نهج قياس التدفق الخلوي لتوصيف الخصائص البلعمية للخلايا الدبقية الصغيرة البالغة المعزولة بشكل حاد والبلاعم الدماغية في المختبر

Summary

يمكن أن يوفر تقييم الخصائص البلعمية للخلايا الدبقية الصغيرة والبلاعم الدماغية بعدا وظيفيا قيما لدراسات التنميط الجزيئي. نصف بروتوكولا تم التحقق من صحته يستخدم قياس التدفق الخلوي لقياس البلعمة بسرعة وموثوقية للكريات المجهرية الفلورية وألياف بيتا الأميلويد بواسطة الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة بشكل حاد والبلاعم الدماغية من نماذج الفئران.

Abstract

تلعب الخلايا الدبقية الصغيرة والضامة المتسللة للجهاز العصبي المركزي (CNS) ، والتي تسمى مجتمعة الخلايا البلعمية أحادية النواة للجهاز العصبي المركزي (CNS-MPS) ، أدوارا مركزية في الأمراض العصبية بما في ذلك التنكس العصبي والسكتة الدماغية. يشارك الجهاز العصبي المركزي MPS في التصفية البلعمية للبروتينات المرضية والحطام والمشابك العصبية ، ولكل منها مسارات جزيئية أساسية مميزة. يمكن أن يوفر توصيف هذه الخصائص البلعمية قراءة وظيفية تكمل التنميط الجزيئي للخلايا الدبقية الصغيرة باستخدام أساليب قياس التدفق الخلوي التقليدية والنسخ والبروتينات. اعتمد التنميط البلعمي للخلايا الدبقية الصغيرة على التصور المجهري والثقافات المختبرية للخلايا الدبقية الصغيرة لحديثي الولادة في الفئران. يعاني النهج الأول من أخذ عينات محدودة بينما يعكس النهج الأخير بطبيعته بشكل سيئ الحالة الحقيقية في الجسم الحي لأعضاء البرلمان البالغين في الجهاز العصبي المركزي. تصف هذه الورقة البروتوكولات المحسنة لخصائص البلعمة من النمط الظاهري للفأر المعزول بشكل حاد CNS-MPS عن طريق قياس التدفق الخلوي. يتم عزل الجهاز العصبي المركزي بشكل حاد عن دماغ الفأر البالغ باستخدام التفكك الميكانيكي متبوعا بالطرد المركزي المتدرج للكثافة ، المحتضن بكريات مجهرية فلورية أو ألياف فلورية Aβ ، وغسلها ، ثم يتم تصنيفها بألواح من الأجسام المضادة ضد علامات السطح (CD11b ، CD45). باستخدام هذا النهج ، من الممكن مقارنة الخصائص البلعمية للخلايا الدبقية الصغيرة المقيمة في الدماغ مع البلاعم المتسللة للجهاز العصبي المركزي ثم تقييم تأثير الشيخوخة وأمراض الأمراض على هذه الأنماط الظاهرية البلعمة. تحمل هذه الطريقة السريعة أيضا إمكانية النمط الظاهري للجهاز العصبي المركزي البشري المعزول بشكل حاد وظيفيا من عينات الدماغ بعد الوفاة أو الجراحة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن التحقيق في آليات محددة للبلعمة بواسطة مجموعات فرعية من الجهاز العصبي المركزي - MP عن طريق تثبيط مسارات البلعمة المختارة.

Introduction

تتكون الخلايا المناعية الفطرية للجهاز العصبي المركزي (CNS) في الغالب من الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا الوحيدة / الضامة المتسللة ، والتي تسمى معا الخلايا البلعمية أحادية النواة (CNS-MPS)¹. يتورط الجهاز العصبي المركزي MPS في الأمراض التنكسية العصبية مثل مرض الزهايمر (AD) ، واضطرابات الالتهاب العصبي ، والسكتة الدماغية^2،3،4. الجهاز العصبي المركزي-MPS ، جنبا إلى جنب مع الخلايا النجمية والخلايا العضاقية والخلايا البطانية العصبية ، لها وظائف البلعمة^5،6. في حالتها الاستتبابية ، تشارك CNS-MPS في المراقبة المستمرة للبيئة المكروية المحلية ، جنبا إلى جنب مع الإزالة البلعمية لحطام الخلايا المبرمج والبروتينات ، والتقليم المشبكي لإعادة تشكيل الوصلات العصبية^7،8،9،10. في الحالات التنكسية العصبية مثل مرض الزهايمر ، تتبنى الجهاز العصبي المركزي أنماطا ظاهرية جزيئية ووظيفية متميزة مرتبطة بالمرض والتي يمكن أن تلعب أدوارا مرضية بما في ذلك إزالة الأميلويد بيتا المجمعة (Aβ) والعناصر العصبية ، بالإضافة إلى السيتوكين الالتهابي وإطلاق العوامل ، مما يؤدي إلى أدوار وقائية معقدة مؤيدة للالتهابات وضارة وكذلك مضادة للالتهابات^{11،12،13،14}. يتم التوسط في البلعمة للجسيمات الكبيرة والحطام الخلوي والبروتينات والجسيمات المعدية الأخرى بواسطة الجهاز العصبي المركزي MPS بواسطة مستقبلات مميزة يتم التعبير عنها على^{سطحها 9}. يمكن أن يؤدي الاضطراب في هذه المسارات البلعمية إلى تصفية معيبة وتراكم تدريجي ل Aβ مما يؤدي في النهاية إلى تلف الخلايا العصبية التدريجي في^4،9 بعد الميلاد. في حين أن التقدم في التنميط الجزيئي للجهاز العصبي المركزي باستخدام الأساليب النسخية والبروتينية قد قدم رؤى لا تقدر بثمن حول عدم التجانس الجزيئي داخل الجهاز العصبي المركزي MPS في الأمراض العصبية^15،16 ، فإن التوصيف الوظيفي للخصائص البلعمية ل CNS-MPS ومجموعاتها الفرعية غير موجودة حاليا. يمكن أن يكمل التوصيف الوظيفي لخصائص البلعمة للجهاز العصبي المركزي - MPS استراتيجيات التنميط الجزيئي ، ويسهل التنميط الظاهري الوظيفي بشكل أفضل ، ويساعد في تقييم فعالية العلاجات التي يمكن أن تصحح البلعمة المعيبة في نماذج المرض¹⁷.

تشمل فحوصات البلعمة التقليدية للجهاز العصبي المركزي احتضان الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية جنبا إلى جنب مع ركائز الفلورسنت مثل Aβ أو جزيئات اللاتكس / البوليسترين. ثم تتم دراسة البلعمة كدالة لامتصاص الركيزة الفلورية باستخدام الفحص المجهري المناعي^18،19،20. من الثابت أن أعضاء مجلس النواب في الجهاز العصبي المركزي ، عند الحفاظ عليهم في الثقافات الطويلة ، يمكنهم تغيير مورفولوجيتهم وملفات تعريف النسخ بشكل كبير^21،22. هذا يعيق دراسة الخصائص البلعمية لأعضاء البرلمان في الجهاز العصبي المركزي في حالتهم التمثيلية في الجهاز العصبي المركزي. يمكن أن يوفر مقايسة قياس التدفق الخلوي الوظيفي لتعريف الجهاز العصبي المركزي الحية المعزولة بشكل حاد تقييما سريعا لخصائص البلعمة ويمكنه أخذ عينات من مجموعة أكبر بكثير من الجهاز العصبي المركزي - MPS من نهج الفحص^{المجهري 9،23}. علاوة على ذلك ، يلغي قياس التدفق الخلوي الحاجة إلى الحفاظ على الجهاز العصبي المركزي-MPS في الثقافة بالإضافة إلى توفير منصة لدراسة خصائص البلعمة في مجموعات سكانية فرعية مختلفة من الجهاز العصبي المركزي. تصف هذه المخطوطة البروتوكولات المحسنة لخصائص البلعمة للنمط الظاهري للفأر المعزول بشكل حاد CNS-MPS عن طريق قياس التدفق الخلوي. يسمح تكييف فحوصات البلعمة باستخدام قياس التدفق الخلوي بتعدد الإرسال السريع للنمط الظاهري البلعمي للجهاز العصبي المركزي العصبي المركزي إلى جانب التنميط الظاهري المناعي ، وبالتالي توفير رؤى حول عدم تجانس خصائص البلعمة داخل الجهاز العصبي المركزي-MPS بدقة الخلية الواحدة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

أجريت جميع دراسات الفئران بعد الحصول على موافقة من اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام بجامعة إيموري (IACUC) ، وبما يتفق بدقة مع دليل رعاية واستخدام المختبر التابع للمعاهد الوطنية للصحة.

1. التحضير في يوم العزل

1. قم بإعداد دلو ثلج للحفاظ على برودة جميع الكواشف والمخازن المؤقتة ومعلقات الخلايا طوال عملية العزل.
2. ضع زجاجة 1× محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (1 لتر على الأقل) عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة إلى ساعة واحدة قبل التروية واحتفظ ب 1× PBS على الجليد أثناء إجراء التروية والعزل.
3. قم بإعداد تركيز العمل لوسط تدرج الكثافة (يشار إليه باسم 35٪ SIP ، انظر جدول المواد).
4. قم بتسمية جميع أنابيب قياس الخلايا المخروطية والتدفق المستخدمة في التجربة قبل عزل الخلية لتجنب التأخير في أوقات المعالجة. بالإضافة إلى ذلك ، اجمع جميع المستلزمات الأخرى اللازمة للعزل قبل التروية ، مثل مصافي الخلايا والمحاقن والإبر 40 ميكرومتر.

2. العزلة الحادة للخلايا الدبقية الصغيرة للفأر البالغ

1. تخدير فأر بالغ عن طريق وضع الفأر في حجرة تحريض زجاجية مع الأيزوفلوران (5 مل) حتى يتوقف الفأر عن التنفس ويفشل في الاستجابة لقرص مخلب الطرف الخلفي.
2. استخدم إبرة 26 جم وحقنة 10 مل لإجراء نضح القلب مع 30 مل من 1× PBS المثلج حتى لا يكون هناك دم مرئي.
3. اقطع رأس الفأر بمقص جراحي. استخدم مقصا صغيرا لقطع الجلد ، وتعريض الجمجمة. إزالة الجمجمة دون الإضرار بأنسجة المخ كما هو موضح²⁴. قم بإزالة الدماغ على الفور ونقله إلى مصفاة خلوية معقمة سعة 40 ميكرومتر موضوعة فوق أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
4. استخدم الجانب الخلفي من مكبس حقنة سعة 3 مل لدفع الدماغ عبر المصفاة وفصل أنسجة المخ بأكملها ميكانيكيا. اغسل مصفاة الخلية والمكبس بشكل متقطع أثناء التفكك باستخدام 2 مل من 1× PBS المثلج في كل مرة لضمان مرور جميع الأنسجة عبر المصفاة.
5. اكشط الجزء السفلي من مصفاة الخلية باستخدام المكبس لجمع أي تعليق متبقي في المخروطي. اغسل مصفاة الخلية جيدا باستخدام 1× PBS المثلج واسكب التعليق في الأنبوب المخروطي سعة 50 مل.
   ملاحظة: عند معالجة متعددة على التوالي ، ضع معلقات الخلية على الجليد حتى مزيد من المعالجة.
6. أضف 1× PBS المثلج لرفع حجم تعليق الخلية إلى 30 مل وجهاز الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
7. اسكب المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات وأعد تعليق الحبيبات في 6 مل من 35٪ SIP باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل. انقل معلق الخلية + خليط SIP بنسبة 35٪ إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي بسعة 800 × جم لمدة 25 دقيقة عند 15 درجة مئوية بدون فرامل.
   تنبيه: توخ الحذر بشكل خاص لتجنب إدخال الفقاعات أثناء إعادة التعليق. يمكن أن تكون الفقاعات الزائدة ضارة بإنتاجية الخلايا.
8. قم بإزالة الأنبوب المخروطي سعة 15 مل بعناية من جهاز الطرد المركزي دون إزعاج الطبقات واستنشاق طبقة المايلين العفوية العائمة.
9. انقل خليط معلق الخلية + 35٪ SIP باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل يحتوي على 30 مل من 1× PBS المثلج وجهاز الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. اسكب المادة الطافية بعناية ، تاركا وراءها حبيبات الخلية مع 500-800 ميكرولتر من 1× PBS.
10. أعد تعليق حبيبات الخلية عن طريق سحب العينة برفق لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة p1000 ونقلها إلى أنبوب سفلي دائري سعة 5 مل. أضف 2 مل من 1× PBS المثلج إلى الأنبوب السفلي المستدير وجهاز الطرد المركزي عند 1,400 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. اسكب المادة الطافية بسرعة ، تاركا حبيبات الخلية التي تحتوي على الجهاز العصبي المركزي-MPS في حوالي 100 ميكرولتر من 1× PBS (الشكل 1).

3. إعداد البلعمة وتلوين التدفق الخلوي

1. انقل 20 ميكرولتر (≈200,000 خلية) من الجهاز العصبي المركزي العصبي المركزي المعاد تعليقه إلى أنبوب دائري جديد سعة 5 مل وأضف 80 ميكرولتر من 1× PBS المثلج. لا تضيف أي ركائز فلورية أو أجسام مضادة لقياس التدفق الخلوي إلى هذا الأنبوب. تعمل هذه الخلايا كعنصر تحكم سلبي لتحديد مضان الخلفية ل CNS-MPS لتحليلات قياس التدفق الخلوي.
2. لتحديد جدوى أعضاء البرلمان المعزولة في الجهاز العصبي المركزي ، استخدم الأصباغ الحية / الميتة القائمة على الأمين (على سبيل المثال ، الأشعة فوق البنفسجية الزرقاء القابلة للإصلاح).
   1. أعد تعليق باقي حبيبات الخلية في 500 ميكرولتر من 1× PBS وأضف 1 ميكرولتر من الصبغة المعاد تكوينها إلى كل أنبوب عينة باستثناء التحكم السلبي.
   2. دوامة برفق ، وقم بتغطية الأنابيب بورق الألمنيوم ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، أضف 1 مل من 1× PBS إلى كل أنبوب ودوامة برفق.
   3. الطرد المركزي للخلايا عند 1,400 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. اسكب المادة الطافية بسرعة وأعد تعليق حبيبات الخلية في 100 ميكرولتر من 1× PBS.
      ملاحظة: سوف ترتبط الأصباغ القائمة على الأمين بألياف Aβ خارج الخلية مما يؤدي إلى إرباك نتائج البلعمة. قد تتداخل المؤشرات الحية / الميتة الأخرى مع تألق ألياف / الكريات المجهرية Aβ. ومن ثم ينصح باستخدام مؤشر Live / Dead فقط في التجارب الأولية لتحديد جدوى أعضاء البرلمان المعزولين CNS.
3. قم بتدوير الأنبوب الذي يحتوي على كريات مجهرية من البولي إيثيلين البوليسترين جيدا وأضف 2 ميكرولتر (≈200 كرة مجهرية / خلية) إلى 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في أنابيب التدفق باستثناء التحكم السلبي. قم بدوامة كل أنبوب برفق لضمان التوزيع المتساوي للركيزة مع الخلايا ووضع الأنابيب السفلية المستديرة في حاضنة معقمة مرطبة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
   1. قم بدوامة واحتضان أنبوب التحكم السلبي برفق لضمان ظروف تجريبية مماثلة بين العينات الموجبة والسالبة.
      ملاحظة: في حالة استخدام ألياف Aβ بدلا من الكريات المجهرية PE ، قم بإعداد ألياف HiLyte488 Aβ الفلورية كما هو موضح^{سابقا 9}. التركيز النهائي للألياف Aβ هو 200 ميكرومتر ثم يتم تخفيفه لتحضير مخزون طازج 20 ميكرومتر في PBS من مونومرات الفلورسنت Aβ. أضف 12.5 ميكرولتر من مونومرات Aβ 20 ميكرومتر إلى كل أنبوب يحتوي على خلايا معزولة.
4. قم بإزالة الخلايا من الحاضنة وأضف 1 مل من 1× PBS إلى كل أنبوب ودوامة برفق. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 1,400 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية وصب المادة الطافية بسرعة. كرر الغسيل مع 1 مل 1× PBS ، وجهاز طرد مركزي عند 1,400 × جم لمدة دقيقتين ، ثم اسكب المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 100 ميكرولتر من 1× PBS.
   ملاحظة: بعد كل دورة ، من المهم إبقاء الخلايا على الجليد لمنع امتصاص البلعمة المستمر.
5. قم بدوامة الأجسام المضادة لقياس التدفق الخلوي وقم بطردها في جهاز طرد مركزي دقيق لمدة 10 ثوان. أضف إلى كل أنبوب تعليق خلية 1 ميكرولتر لكل من CD11b-APC / Cy7 و CD45-PE / Cy7 لمقايسة البلعمة Aβ ، أو CD45-FITC لبلعمة PE المجهرية. قم بدوامة كل أنبوب برفق واحتضانه في الظلام لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: يمكن للمستخدمين أيضا تضمين أنبوب منفصل يحتوي على خلايا البلعمة القوية مثل الخلايا الدبقية الصغيرة BV2 المستنبتة أو البلاعم البريتونية كتحكم إيجابي ومعالجتها باستخدام كريات البولي إيثيلين المجهرية ، والأجسام المضادة لقياس الخلايا كما هو موضح أعلاه. يمكن استخدام البيانات من هذه العينة لتحديد التحكم الإيجابي الذي يدل على البلعمة الحقيقية في التجارب الأولية.
6. أثناء الحضانة ، قم بإعداد أنابيب تعويض باستخدام أربعة أنابيب تدفق مستديرة القاع سعة 5 مل. دوامة حبات التعويض تماما وإضافة قطرة واحدة إلى كل أنبوب. أضف 1 ميكرولتر من CD11b-APC / Cy7 إلى الأنبوب الأول و CD45-FITC للأنبوب الثاني. أضف 1 ميكرولتر من البوليسترين PE إلى الأنبوب الثالث واحتفظ بخرز التعويض غير الملوثة في الأنبوب الرابع. استخدم هذا الأنبوب الرابع كعنصر تحكم سلبي لإعداد لوحة تعويض على مقياس التدفق الخلوي.
   ملاحظة: عند استخدام ألياف Aβ لدراسة البلعمة ، أضف CD45-PECy7 إلى الأنبوب الثاني بدلا من CD45-FITC. أضف 1 ميكرولتر من الجسم المضاد المنفصل لقياس التدفق الخلوي الموسوم ب FITC أو الجسم المضاد الثانوي FITC (أي نوع) إلى أنبوب التعويض الثالث. هذا مهم لأن الخرزات لا يمكن أن تلتصق بألياف Aβ وسيتم غسلها عند غسل أنابيب التعويض.
7. اسمح لحبات التعويض بالاحتضان بالأجسام المضادة الخاصة بها لمدة 10 دقائق على الأقل. بعد الحضانة ، أضف 1 مل من 1× PBS إلى كل أنبوب ، وجهاز طرد مركزي عند 1,400 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية ، واسكب المادة الطافية بسرعة. ضع أنابيب التعويض على الجليد وقم بتغطيتها بورق الألمنيوم حتى قياس التدفق الخلوي.
8. بعد الحضانة بالأجسام المضادة لقياس التدفق الخلوي ، اغسل الخلايا الملطخة ب 1 مل من 1× PBS. قم بدوامة الخلايا بلطف وطرد مركزي عند 1,400 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. اسكب المادة الطافية بسرعة وكرر الغسيل بمقدار 1 مل 1× PBS. بعد الطرد المركزي ، اسكب المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 100 ميكرولتر من 1× PBS.
9. ضع أنابيب العينة على الثلج وقم بتغطيتها بورق الألمنيوم حتى قياس التدفق الخلوي.
   ملاحظة: استخدم 1× PBS (درجة الحموضة 7.0) بدون Ca^{2 +} / Mg²⁺ كمخزن مؤقت للتدفق طوال التجربة. تأكد من استبعاد مصل الأبقار الجنيني (FBS) في مخزن التدفق لتجنب التنشيط المحتمل للدبقية الصغيرة.

4. قياس التدفق الخلوي وتحليله

1. إعداد الأداة والتعويض
   ملاحظة: أجريت التجارب في هذه المخطوطة على مقياس التدفق الخلوي باستخدام ليزر فوق بنفسجي وبنفسجي وأزرق وأصفر وأخضر وأحمر. يمكن أيضا تكييف هذه التجربة مع مقاييس التدفق الخلوي ثلاثية الليزر باستخدام الليزر الأزرق والأصفر والأخضر والأحمر فقط. يحتاج المستخدمون إلى الخضوع لتدريب رسمي قبل التعامل مع الأداة.
   1. أعد ملء خزان غمد التدفق العازل وقم بتشغيل مقياس الخلايا. قم بتسجيل الدخول إلى برنامج التحليل على الكمبيوتر المتصل بمقياس التدفق الخلوي بأنبوب تدفق سفلي دائري سعة 5 مل يحتوي على ddH₂O. قم بتسجيل الدخول إلى برنامج التحليل على الكمبيوتر المتصل بمقياس التدفق الخلوي. قم بإنشاء "تجربة" وحدد FSC و SSC و FITC و PECy7 و APC-Cy7 كمعلمات. في حالة استخدام كريات PE المجهرية، حدد PE بدلا من PECy7 في لوحة المعلمات.
   2. قم بإنشاء لوحة تعويض مناسبة.
      ملاحظة: في تجاربنا ، عادة ما تكون الفولتية FSC / SSC لخرز التعويض حوالي 350/280 ، في حين أن جهد FSC / SSC ل CNS-MPS يبلغ حوالي 320/260. يمكن أن تختلف هذه القيم بين أي مقياسين مختلفين للخلايا وتحتاج إلى معايرتها قبل التجربة الفعلية.
   3. أعد تكوين كل تعويض وأنبوب تعليق خلية مع 500 ميكرولتر من 1× PBS ، دوامة لفترة وجيزة ، وضعها على الجليد. قم بتشغيل أنبوب التحكم السلبي / الخرزة غير الملوثة لضبط الفولتية المناسبة بحيث تكون الذروة في كل رسم بياني فلوروفور أقل من 10². قم بتشغيل أنابيب التعويض الأخرى أحادية اللون لتحديد قممها الإيجابية المميزة.
      ملاحظة: يجب أن يكون هناك فرق نصف لوغاريتمي على الأقل (الأساس 10) بين القمم الموجبة والسالبة لكل فلوروفور.
   4. سجل 5000 حدث من كل أنبوب تعويض للسماح للكمبيوتر بحساب إعداد التعويض تلقائيا. اربط إعداد التعويض بالتجربة الحالية²⁵.
   5. قم بإنشاء "أنبوب" جديد ضمن علامة تبويب العينة. قم بتدوير أنبوب التحكم السلبي برفق وتشغيل أنبوب التحكم السلبي الذي يحتوي على CNS-MPS غير ملوث. اضبط الفولتية المبعثرة الأمامية والجانبية لالتقاط السكان المعنيين. سجل الأحداث والبوابة الفرعية على أعضاء البرلمان المباشرين للجهاز العصبي المركزي كما هو مذكور أدناه.
   6. التقط الأحداث وسجلها من جميع الأنابيب اللاحقة كملفات منفصلة مع الحفاظ على اتساق المعلمات والفولتية. قم بتدوير كل أنبوب برفق قبل تشغيله على مقياس التدفق الخلوي.
2. استراتيجية البوابات وقياس البلعمة
   1. ارسم بوابة أولية أحادية النواة لالتقاط جميع أعضاء مجلس الأمن المركزي. يجب أن تكون هذه الخلايا أحادية النواة الحية مسورة في الرسم البياني التالي لتشمل خلايا مفردة فقط ، باستثناء المقاطع والثلاثة.
   2. قم بعرض مجموعة أعضاء CNS-MPS المفردة المسورة على رسم بياني لاحق يعرض الفلوروفورات CD11b و CD45.
      ملاحظة: عادة ما تكون الخلايا الدبقية الصغيرة المقيمة في الدماغ وسيطة CD11b ⁺ CD45^{، في} حين أن البلاعم المتسللة تكون^عالية CD11b ⁺ CD45. يمكن تضمين علامات إضافية مثل Ly6c في اللوحة لفصل الخلايا الوحيدة الالتهابية بثقة (^{Ly6c عالية} و^{CD45 عالية}) عن الخلايا الدبقية الصغيرة (Ly6c^منخفضة CD45^{متوسطة).}
   3. قم بتطبيق البوابات المناسبة لمزيد من دراسة البلعمة في المجموعات السكانية المعنية كما هو موضح في الشكل 2F.
      ملاحظة: يتم قياس البلعمة في الجهاز العصبي المركزي-MPS كدالة لامتصاص مضان Hilyte488 / Alexa488 (Aβ) أو PE (الكرة المجهرية). تشير الذروة الإيجابية المميزة في الرسوم البيانية الخاصة بها إلى أن أعضاء مجلس النواب العصبي المركزي قد قاموا ببلعمة الركيزة. كمية المواد البلعمة تتناسب طرديا مع شدة الفلورة. ومن ثم ، يجب تفسير وجود قمم متعددة على أنه بلعمة أعلى. يمكن تأكيدها لاحقا عن طريق الكيمياء المناعية.
   4. بعد تسجيل جميع أنابيب العينة على مقياس التدفق الخلوي ، قم بتصدير ملفات البيانات بتنسيق .fcs لمزيد من التحليل.
3. تحليل البيانات الإحصائية
   1. استخدم أي برنامج لتحليل قياس التدفق الخلوي جنبا إلى جنب مع جداول البيانات وبرامج التحليل الإحصائي لجميع تحليلات البيانات.
   2. أضف ملفات .fcs إلى برنامج التحليل وانقر نقرا مزدوجا فوق الملف الأول. رسم بياني يعرض كل ما تم تسجيله
      ستظهر الأحداث. اتبع استراتيجية بوابات مماثلة كما هو موضح في الشكل 2 لبوابة الخلايا أحادية النواة الحية وحيدة النواة لاحقا ودراسة البلعمة على مجموعة سكانية معينة ، على سبيل المثال الخلايا الدبقية الصغيرة^{الوسيطة} CD11b ⁺ CD45 (الشكل 2H).
      ملاحظة: يتم تقييم مؤشر البلعمة بناء على نسبة الخلايا التي تستوعب ألياف الفلورسنت Aβ أو ≥1 كرة (كريات) دقيقة. كما هو محدد سابقا ، فإن البلعمة منخفضة المستوى هي امتصاص 1 ميكروكروي على الأقل والبلعمة عالية المستوى هي >1 امتصاص حبة ^8,9. بناء على التجارب السابقة ، فإن تثبيط العمليات المعتمدة على الأكتين بواسطة السيتوكالاسين D يمنع تماما امتصاص حبة >1 ويمنع جزئيا امتصاص حبة^{1 9} بالإضافة إلى أنه يمنع امتصاص Aβ تماما ، مما يؤكد امتصاص البلعمة المعتمد على الأكتين بدلا من الارتباط السلبي بسطح الخلية. تؤكد الكيمياء الخلوية المناعية أيضا أن كل ذروة متسلسلة في مقايسة الغلاف المجهري تمثل زيادة موحدة في عدد الخرزات البلعمة^8،9.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

لتجسيد النتائج النموذجية لامتصاص البلعمة للكريات المجهرية وألياف Aβ42 بواسطة الجهاز العصبي المركزي المعزول بشكل حاد ، تم الحصول على الجهاز العصبي المركزي المعزول بشكل حاد من نصف الكرة الأرضية المماثل بعد انسداد الشرايين الدماغية الوسطى العابر (MCAO)⁸. للحصول ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

قياس التدفق الخلوي هو تقنية يمكنها اكتشاف التعبير عن البروتينات أو علامات الاهتمام على سطح الخلية أو في المقصورات داخل الخلايا باستخدام مجسات مصنفة بالفلورسنت (عادة الأجسام المضادة) لتسمية هذه العلامات ذات الأهمية. عادة ما يتم اقتران الأجسام المضادة لسطح الخلية أو داخ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Hank's balanced salt solution(10x HBSS)	ThermoFisher	14065056	Store at 4 °C. Used to make SIP as described in the protocol
1x Hank's balanced salt solution(1x HBSS)	ThermoFisher	14175095	Store at 4 °C. Used to make 35% SIP as described in the protocol
1x Phosphate Buffered Saline (PBS)			https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/western-blotting/buffers-recipes/10x-phosphate-buffered-saline.html Store 10xPBS at Room temperature. Prepare fresh 1xPBS by diluting one part 10xPBS to nine parts of MilliQ dH20 and store it at 4 °C for an hour before use. Make sure the pH of the 1xPBS is 7.0 before refridgeration.
35% SIP			To make 20 mL of 35% SIP, use 7 mL of SIP and 13 mL of ice-cold 1× HBSS. Keep on ice until further processing
APC-Cy7 rat anti-CD11b	BD Pharmingen	557657	Store at 4 °C or keep on ice when in use. Sheild from light. Flow cytometry dilution - 1:100
FITC rat anti mouse CD145	BD Pharmingen	553080	Store at 4 °C or keep on ice when in use. Sheild from light. Flow cytometry dilution - 1:100
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	ThermoFisher	L34961	Store at -20 °C. Add 50ul of DMSO to one tube of the dye, vortex throughly and centrifuge at maximun speed for 1 min. Make 10µL aliquots and store them at -20 °C. Use a fresh aliquot for each experiment and add to the samples at 1:500 dilution.
OneComp eBeads compensation beads	ThermoFisher	01-1111-42	Store at 4 °C, throughly vortex the tube before adding to the sample tube(s), keep on ice when in use.
PE-Cy7 rat anti mouse CD145	BD Pharmingen	552848	Store at 4 °C or keep on ice when in use. Sheild from light. Flow cytometry dilution - 1:100
Percoll pH8.5-9.5	Sigma	P1644	Store at 4 °C. To make 10 mL of Standard Isotonic Percoll (SIP): Use 9 mL of cold Percoll and 1 mL of cold 10× HBSS.
Phycoerythrin-conjugated microspheres	ThermoFisher	F13083	Store at 4 °C or keep on ice when in use.
β-Amyloid (1 - 42), HiLyte Fluor 488 - labeled, Human	AnaSpec	AS-60479-01	The final concentration of Ab fibrils is 200µM which is then diluted prior to use. Store at -20 °C. Prepare fresh working solution for each experiment.