysis. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 101, 75-85 (2016).
  20. Abdel-Rahman, O. Immune checkpoints aberrations and gastric cancer; assessment of prognostic value and evaluation of therapeutic potentials. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 97, 65-71 (2016).
  21. Dijkstra, K. K., et al. Generation of tumor-reactive T cells by co-culture of peripheral blood lymphocytes and tumor organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
  22. Neal, J. T., et al. Organoid modeling of the tumor immune microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
  23. Peng, C., Liu, J., Yang, G., Li, Y. The tumor-stromal ratio as a strong prognosticator for advanced gastric cancer patients: proposal of a new TSNM staging system. Journal of Gastroenterology. 53 (5), 606-617 (2018).
  24. Steele, N. G., et al. An organoid-based preclinical model of human gastric cancer. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7 (1), 161-184 (2019).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Preklinik ModelMide KanseriOrganoidmm n H cre Ko k lt rPD L1PD 1CD8 T Lenfositlermm noterapiT m r AntijeniDendritik H crelerMiyeloid Kaynakl Bask lay c H creler MDSCTedavi Etkinli iHasta Sonu lar

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır