流式细胞术方法在体外表征急性分离的成人小胶质细胞和脑巨噬细胞的吞噬特性

摘要

评估小胶质细胞和脑巨噬细胞的吞噬特性可以为分子分析研究提供有价值的功能维度。我们描述了一种经过验证的方案，该方案使用流式细胞术通过从小鼠模型中急性分离的小胶质细胞和脑巨噬细胞快速可靠地定量荧光微球和淀粉样蛋白 β 原纤维的吞噬作用。

摘要

小胶质细胞和浸润中枢神经系统 （CNS） 的巨噬细胞，统称为 CNS 单核吞噬细胞 （CNS-MP），在神经系统疾病（包括神经退行性疾病和中风）中起着核心作用。CNS-MPs 参与病理蛋白、碎片和神经元突触的吞噬清除，每种突触都有不同的潜在分子途径。表征这些吞噬特性可以提供功能读数，使用传统的流式细胞术、转录组学和蛋白质组学方法对小胶质细胞进行分子分析。小胶质细胞的吞噬分析依赖于小鼠新生儿小胶质细胞的显微镜观察和体外培养。前一种方法的采样有限，而后一种方法本质上不能很好地反映成人 CNS-MP 的真实体内状态。本文描述了通过流式细胞术对急性分离的小鼠 CNS-MPs 进行表型吞噬特性的优化方案。使用机械解离从成年小鼠脑中急性分离 CNS-MPs，然后进行密度梯度离心，与荧光微球或荧光 Aβ 原纤维孵育，洗涤，然后用针对表面标志物 （CD11b， CD45） 的抗体组标记。使用这种方法，可以比较脑驻留小胶质细胞与 CNS 浸润巨噬细胞的吞噬特性，然后评估衰老和疾病病理对这些吞噬表型的影响。这种快速方法还具有从死后或手术脑标本中急性分离的人 CNS-MPs 的功能表型的潜力。此外，可以通过抑制选定的吞噬途径来研究 CNS-MP 亚群吞噬作用的特异性机制。

引言

中枢神经系统 （CNS） 的先天免疫细胞主要由小胶质细胞和浸润性单核细胞/巨噬细胞组成，统称为 CNS 单核吞噬细胞 （CNS-MP）¹。CNS-MP 与神经退行性疾病有关，例如阿尔茨海默病 （AD）、神经炎症性疾病和中风 ^2,3,4。CNS-MP 与星形胶质细胞、周细胞和室管膜细胞一起具有吞噬功能 ^5,6。在稳态状态下，CNS-MPs 参与对局部微环境的持续监测，以及凋亡细胞碎片和蛋白质的吞噬清除，以及突触修剪以重塑神经元连接 7,8,9,10。在 AD 等神经退行性疾病中，CNS-MPs 采用不同的疾病相关分子和功能表型，这些表型可以发挥病理作用，包括清除聚集的淀粉样蛋白-β （Aβ） 和神经元元件，以及炎性细胞因子和因子释放，从而产生复杂的促炎、有害和抗炎、保护作用 11,12,13,14.CNS-MPs 对大颗粒、细胞碎片、蛋白质和其他感染颗粒的吞噬作用是由其表面表达的不同受体介导^{的 9}。这些吞噬途径的破坏可导致 Aβ 的清除缺陷和进行性积累，最终导致 AD 中的进行性神经元损伤 ^4,9。虽然使用转录组学和蛋白质组学方法对 CNS-MPs 进行分子分析的进展为神经系统疾病中 CNS-MPs 内的分子异质性提供了宝贵的见解^15,16，^但目前缺乏 CNS-MPs 及其亚群吞噬特性的功能表征。CNS-MPs 吞噬特性的功能表征可以补充分子分析策略，促进更好的功能表型分析，并有助于评估可以纠正疾病模型中吞噬作用缺陷的疗法的疗效¹⁷。

CNS-MPs 的传统吞噬作用检测包括孵育原代小胶质细胞以及荧光底物，如 Aβ 或乳胶/聚苯乙烯颗粒。然后使用免疫荧光显微镜研究吞噬作用作为荧光底物摄取的函数 18,19,20。众所周知，当 CNS-MPs 维持在长期培养物中时，可以显着改变其形态和转录谱^21,22。这阻碍了研究 CNS-MPs 在 CNS 中其代表状态下的吞噬特性。用于分析急性分离的活 CNS-MPs 的功能性流式细胞术测定可以提供吞噬特性的快速评估，并且可以比显微镜方法采样更大的 CNS-MPs^{库 9,23}。此外，流式细胞术消除了在培养物中维持 CNS-MPs 的需要，并提供了一个平台来研究 CNS-MPs 不同亚群的吞噬特性。本手稿描述了通过流式细胞术对急性分离的小鼠 CNS-MPs 进行表型吞噬特性的优化方案。使用流式细胞术调整吞噬作用测定允许 CNS-MPs 的吞噬表型与免疫表型相结合的快速多重分析，从而在单细胞分辨率下深入了解 CNS-MPs 内吞噬特性的异质性。

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研究方案

所有小鼠研究均在获得埃默里大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准后进行，并严格按照美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南进行。

1. 隔离当天的准备工作

1. 准备一个冰桶，以在整个分离过程中保持所有试剂、缓冲液和细胞悬液的低温。
2. 灌注前将一瓶 1× 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）（至少 1 L）在 4 °C 下放置 30 分钟至 1 小时，并在灌注和分离过程中将 1× PBS 保存在冰上。
3. 制备密度梯度介质的工作浓度（称为 35% SIP，参见 材料表）。
4. 在细胞分离之前，标记实验中使用的所有锥形和流式细胞仪管，以避免处理时间延迟。此外，在灌注前收集分离所需的所有其他用品，例如 40 μm 细胞过滤器、注射器和针头。

2. 成年小鼠小胶质细胞的急性分离

1. 通过将小鼠置于含有异氟醚 （5 mL） 的玻璃诱导室中麻醉成年小鼠，直到小鼠停止呼吸并且对后肢爪捏没有反应。
2. 使用 26 G 针头和 10 mL 注射器用 30 mL 冰冷的 1× PBS 进行心脏灌注，直到没有肉眼血。
3. 用手术剪刀将小鼠斩首。用小剪刀剪开皮肤，露出头骨。如前所述，在不损伤脑组织的情况下切除颅骨²⁴.立即取出大脑并转移到放置在 50 mL 锥形管顶部的无菌 40 μm 细胞过滤器中。
4. 使用 3 mL 注射器柱塞的背面将大脑推入过滤器，并以机械方式分离整个脑组织。在解离过程中，每次用 2 mL 冰冷的 1× PBS 间歇性清洗细胞过滤器和柱塞，以确保所有组织都通过过滤器。
5. 用柱塞刮擦细胞过滤器的底部，以将任何残留的悬浮液收集到锥形细胞中。用冰冷的 1× PBS 彻底冲洗细胞过滤器，然后将悬浮液倒入 50 mL 锥形管中。
   注：当串联处理多只动物时，将细胞悬液置于冰上直至进一步处理。
6. 加入冰冷的 1× PBS 使细胞悬液体积达到 30 mL，并在 4 °C 下以 800 × g 离心 5 分钟。
7. 在不干扰沉淀的情况下倒出上清液，然后用 10 mL 血清移液管将沉淀重悬于 6 mL 的 35% SIP 中。将细胞悬液 + 35% SIP 混合物转移到新的 15 mL 锥形管中，并在 15 °C 下以 800 × g 离心 25 分钟，无制动器。
   注意： 请特别小心，避免在重新悬浮过程中引入气泡。过多的气泡可能对细胞产量有害。
8. 小心地从离心机中取出 15 mL 锥形管，不要干扰各层，并吸出顶部浮动髓鞘层。
9. 使用 10 mL 血清移液管将细胞悬液 + 35% SIP 混合物转移到含有 30 mL 冰冷的 1× PBS 的新 50 mL 锥形管中，并在 4 °C 下以 800 × g 离心 5 分钟。 小心地倒出上清液，留下细胞沉淀和 500\u2012800 μL 1× PBS。
10. 用 p1000 移液器轻轻上下吹打，重新悬浮细胞沉淀，然后转移到 5 mL 圆底管中。向圆底管中加入 2 mL 冰冷的 1× PBS，并在 4 °C 下以 1,400 × g 离心 2 分钟。 快速倒出上清液，将含有 CNS-MPs 的细胞沉淀留在约 100 μL 的 1× PBS 中（图 1）。

3. 吞噬作用设置和流式细胞术染色

1. 将 20 μL（≈200,000 个细胞）的重悬 CNS-MPs 转移到新的 5 mL 圆底管中，并加入 80 μL 冰冷的 1× PBS。请勿向该试管中添加任何荧光底物或流式细胞术抗体。这些细胞用作阴性对照，用于测定流式细胞术分析中 CNS-MPs 的背景荧光。
2. 为了确定分离的 CNS-MP 的活力，使用基于胺的活/死染料（例如，Fixable Blue UV）。
   1. 将其余细胞沉淀重悬于 500 μL 1× PBS 中，并向除阴性对照外的每个样品管中加入 1 μL 重构染料。
   2. 轻轻涡旋，用箔纸盖住试管，并在室温下孵育 30 分钟。随后，向每个试管中加入 1 mL 1× PBS 并轻轻涡旋。
   3. 将细胞在 4 °C 下以 1,400 × g 离心 2 分钟。 快速倒出上清液，将细胞沉淀重悬于 100 μL 1× PBS 中。
      注：胺基染料将与细胞外 Aβ 原纤维结合，混淆吞噬作用的结果。其他活/死指示剂可能会干扰 Aβ 原纤维/微球的荧光。因此，建议仅在初步实验中使用活/死指示剂，以确定分离的 CNS-MPs 的活力。
3. 彻底涡旋含有 PE-聚苯乙烯微球的试管，并在流管中加入 2 μL（≈200 微球/细胞）到 100 μL 细胞悬液中，阴性对照除外。轻轻涡旋每个试管，以确保底物与细胞均匀分布，并将圆底管置于 37 °C 和 5% CO₂ 的无菌加湿培养箱中 30 分钟。
   1. 轻轻涡旋并孵育阴性对照管，以确保阳性和阴性样品之间的实验条件相似。
      注：如果使用 Aβ 原纤维代替 PE 微球，请按照前面⁹ 的说明制备荧光 HiLyte488 Aβ 原纤维。Aβ 原纤维的最终浓度为 200 μM，然后稀释以在荧光 Aβ 单体的 PBS 中制备新鲜的 20 μM 原液。将 12.5 μL 的 20 μM Aβ 储备单体添加到每个含有分离细胞的试管中。
4. 从培养箱中取出细胞，向每个试管中加入 1 mL 1× PBS，然后轻轻涡旋。将细胞在 4 °C 下以 1,400 × g 离心 2 分钟，然后快速倒出上清液。用 1 mL 1× PBS 重复洗涤，以 1,400 × g 离心 2 分钟，倒出上清液，然后将细胞沉淀重悬于 100 μL 1× PBS 中。
   注意：每次旋转后，将细胞保持在冰上以抑制持续的吞噬摄取非常重要。
5. 涡旋流式细胞术抗体，并在微量离心机中离心 10 秒。向每个细胞悬液管中加入 1 μL CD11b-APC/Cy7 和 CD45-PE/Cy7 用于 Aβ 吞噬作用测定，或 CD45-FITC 用于 PE 微球吞噬作用。轻轻涡旋每个试管，并在室温下避光孵育 30 分钟。
   注：用户还可以包括一个单独的试管，其中包含有效的吞噬细胞，例如培养的 BV2 小胶质细胞或腹膜巨噬细胞作为阳性对照，并用 PE 微球和流式细胞术抗体处理它们如上所述。来自该样品的数据可用于定义初步实验中表示真正吞噬作用的阳性对照。
6. 当细胞孵育时，使用四个圆底 5 mL 流式管设置补偿管。彻底涡旋补偿珠，并向每个试管中加入 1 滴。将 1 μL CD11b-APC/Cy7 添加到第一管中，将 CD45-FITC 添加到第二管中。在第三管中加入 1 μL PE-聚苯乙烯，并将未染色的补偿珠保留在第四管中。使用这第四根管作为阴性对照，在流式细胞仪上设置补偿面板。
   注：当使用 Aβ 原纤维研究吞噬作用时，将 CD45-PECy7 添加到第二根试管中，而不是 CD45-FITC。将 1 μL 单独的 FITC 标记流式细胞术抗体或 FITC 二抗（任何物种）添加到第三个补偿管中。这很重要，因为磁珠不能与 Aβ 原纤维结合，并且在洗涤补偿管时会被冲走。
7. 让补偿微珠与其各自的抗体孵育至少 10 分钟。孵育后，向每个试管中加入 1 mL 1× PBS，在 4 °C 下以 1,400 x g 离心 2 分钟，然后快速倒出上清液。将补偿管放在冰上，并用箔纸覆盖它们，直到流式细胞术。
8. 与流式细胞术抗体孵育后，用 1 mL 1× PBS 洗涤染色细胞。轻轻涡旋并在 4 °C 下以 1,400 × g 离心细胞 2 分钟。 快速倒出上清液，然后用 1 mL 1× PBS 重复洗涤。离心后，倒出上清液，将细胞沉淀重悬于 100 μL 1× PBS 中。
9. 将样品管放在冰上并用铝箔覆盖，直到流式细胞术。
   注：在整个实验过程中使用 1× 不含 Ca²⁺/Mg²⁺ 的 PBS （pH 7.0） 作为流动缓冲液。确保排除流式缓冲液中的胎牛血清 （FBS），以避免可能的小胶质细胞活化。

4. 流式细胞术和分析

1. 仪器设置和补偿
   注：本手稿中的实验是在具有紫外、紫色、蓝色、黄绿色和红色激光的流式细胞仪上进行的。该实验也适用于仅使用蓝色、黄绿色和红色激光的三激光流式细胞仪。用户在作仪器之前需要接受正式培训。
   1. 重新填充流式鞘缓冲液槽并打开细胞仪。用含有 ddH₂O 的 5 mL 圆底流流管“灌注”细胞仪。在连接到流式细胞仪的计算机上登录分析软件。创建一个“实验”并选择 FSC、SSC、FITC、PECy7 和 APC-Cy7 作为参数。如果使用 PE 微球，请在参数面板中选择 PE 而不是 PECy7。
   2. 创建适当的薪酬面板。
      注意：在我们的实验中，补偿珠的 FSC/SSC 电压通常约为 350/280，而 CNS-MPs 的 FSC/SSC 电压约为 320/260。这些值在任意两种不同的细胞仪之间可能有所不同，需要在实际实验之前进行校准。
   3. 用 500 μL 1× PBS 重新配制每个补偿管和细胞悬液管，短暂涡旋，然后置于冰上。运行阴性对照/未染色的微珠管以设置适当的电压，使每个荧光团直方图上的峰低于 10²。运行其他单色补偿管以识别其不同的阳性峰。
      注意：每个荧光团的正峰和负峰之间应至少有一半的对数（以 10 为基数）差异。
   4. 记录每个补偿管的 5000 个事件，以便计算机自动计算补偿设置。将补偿设置链接到当前实验²⁵。
   5. 在 sample 选项卡下创建一个新的 “tube”。轻轻涡旋并运行含有未染色 CNS-MPs 的阴性对照管。调整前向和侧向散射电压以捕获感兴趣的群体。记录实时 CNS-MP 上的事件和子门，如下所述。
   6. 捕获所有后续管中的事件并将其记录为单独的文件，保持参数和电压一致。在流式细胞仪上运行每个试管之前，轻轻涡旋它们。
2. 吞噬作用的门控策略和测量
   1. 绘制初始单核门以捕获所有 CNS-MP。这些活的单核细胞必须在下图中设门，以仅包括单个细胞，不包括对联和三联细胞。
   2. 在显示 CD11b 和 CD45 荧光团的后续图表上投影门控单个活 CNS-MPs 群体。
      注意：脑驻留小胶质细胞通常是 CD11b⁺CD45^中间体，而浸润巨噬细胞的 CD11b⁺CD45^是高水平。面板中可能包括其他标志物，例如 Ly6c，以进一步可靠地将炎性单核细胞（Ly6c^高 和 CD45^高）与小胶质细胞（Ly6c^低 CD45^中间体）分开。
   3. 应用适当的门以进一步研究各自种群的吞噬作用，如图 2F 所示。
      注意：CNS-MPs 中的吞噬作用是作为其 Hilyte488/Alexa488 （Aβ） 或 PE（微球）荧光摄取的函数来测量的。它们各自直方图上明显的正峰表明 CNS-MPs 已经吞噬了底物。吞噬物质的量与荧光的强度成正比。因此，存在多个峰必须解释为更高的吞噬作用。这些随后可以通过免疫组化来确认。
   4. 在流式细胞仪上记录所有样品管后，以 .fcs 格式导出数据文件以供进一步分析。
3. 统计数据分析
   1. 使用任何流式细胞术分析软件以及电子表格和统计分析软件进行所有数据分析。
   2. 将 .fcs 文件添加到分析软件中，然后双击第一个文件。显示所有记录的
      事件将出现。遵循如图 2 所示的类似门控策略，随后对单个活的单核细胞进行门控，并研究特定群体的吞噬作用，例如 CD11b ⁺ CD45^中间小胶质细胞（图 2H）。
      注：吞噬指数是根据内化荧光 Aβ 原纤维或 ≥1 微球的细胞比例评估的。如前所述，低水平吞噬作用是至少 1 个微球的摄取，高水平吞噬作用是 >1 个微球的摄取 ^8,9。根据先前的实验，细胞松弛素 D 抑制肌动蛋白依赖性过程完全抑制 >1 珠子摄取，部分抑制 1 珠子摄取⁹ 以及完全抑制 Aβ 摄取，证实肌动蛋白依赖性吞噬摄取而不是被动结合到细胞表面。免疫细胞化学还证实，微球测定中的每个连续峰都代表吞噬的微珠数量的幺正增加 ^8,9。

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结果

为了举例说明急性分离的 CNS-MPs 吞噬吸收微球和 Aβ42 原纤维的典型结果，在短暂性大脑中动脉闭塞 （MCAO） 后从同侧半球获得了急性分离的 ^CNS-MPs8。有关 MCAO 模型中 CNS-MPs 吞噬特性的详细信息，请参阅以前的出版物⁸。简而言之，在 72 小时恢复后，使用机械解离从新鲜大脑中急性分离 CNS-MPs，然后进行密度梯度离心，并与荧光微球或 Aβ...

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讨论

流式细胞术是一种可以使用荧光标记探针（通常是抗体）来标记这些目标标记物来检测细胞表面或细胞内区室中目标蛋白质或标记物表达的技术。细胞表面或细胞内抗体通常与具有独特发射光谱的激光可激发荧光染料偶联。根据这些标志物的表达模式，用这些抗体孵育的细胞可以分为多个亚群。CNS-MPs 主要包含小胶质细胞和 CNS 浸润的单核细胞/巨噬细胞。小胶质细胞和 CNS...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Hank's balanced salt solution(10x HBSS)	ThermoFisher	14065056	Store at 4 °C. Used to make SIP as described in the protocol
1x Hank's balanced salt solution(1x HBSS)	ThermoFisher	14175095	Store at 4 °C. Used to make 35% SIP as described in the protocol
1x Phosphate Buffered Saline (PBS)			https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/western-blotting/buffers-recipes/10x-phosphate-buffered-saline.html Store 10xPBS at Room temperature. Prepare fresh 1xPBS by diluting one part 10xPBS to nine parts of MilliQ dH20 and store it at 4 °C for an hour before use. Make sure the pH of the 1xPBS is 7.0 before refridgeration.
35% SIP			To make 20 mL of 35% SIP, use 7 mL of SIP and 13 mL of ice-cold 1× HBSS. Keep on ice until further processing
APC-Cy7 rat anti-CD11b	BD Pharmingen	557657	Store at 4 °C or keep on ice when in use. Sheild from light. Flow cytometry dilution - 1:100
FITC rat anti mouse CD145	BD Pharmingen	553080	Store at 4 °C or keep on ice when in use. Sheild from light. Flow cytometry dilution - 1:100
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	ThermoFisher	L34961	Store at -20 °C. Add 50ul of DMSO to one tube of the dye, vortex throughly and centrifuge at maximun speed for 1 min. Make 10µL aliquots and store them at -20 °C. Use a fresh aliquot for each experiment and add to the samples at 1:500 dilution.
OneComp eBeads compensation beads	ThermoFisher	01-1111-42	Store at 4 °C, throughly vortex the tube before adding to the sample tube(s), keep on ice when in use.
PE-Cy7 rat anti mouse CD145	BD Pharmingen	552848	Store at 4 °C or keep on ice when in use. Sheild from light. Flow cytometry dilution - 1:100
Percoll pH8.5-9.5	Sigma	P1644	Store at 4 °C. To make 10 mL of Standard Isotonic Percoll (SIP): Use 9 mL of cold Percoll and 1 mL of cold 10× HBSS.
Phycoerythrin-conjugated microspheres	ThermoFisher	F13083	Store at 4 °C or keep on ice when in use.
β-Amyloid (1 - 42), HiLyte Fluor 488 - labeled, Human	AnaSpec	AS-60479-01	The final concentration of Ab fibrils is 200µM which is then diluted prior to use. Store at -20 °C. Prepare fresh working solution for each experiment.