Enfoque de citometría de flujo para caracterizar las propiedades fagocíticas de microglía adulta y macrófagos cerebrales aislados de forma aguda in vitro

Resumen

La evaluación de las propiedades fagocíticas de la microglía y los macrófagos cerebrales puede proporcionar una valiosa dimensión funcional a los estudios de perfiles moleculares. Describimos un protocolo validado que utiliza la citometría de flujo para cuantificar de forma rápida y fiable la fagocitosis de microesferas fluorescentes y fibrillas de beta amiloide mediante microglía y macrófagos cerebrales aislados agudamente a partir de modelos de ratón.

Resumen

Los macrófagos infiltrantes de la microglía y el sistema nervioso central (SNC), llamados colectivamente fagocitos mononucleares del SNC (CNS-MP), desempeñan un papel central en las enfermedades neurológicas, como la neurodegeneración y el accidente cerebrovascular. Los SNC-MP están implicados en la eliminación fagocítica de proteínas patológicas, desechos y sinapsis neuronales, cada una con distintas vías moleculares subyacentes. La caracterización de estas propiedades fagocíticas puede proporcionar una lectura funcional que complementa el perfil molecular de la microglía utilizando enfoques tradicionales de citometría de flujo, transcriptómica y proteómica. El perfil fagocítico de la microglía se ha basado en la visualización microscópica y en cultivos in vitro de la microglía neonatal de ratón. El primer enfoque adolece de un muestreo limitado, mientras que el segundo es inherentemente pobremente reflexivo del verdadero estado in vivo de los SNC-MP adultos. En este artículo se describen los protocolos optimizados para las propiedades fagocíticas del fenotipo de los SNC-MP de ratón aislados de forma aguda mediante citometría de flujo. Los SNC-MP se aíslan de forma aguda del cerebro de un ratón adulto mediante disociación mecánica seguida de centrifugación en gradiente de densidad, se incuban con microesferas fluorescentes o fibrillas fluorescentes de Aβ, se lavan y luego se marcan con paneles de anticuerpos contra marcadores de superficie (CD11b, CD45). Con este enfoque, es posible comparar las propiedades fagocíticas de la microglía residente en el cerebro con los macrófagos infiltrantes del SNC y luego evaluar el efecto del envejecimiento y la patología de la enfermedad en estos fenotipos fagocíticos. Este método rápido también tiene potencial para el fenotipo funcional de SNC-MP humanos aislados de forma aguda a partir de muestras de cerebro post-mortem o quirúrgicas. Además, se pueden investigar mecanismos específicos de fagocitosis por subconjuntos de SNC-MP mediante la inhibición de vías fagocíticas seleccionadas.

Introducción

Las células inmunitarias innatas del sistema nervioso central (SNC) están compuestas predominantemente por microglía y monocitos/macrófagos infiltrantes, denominados juntos fagocitos mononucleares del SNC (SNC-MP)¹. Los SNC-MP están implicados en enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer (EA), los trastornos neuroinflamatorios y el accidente cerebrovascular ^2,3,4. Las MP-SNC, junto con los astrocitos, pericitos y células ependimarias, tienen funciones fagocíticas ^5,6. En su estado homeostático, los SNC-MP están involucrados en la vigilancia constante del microambiente local, junto con la eliminación fagocítica de restos de células apoptóticas y proteínas, y la poda sináptica para remodelar las conexiones neuronales 7,8,9,10. En enfermedades neurodegenerativas como la EA, los SNC-MP adoptan distintos fenotipos moleculares y funcionales asociados a la enfermedad que pueden desempeñar funciones patológicas, como la eliminación de los elementos beta-amiloide (Aβ) y neuronales agregados, así como la liberación de citocinas y factores inflamatorios, lo que da lugar a complejas funciones proinflamatorias, perjudiciales y antiinflamatorias y protectoras 11,12,13,14. La fagocitosis de macropartículas, restos celulares, proteínas y otras partículas infecciosas por SNC-MP está mediada por distintos receptores expresados en su superficie⁹. La interrupción de estas vías fagocíticas puede conducir a un aclaramiento defectuoso y a una acumulación progresiva de Aβ que, en última instancia, conduce a un daño neuronal progresivo en la EA ^4,9. Si bien los avances en el perfil molecular de los SNC-MP utilizando enfoques transcriptómicos y proteómicos han proporcionado información invaluable sobre la heterogeneidad molecular dentro de los SNC-MP en enfermedades neurológicas^15,16, actualmente se carece de una caracterización funcional de las propiedades fagocíticas de los SN-MP y sus subconjuntos. La caracterización funcional de las propiedades fagocíticas de los SNC-MP puede complementar las estrategias de perfil molecular, facilitar un mejor fenotipado funcional y ayudar a evaluar la eficacia de las terapias que pueden rectificar la fagocitosis defectuosa en modelos de enfermedad¹⁷.

Los ensayos tradicionales de fagocitosis para SNC-MP incluyen la incubación de microglía primaria junto con sustratos fluorescentes como Aβ o partículas de látex/poliestireno. A continuación, se estudia la fagocitosis en función de la captación del sustrato fluorescente mediante microscopía de inmunofluorescencia 18,19,20. Está bien establecido que los SNC-MP, cuando se mantienen en cultivos largos, pueden cambiar drásticamente su morfología y perfiles transcripcionales ^21,22. Esto dificulta el estudio de las propiedades fagocíticas de los SNC-MP en su estado representativo en el SNC. Un ensayo de citometría de flujo funcional para perfilar SNC-MP vivos aislados agudamente puede proporcionar una evaluación rápida de las propiedades fagocíticas y puede muestrear un grupo mucho mayor de SNC-MP que los enfoques de microscopía ^9,23. Además, la citometría de flujo elimina la necesidad de mantener los SNC-MP en cultivo y proporciona una plataforma para estudiar las propiedades fagocitóticas en diferentes subpoblaciones de SNC-MPs. Este manuscrito describe protocolos optimizados para las propiedades fagocíticas del fenotipo de SNC-MP de ratón aislados agudamente mediante citometría de flujo. La adaptación de los ensayos de fagocitosis mediante citometría de flujo permite una rápida multiplexación del fenotipo fagocítico de los SNC-MP junto con el fenotipado inmunitario, lo que proporciona información sobre la heterogeneidad de las propiedades fagocíticas dentro de los SNC-MP a la resolución de una sola célula.

Protocolo

Todos los estudios con ratones se llevaron a cabo después de obtener la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Emory, y en estricta conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud.

1. Preparación el día del aislamiento

1. Prepare una cubeta de hielo para mantener fríos todos los reactivos, tampones y suspensiones celulares durante todo el procedimiento de aislamiento.
2. Coloque el frasco de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1× (al menos 1 L) a 4 °C durante 30 min a 1 h antes de la perfusión y mantenga 1× PBS en hielo durante el procedimiento de perfusión y aislamiento.
3. Prepare la concentración de trabajo del medio de gradiente de densidad (denominado 35% SIP, consulte la Tabla de Materiales).
4. Etiquete todos los tubos cónicos y de citometría de flujo utilizados en el experimento antes del aislamiento celular para evitar retrasos en los tiempos de procesamiento. Además, reúna todos los demás suministros necesarios para el aislamiento antes de la perfusión, como filtros de células de 40 μm, jeringas y agujas.

2. Aislamiento agudo de la microglía de ratón adulto

1. Anestesiar a un ratón adulto colocando al ratón en una cámara de inducción de vidrio con isoflurano (5 mL) hasta que el ratón deje de respirar y no responda al pellizco de la pata de la extremidad trasera.
2. Utilice una aguja de 26 g y una jeringa de 10 ml para realizar la perfusión cardíaca con 30 ml de PBS 1× frío hasta que no haya sangre visual.
3. Decapita al ratón con unas tijeras quirúrgicas. Use tijeras pequeñas para cortar la piel, exponiendo el cráneo. Extirpar el cráneo sin dañar el tejido cerebral como se describe²⁴. Extraiga el cerebro inmediatamente y transfiéralo a un filtro de células estéril de 40 μm colocado encima de un tubo cónico de 50 mL.
4. Use la parte posterior del émbolo de una jeringa de 3 ml para empujar el cerebro a través del colador y disociar mecánicamente todo el tejido cerebral. Lave el filtro de células y el émbolo de forma intermitente durante la disociación con 2 ml de 1× PBS helado cada vez para asegurarse de que todo el tejido pase a través del colador.
5. Raspe la parte inferior del filtro de celdas con el émbolo para recoger cualquier suspensión residual en el cónico. Enjuague completamente el filtro de celdas con 1× PBS helado y vierta la suspensión en el tubo cónico de 50 ml.
   NOTA: Cuando procese varios animales en serie, coloque las suspensiones de celdas en hielo hasta el procesamiento posterior.
6. Añadir 1× PBS helado para llevar el volumen de la suspensión celular a 30 mL y centrifugar a 800 × g durante 5 min a 4 °C.
7. Vierta el sobrenadante sin alterar el pellet y vuelva a suspender el pellet en 6 mL de SIP al 35% con una pipeta serológica de 10 mL. Transfiera la suspensión de celdas + mezcla SIP al 35% a un nuevo tubo cónico de 15 mL y centrifugue a 800 × g durante 25 min a 15 °C sin freno.
   PRECAUCIÓN: Tenga especial cuidado para evitar la introducción de burbujas durante la resuspensión. Las burbujas excesivas pueden ser perjudiciales para el rendimiento de las células.
8. Retire con cuidado el tubo cónico de 15 ml de la centrífuga sin alterar las capas y aspire la capa superior de mielina flotante.
9. Transfiera la suspensión celular + mezcla SIP al 35% utilizando una pipeta serológica de 10 mL a un nuevo tubo cónico de 50 mL que contenga 30 mL de 1× PBS helado y centrifugar a 800 × g durante 5 min a 4 °C. Vierta con cuidado el sobrenadante, dejando atrás el pellet de celda junto con 500\u2012800 μL de PBS de 1×.
10. Vuelva a suspender el pellet de celda pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta p1000 y transfiéralo a un tubo de fondo redondo de 5 mL. Añadir 2 ml de 1× PBS helado al tubo de fondo redondo y centrifugar a 1.400 × g durante 2 min a 4 °C. Vierta rápidamente el sobrenadante, dejando el pellet de la célula que contiene SNC-MP en aproximadamente 100 μL de 1× PBS (Figura 1).

3. Configuración de fagocitosis y tinción por citometría de flujo

1. Transfiera 20 μL (≈200.000 células) de los SNC-MP resuspendidos a un tubo inferior redondo nuevo de 5 mL y agregue 80 μL de 1× PBS helado. No agregue sustratos fluorescentes ni anticuerpos de citometría de flujo a este tubo. Estas células sirven como control negativo para determinar la fluorescencia de fondo de los SNC-MP para los análisis de citometría de flujo.
2. Para establecer la viabilidad de los SNC-MP aislados, utilice tintes vivos/muertos a base de aminas (p. ej., Fixable Blue UV).
   1. Vuelva a suspender el resto del pellet celular en 500 μL de PBS al 1× y agregue 1 μL del colorante reconstituido a cada tubo de muestra, excepto al control negativo.
   2. Cubra los tubos con papel de aluminio e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. Posteriormente, agregue 1 mL de PBS de 1× a cada tubo y haga un vórtice suave.
   3. Centrifugar las células a 1.400 × g durante 2 min a 4 °C. Vierta rápidamente el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de celda en 100 μL de 1× PBS.
      NOTA: Los tintes a base de aminas se unirán a las fibrillas extracelulares de Aβ, confundiendo los resultados de la fagocitosis. Otros indicadores vivos/muertos podrían interferir con la fluorescencia de fibrillas/microesferas de Aβ. Por lo tanto, se aconseja utilizar el indicador Vivo/Muerto sólo en experimentos preliminares para establecer la viabilidad de los CNS-MP aislados.
3. Agite completamente el tubo que contiene microesferas de PE-poliestireno y agregue 2 μL (≈200 microesferas/celda) a 100 μL de suspensión celular en tubos de flujo, excepto para el control negativo. Agite suavemente cada tubo para asegurar una distribución uniforme del sustrato con las células y coloque los tubos de fondo redondo en una incubadora humidificada estéril durante 30 minutos a 37 °C con 5% de CO₂.
   1. Agite suavemente el tubo de control negativo para garantizar condiciones experimentales similares entre muestras positivas y negativas.
      NOTA: Si utiliza fibrillas de Aβ en lugar de microesferas de PE, prepare fibrillas fluorescentes de HiLyte488 Aβ como se describió anteriormente⁹. La concentración final de fibrillas de Aβ es de 200 μM, que luego se diluye para preparar un caldo fresco de 20 μM en PBS de monómeros fluorescentes de Aβ. Añadir 12,5 μL de los 20 μM de monómeros Aβ en stock a cada tubo que contenga células aisladas.
4. Retire las células de la incubadora y agregue 1 ml de 1× PBS a cada tubo y vórtice suave. Centrifugar las células a 1.400 × g durante 2 min a 4 °C y verter rápidamente el sobrenadante. Repita el lavado con 1 mL 1× PBS, centrifugue a 1.400 × g durante 2 min, vierta el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de celda en 100 μL de 1× PBS.
   NOTA: Después de cada centrifugado, es importante mantener las células en hielo para inhibir la absorción fagocítica en curso.
5. Agitar los anticuerpos de citometría de flujo y centrifugarlos en una microcentrífuga durante 10 s. A cada tubo de suspensión celular agregue 1 μL de CD11b-APC/Cy7 y CD45-PE/Cy7 para el ensayo de fagocitosis Aβ, o CD45-FITC para la fagocitosis de microesferas PE. Agite suavemente cada tubo e incube en la oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente.
   NOTA: Los usuarios también pueden incluir un tubo separado que contenga células fagocíticas potentes, como microglía BV2 cultivada o macrófagos peritoneales, como control positivo y tratarlas con microesferas de PE y anticuerpos de citometría de flujo como se describe anteriormente. Los datos de esta muestra se pueden utilizar para definir el control positivo que denota fagocitosis verdadera en experimentos preliminares.
6. Mientras las células están en incubación, coloque tubos de compensación utilizando cuatro tubos de flujo de 5 ml de fondo redondo. Agite completamente las perlas de compensación y agregue 1 gota a cada tubo. Añada 1 μL de CD11b-APC/Cy7 al primer tubo y CD45-FITC al segundo tubo. Agregue 1 μL de PE-poliestireno al tercer tubo y mantenga las perlas de compensación sin manchar en el cuarto tubo. Utilice este cuarto tubo como control negativo para configurar un panel de compensación en el citómetro de flujo.
   NOTA: Cuando se utilicen fibrillas de Aβ para estudiar la fagocitosis, agregue CD45-PECy7 al segundo tubo en lugar de CD45-FITC. Agregue 1 μL de anticuerpo de citometría de flujo marcado con FITC por separado o anticuerpo secundario de FITC (cualquier especie) al tercer tubo de compensación. Esto es importante ya que las perlas no pueden unirse a las fibrillas de Aβ y se lavarán al lavar los tubos de compensación.
7. Deje que las perlas de compensación se incuben con sus respectivos anticuerpos durante al menos 10 minutos. Después de la incubación, agregue 1 ml de PBS de 1× a cada tubo, centrifugue a 1.400 x g durante 2 minutos a 4 °C y vierta rápidamente el sobrenadante. Colocar los tubos de compensación sobre hielo y cubrirlos con la lámina hasta la citometría de flujo.
8. Después de la incubación con anticuerpos de citometría de flujo, lavar las células teñidas con 1 mL de PBS al 1×. Agitar suavemente y centrifugar las células a 1.400 × g durante 2 min a 4 °C. Vierta rápidamente el sobrenadante y repita el lavado con 1 mL 1× PBS. Después de la centrifugación, vierta el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de celda en 100 μL de 1× PBS.
9. Coloque los tubos de muestra sobre hielo y cúbralos con el papel de aluminio hasta la citometría de flujo.
   NOTA: Utilice 1× PBS (pH 7.0) sin Ca²⁺/Mg²⁺ como tampón de flujo durante todo el experimento. Asegúrese de excluir el suero fetal bovino (FBS) en el tampón de flujo para evitar una posible activación microglial.

4. Citometría de flujo y análisis

1. Configuración y compensación de instrumentos
   NOTA: Los experimentos de este manuscrito se realizaron en un citómetro de flujo con láseres ultravioleta, violeta, azul, amarillo-verde y rojo. Este experimento también se puede adaptar a citómetros de flujo de tres láseres con láseres azul, amarillo-verde y rojo solamente. Los usuarios deben someterse a una capacitación formal antes de manejar el instrumento.
   1. Vuelva a llenar el tanque de compensación de la vaina de flujo y encienda el citómetro. "Cebar" el citómetro con un tubo de flujo de fondo redondo de 5 mL que contenga ddH₂O. Inicie sesión en el software de análisis en la computadora conectada al citómetro de flujo. Cree un "experimento" y seleccione FSC, SSC, FITC, PECy7 y APC-Cy7 como parámetros. Si utiliza microesferas de PE, seleccione PE en lugar de PECy7 en el panel de parámetros.
   2. Cree un panel de compensación adecuado.
      NOTA: En nuestros experimentos, por lo general, los voltajes FSC / SSC para los cordones de compensación son de alrededor de 350/280, mientras que los voltajes FSC / SSC para CNS-MP son de alrededor de 320/260. Estos valores pueden variar entre dos citómetros diferentes y deben calibrarse antes del experimento real.
   3. Reconstituya cada tubo de compensación y suspensión de celdas con 500 μL de 1× PBS, brevemente en vórtice y colóquelo en hielo. Ejecute el tubo de perlas de control negativo/sin teñir para establecer los voltajes apropiados de modo que el pico en cada histograma de fluoróforos esté por debajo de 10². Ejecute los otros tubos de compensación de un solo color para identificar sus picos positivos distintivos.
      NOTA: Debe haber al menos medio logaritmo (base 10) de diferencia entre los picos positivos y negativos de cada fluoróforo.
   4. Registre 5000 eventos de cada tubo de compensación para permitir que la computadora calcule automáticamente la configuración de compensación. Vincule la configuración de compensación al experimento actual²⁵.
   5. Cree un nuevo "tubo" en la pestaña de muestra. Realice un vórtice suave y ejecute el tubo de control negativo que contiene CNS-MP sin teñir. Ajuste los voltajes de dispersión frontal y lateral para capturar la población de interés. Registre los eventos y la subpuerta en los CNS-MP en vivo como se menciona a continuación.
   6. Capture y registre eventos de todos los tubos posteriores como archivos separados, manteniendo los parámetros y voltajes consistentes. Agite suavemente cada tubo antes de pasarlos por el citómetro de flujo.
2. Estrategia de compuerta y medición de la fagocitosis
   1. Dibuje una puerta mononuclear inicial para capturar todos los CNS-MP. Estas células mononucleares vivas deben estar controladas en el siguiente gráfico para incluir sólo células individuales, excluyendo las coplas y los tripletes.
   2. Proyecte la población de SNC-MPs en vivo y única cerrada en un gráfico posterior que muestre los fluoróforos CD11b y CD45.
      NOTA: La microglía residente en el cerebro suele ser CD11b⁺CD45^intermedia, mientras que los macrófagos infiltrantes tienen^{un nivel alto} de CD11b⁺CD45. Es posible que se incluyan marcadores adicionales como Ly6c en el panel para separar con mayor confianza los monocitos inflamatorios (Ly6c^alto y CD45^alto) de la microglía (Ly6c^bajo,^{CD45 intermedio}).
   3. Aplique las puertas apropiadas para estudiar más a fondo la fagocitosis en las poblaciones respectivas, como se muestra en la Figura 2F.
      NOTA: La fagocitosis en los SNC-MP se mide en función de su captación de fluorescencia de Hilyte488/Alexa488 (Aβ) o PE (microesfera). Un pico positivo distinto en sus respectivos histogramas indica que los SNC-MP han fagocitado el sustrato. La cantidad de material fagocitado es directamente proporcional a la intensidad de la fluorescencia. Por lo tanto, la presencia de múltiples picos debe interpretarse como una fagocitosis superior. Estos pueden ser confirmados posteriormente por inmunohistoquímica.
   4. Después de registrar todos los tubos de muestra en el citómetro de flujo, exporte los archivos de datos en formato .fcs para su posterior análisis.
3. Análisis estadístico de datos
   1. Utilice cualquier software de análisis de citometría de flujo junto con hojas de cálculo y software de análisis estadístico para todos los análisis de datos.
   2. Agregue los archivos .fcs al software de análisis y haga doble clic en el primer archivo. Un gráfico que muestra todos los datos registrados
      aparecerán eventos. Siga una estrategia de activación similar a la que se muestra en la Figura 2 para detectar posteriormente células mononucleares vivas únicas y estudiar la fagocitosis en poblaciones específicas, por ejemplo, células microgliales^intermedias CD11b⁺CD45 (Figura 2H).
      NOTA: El índice fagocítico se evalúa en función de la proporción de células que internalizan fibrillas fluorescentes de Aβ o microesferas ≥1. Como se definió anteriormente, la fagocitosis de bajo nivel es la absorción de al menos 1 microesfera y la fagocitosis de alto nivel es la absorción de >1 perlas ^8,9. Sobre la base de experimentos previos, la inhibición de los procesos dependientes de actina por parte de la citocalasina D inhibe completamente la absorción de >1 perlas e inhibe parcialmente la absorción de 1 perla⁹, así como inhibe completamente la absorción de Aβ, lo que confirma la absorción fagocítica dependiente de actina en lugar de la unión pasiva a la superficie celular. La inmunocitoquímica también confirma que cada pico secuencial en el ensayo de microesferas es representativo de un aumento unitario en el número de perlas fagocitadas ^8,9.

Resultados

Para ejemplificar los resultados típicos de la absorción fagocítica de microesferas y fibrillas Aβ42 por SNC-MP agudamente aisladas, se obtuvieron SNC-MP agudamente aisladas del hemisferio ipsilateral después de una oclusión arterial cerebral media transitoria (OCM)⁸. Para obtener detalles sobre las propiedades fagocíticas de los SNC-MP en el modelo MCAO, consulte las publicaciones anteriores⁸. Brevemente, después de una recuperaci?...

Discusión

La citometría de flujo es una técnica que puede detectar la expresión de proteínas o marcadores de interés en la superficie celular o en compartimentos intracelulares utilizando sondas marcadas con fluorescencia (generalmente anticuerpos) para marcar estos marcadores de interés. Los anticuerpos intracelulares o de superficie celular generalmente se conjugan con fluorocromos excitables por láser que tienen espectros de emisión únicos. Las células incubadas con estos anticuerpos ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Hank's balanced salt solution(10x HBSS)	ThermoFisher	14065056	Store at 4 °C. Used to make SIP as described in the protocol
1x Hank's balanced salt solution(1x HBSS)	ThermoFisher	14175095	Store at 4 °C. Used to make 35% SIP as described in the protocol
1x Phosphate Buffered Saline (PBS)			https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/western-blotting/buffers-recipes/10x-phosphate-buffered-saline.html Store 10xPBS at Room temperature. Prepare fresh 1xPBS by diluting one part 10xPBS to nine parts of MilliQ dH20 and store it at 4 °C for an hour before use. Make sure the pH of the 1xPBS is 7.0 before refridgeration.
35% SIP			To make 20 mL of 35% SIP, use 7 mL of SIP and 13 mL of ice-cold 1× HBSS. Keep on ice until further processing
APC-Cy7 rat anti-CD11b	BD Pharmingen	557657	Store at 4 °C or keep on ice when in use. Sheild from light. Flow cytometry dilution - 1:100
FITC rat anti mouse CD145	BD Pharmingen	553080	Store at 4 °C or keep on ice when in use. Sheild from light. Flow cytometry dilution - 1:100
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	ThermoFisher	L34961	Store at -20 °C. Add 50ul of DMSO to one tube of the dye, vortex throughly and centrifuge at maximun speed for 1 min. Make 10µL aliquots and store them at -20 °C. Use a fresh aliquot for each experiment and add to the samples at 1:500 dilution.
OneComp eBeads compensation beads	ThermoFisher	01-1111-42	Store at 4 °C, throughly vortex the tube before adding to the sample tube(s), keep on ice when in use.
PE-Cy7 rat anti mouse CD145	BD Pharmingen	552848	Store at 4 °C or keep on ice when in use. Sheild from light. Flow cytometry dilution - 1:100
Percoll pH8.5-9.5	Sigma	P1644	Store at 4 °C. To make 10 mL of Standard Isotonic Percoll (SIP): Use 9 mL of cold Percoll and 1 mL of cold 10× HBSS.
Phycoerythrin-conjugated microspheres	ThermoFisher	F13083	Store at 4 °C or keep on ice when in use.
β-Amyloid (1 - 42), HiLyte Fluor 488 - labeled, Human	AnaSpec	AS-60479-01	The final concentration of Ab fibrils is 200µM which is then diluted prior to use. Store at -20 °C. Prepare fresh working solution for each experiment.